Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en la actividad enzimática de acrosina en espermatozoides refrigerados de perro a través de dos métodos de evaluación: digestión de gelatina en placa y la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE) a través de espectrofotometría. La obtención de semen se realizó a 4 perros adultos sanos, mediante estimulación digital del pene, utilizando sólo la fracción espermática de cada eyaculado. El volumen, la motilidad y la concentración espermática se evaluaron de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. El trabajo se realizó con semen fresco (control) y semen refrigerado proveniente de los mismos machos. Las muestras obtenidas fueron incubadas a temperatura ambiente con medio Fert Talp durante diferentes tiempos de capacitación (0, 1, 2 y 3 horas), para inducir la capacitación. Luego de cada tiempo de capacitación se evaluó la actividad enzimática de acrosina mediante ambas técnicas señaladas. En la digestión de gelatina se midió el tamaño de los halos obtenidos a través de un microscopio de contraste de fase, obteniendo un promedio de los tamaños de cada tiempo. Mediante la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), se midió la actividad de acrosina a través de la absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro. Se realizaron 4 replicas experimentales y los resultados obtenidos se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se observó que la actividad enzimática de acrosina de los espermatozoides refrigerados, medida a través del tamaño de los halos de digestión de gelatina, no mostró variaciones estadísticas durante los diferentes tiempos de incubación (p > 0,05). Mientras que los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad durante el tiempo 1 (p < 0,05). Al medir la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), no se observó en los espermatozoides refrigerados diferencias entre los tiempos de incubación (p > 0,05). Sin embargo, los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad a la primera hora de incubación (p < 0,05). Al comparar la actividad enzimática de la acrosina de los espermatozoides refrigerados y frescos, no se observaron diferencias (p > 0,05) en los diferentes tiempos de incubación, tanto en su actividad proteolítica de gelatina como en espectrofotometría con BAEE. Esto podría indicar que el daño o alteraciones sufridas por los espermatozoides refrigerados, durante el proceso de criopreservación, no produciría un cambio significativo en la actividad de acrosina / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Dentro de las biotecnologías reproductivas, la criopreservación de espermatozoides presenta grandes ventajas, sin embargo, involucra cambios en el espermatozoide, tanto estructurales como funcionales, que alterarían eventos fisiológicos asociados a la fecundación, como la capacitación y reacción acrosómica. Esto puede significar cambios en la activación y liberación del sistema proacrosina/acrosina, involucrada en los primeros eventos de interacción ovocito-espermatozoide, por tanto, el objetivo de este trabajo, fue evaluar el sistema proacrosina/acrosina mediante western blot en espermatozoides congelados de perro, en comparación con aquellos frescos, durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se recolectaron 6 eyaculados, de tres perros sanos, a través de estimulación digital. Se utilizó la fracción espermática de cada eyaculado tanto para los controles (frescos) y los congelados. Las muestras procesadas como frescas fueron resuspendidas luego de una centrifugación en medio Fert-Talp y los espermatozoides que se sometieron a congelación se resuspendieron en diluyente en base a fructosa, TRIS, 20% de yema de huevo, ácido cítrico y 5% de glicerol y fueron posteriormente congelados a -196ºC en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 60º C durante 8 segundos en agua. Las muestras se centrifugaron y el pellet de espermatozoides se diluyó en medio Fert-Talp dejándose en incubación en el mismo medio para capacitación durante 0, 30, 60 y 90 minutos. Posteriormente las muestras fueron sometidas a extracción de proteínas espermáticas a las cuales se les adicionó buffer de carga 4X para ser separadas mediante electroforesis y luego detectadas a través de western blot utilizando el anticuerpo C5F10 (anticuerpo de ratón antiacrosina humana). Una vez obtenidas las bandas de proacrosina y acrosina ( y β) se evaluó la densidad óptica de cada una de ellas con el programa PhotoShop 8.0. Los resultados obtenidos fueron analizados a través del análisis de varianza y prueba de Tukey. Los resultados mostraron la presencia del zimógeno proacrosina y las subunidades de la enzima activa ( y β acrosina) en los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos y congelados. En cada uno de los tiempos de capacitación se encontró mayor densidad óptica de proacrosina (P<0,05) en las muestras frescas lo cual indica una mayor cantidad del zimógeno. En la enzima activa -acrosina de las muestras congeladas, hubo diferencias (P<0,05), siendo mayor la densidad óptica a los 30 minutos de capacitación en comparación con los otros tiempos de capacitación. Se encontró mayor reactividad de -acrosina en las muestras congeladas a los 0 y 30 minutos en comparación con las muestras frescas. En β-acrosina se encontró en las muestras congeladas una mayor densidad óptica a los 0 minutos la que disminuyó hasta los 90 minutos de capacitación. Al analizar β -acrosina en cada uno de los tiempos de capacitación entre congelados y frescos se encontraron diferencias significativas (P< 0.05) a los 0, 30, 60 y 90 minutos de capacitación siendo mayor en las muestras congeladas. En conclusión los espermatozoides congelados presentan mayor activación del zimógeno al comparar con los frescos, la cual va disminuyendo en la medida que el tiempo de capacitación es mayor / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La inseminación artificial con espermatozoides refrigerados es empleada en varias especies animales incluidos los perros, sin embargo, aunque en menor grado que la congelación, la refrigeración tiene efectos detrimentales sobre el espermatozoide pudiendo afectar procesos como la capacitación espermática y reacción acrosómica, donde se libera el sistema enzimático proacrosina/acrosina. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante Western Blot en espermatozoides de perro sometidos a refrigeración, la reactividad del sistema proacrosina/acrosina durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se utilizaron 7 eyaculados de 3 perros adultos. En cada muestra se evaluó la concentración espermática y la motilidad progresiva. Los espermatozoides de cada eyaculado fueron procesados como muestras frescas y refrigeradas. Los espermatozoides frescos fueron resuspendidos en medio Fert Talp en cantidad suficiente para lograr una concentración de 5 x 106 espermatozoides/mL y los que se refrigeraron, se resuspendieron en diluyente en base a TRIS en proporción 2:1 (TRIS-semen), yema de huevo, ácido cítrico, fructosa y antibióticos, en cantidad suficiente para lograr una concentración de 200 x 106 espermatozoides/mL, manteniéndolos a 4 ºC por 24 horas. Tanto los espermatozoides frescos (control) como los refrigerados/entibiados, se incubaron en medio de cultivo Fert Talp por periodos de 0 a 3 h para inducir la capacitación espermática. Posterior a cada tiempo de incubación los espermatozoides fueron sometidos a extracción proteica, las que fueron separadas utilizando electroforesis. Luego, a través de Western Blot, las proteínas en estudio se incubaron con el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10, en donde se observaron bandas correspondientes a proacrosina y las formas activas -acrosina y β-acrosina en cada tiempo de capacitación espermática en los espermatozoides caninos frescos y en los refrigerados. La densidad óptica de las bandas se analizó mediante análisis de varianza y posterior prueba de Tukey. Los resultados en espermatozoides frescos mostraron que tanto proacrosina como la forma activa -acrosina no cambiaron en forma significativa durante los diferentes tiempos de incubación, sin embargo, β-acrosina presentó una mayor actividad a partir de la 2 h de incubación (p < 0,05). En espermatozoides refrigerados, la reactividad con el anticuerpo, de proacrosina como tampoco las de sus formas activas  y β, mostró diferencias significativas durante los diferentes periodos. Sin embargo, al comparar la reactividad presentada por proacrosina,  y β-acrosina entre espermatozoides frescos y aquellos sometidos a refrigeración, proacrosina no presentó diferencias significativas entre ambos tratamientos. Se obtuvieron valores mayores (p  0,05) de densidad óptica de -acrosina en espermatozoides refrigerados, a partir de las 3 horas de incubación. En relación a β-acrosina, se pudo observar una mayor reactividad de esta molécula con el anticuerpo al inicio del período de capacitación, en espermatozoides refrigerados en comparación a los frescos. A partir de la segunda hora de capacitación in vitro, no se observaron diferencias significativas en la detección de - acrosina entre estos tipos de espermatozoides. En conclusión, los espermatozoides caninos refrigerados, presentaron una activación más temprana de proacrosina hacia su forma activa β-acrosina, en comparación con los espermatozoides caninos frescos, durante la incubación para capacitación a que fueron sometidos / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La refrigeración de semen equino es una técnica de reproducción asistida que ha ido aumentando su uso y desarrollo en los últimos años, ya que permite el almacenamiento y transporte de semen manteniendo su fertilidad potencial por alrededor de 24 horas. El objetivo del presente estudio fue el de evaluar el uso de distintas marcas de leches descremadas comerciales como diluyente de refrigeración de semen equino, comparándolas entre ellas en su efecto sobre sus características de motilidad espermática. El estudio fue realizado con cuatro potros pura sangre chileno, obteniéndose cuatro eyaculados por padrillo. Cada eyaculado fue filtrado y evaluado en sus características de concentración espermática, volumen total y libre de gel, motilidad total (MT) y motilidad progresiva (MP); esta evaluación fue considerada a tiempo 0 (T0). Cada eyaculado fue fraccionado en cuatro partes, siendo cada fracción homogeneizada con una distinta marca de leche descremada (Colun®, Loncoleche®, Soprole® y Surlat®). Cada dilución de semen fue almacenada en refrigeración a 4° C y evaluada en sus características de MT y MP mediante microscopía cada 24 horas hasta las 72 horas de almacenamiento. Los valores de MT y MP fueron más altos (p < 0,05) en la evaluación inicial, disminuyendo progresivamente en el tiempo hasta obtener los menores valores tras 72 horas. Las leches con mejores resultados (Colun® y Soprole®) no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre ellas, obteniendo los mejores valores en todos los tiempos evaluados, tanto para MT como para MP. Las leches que obtuvieron los menores valores para MT y MP (Loncoleche® y Surlat®) tampoco presentaron diferencias entre ellas (p < 0,05). El potro jugó un rol importante en la mantención de la motilidad, influyendo considerablemente en los resultados. Al diluir semen de los potros con mejor motilidad con las leches que mejor mantenían la motilidad espermática, se permitió la mantención de esta hasta por 48 horas de refrigeración; y las otras marcas hasta por 24 horas. De esta manera la elección de una determinada marca de leche descremada permite la utilización de semen para inseminar hasta por 48 horas al mantenerlo a 4° C