Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La refrigeración de semen equino es una técnica de reproducción asistida que ha ido aumentando su uso y desarrollo en los últimos años, ya que permite el almacenamiento y transporte de semen manteniendo su fertilidad potencial por alrededor de 24 horas. El objetivo del presente estudio fue el de evaluar el uso de distintas marcas de leches descremadas comerciales como diluyente de refrigeración de semen equino, comparándolas entre ellas en su efecto sobre sus características de motilidad espermática. El estudio fue realizado con cuatro potros pura sangre chileno, obteniéndose cuatro eyaculados por padrillo. Cada eyaculado fue filtrado y evaluado en sus características de concentración espermática, volumen total y libre de gel, motilidad total (MT) y motilidad progresiva (MP); esta evaluación fue considerada a tiempo 0 (T0). Cada eyaculado fue fraccionado en cuatro partes, siendo cada fracción homogeneizada con una distinta marca de leche descremada (Colun®, Loncoleche®, Soprole® y Surlat®). Cada dilución de semen fue almacenada en refrigeración a 4° C y evaluada en sus características de MT y MP mediante microscopía cada 24 horas hasta las 72 horas de almacenamiento. Los valores de MT y MP fueron más altos (p < 0,05) en la evaluación inicial, disminuyendo progresivamente en el tiempo hasta obtener los menores valores tras 72 horas. Las leches con mejores resultados (Colun® y Soprole®) no presentaron diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre ellas, obteniendo los mejores valores en todos los tiempos evaluados, tanto para MT como para MP. Las leches que obtuvieron los menores valores para MT y MP (Loncoleche® y Surlat®) tampoco presentaron diferencias entre ellas (p < 0,05). El potro jugó un rol importante en la mantención de la motilidad, influyendo considerablemente en los resultados. Al diluir semen de los potros con mejor motilidad con las leches que mejor mantenían la motilidad espermática, se permitió la mantención de esta hasta por 48 horas de refrigeración; y las otras marcas hasta por 24 horas. De esta manera la elección de una determinada marca de leche descremada permite la utilización de semen para inseminar hasta por 48 horas al mantenerlo a 4° C

In general, fish spermatozoa are immotile in the testis. Movement is activated due to the osmotic shock (hypo- or hyperosmotic, depending on fish origin: freshwater or sea water species) experienced when they are released into the external medium. However, there is no consensus regarding the mechanisms that occur after activation. The aim of this project was to study the importance of the environmental ions and proteins on the activation of European eel sperm, and to apply this knowledge to the improvement of sperm quality preservation. Our results demonstrated that there was a notable reduction in sperm motility when either Na+ or K+ was removed from the seminal plasma, but not when they were removed from the activation media. Therefore, our results demonstrated that the presence of Na+ or K+ in the seminal plasma is necessary for the preservationof sperm motility in European eel. However, the presence of Na+ or K+ in the activation media is not essential for the initiation of sperm activation. In contrast, the presence of the ion Ca2+ in the seminal plasma (or the activation media) was not essential for sperm motility activation in this fish species. Moreover, several authors have hypothesised that the hyperosmotic aquatic environment causes an efflux of water through the spermatozoa membrane, and this efflux causes an increase in the intracellular ion concentration (due to the decrease in cellular volume). However, this hypothesis has never been proven. In this study, sperm size (sperm head area) was studied pre- and post-activation in sea water, and in different conditions. For the first time in a marine fish, a significant decrease in sperm head area post activation in sea water was demonstrated. Also the results of this thesis show a notable reduction in sperm head area when either Na+ or K+ was removed from the seminal plasma, as well as a marked reduction in motilityed. Thus, our results demonstrate that the presence of K+ and Na+ in the seminal plasma is important for the preservation of sperm motility in the European eel, at least in part by maintaining the right sperm cell volume in the quiescent stage. In the this study, a method for the quantitative analysis of the intracellular [Na+ ] ([Na+ ]i) and pH (pHi) levels of eel sperm was created, and used to study the variations in [Na+ ]i (for first time in a marine fish) and pHi during motility activation. The pHi in the quiescent stage was 1.3 units lower than the pH of the seminal plasma, indicating that a H+ gradient exists in the quiescent stage, with higher [H+ ]i levels than those found in the seminal plasma; an important difference for sperm motility. In contrast, the results show that Na+ levels are the same both outside and inside the spermatozoa in the quiescent stage. Our results demonstrate that for sperm motility activation to be successful, the pHi should be lower than the seminal plasma pH and lower or equal to the activation media pH. The absolute [Na+ ]i concentration of marine fish spermatozoa was 1.5 times higher after motility activation than in the quiescent stage, and this increase in intracellular Na+ after activation could be caused both by a cell volume decrease and by the influx of external Na+ . Regarding the ion Ca2+, our results strongly suggest that an increase in intracellular [Ca2+ ] SUMMARY 2 ([Ca2+]i) is not a pre-requisite for the initiation of sperm motility in European eel sperm. Nevertheless several sperm velocity parameters (VCL, VSL, VAP) decreased in the absence of Ca2+ , thus supporting the theory that Ca2+ has a modulatory effect on sperm motility. In addition, it appears that th / En general, los espermatozoides de los peces se encuentran inactivos en los testículos. La activación de los espermatozoides se produce mediante choque osmótico (hipo o hiperosmótico, según se trate de especies de peces de agua dulce o marinos), cuando son liberados en el medio externo. Sin embargo, no existe un consenso sobre el mecanismo fisiológico que ocurre tras la activación espermática. El objetivo de este trabajo es estudiar la importancia de iones y proteínas presentes en el medio, en la activación del esperma de la anguila europea, y aplicar éste conocimiento a la mejora de la preservación de esperma. Así pues, este trabajo se centra en estudiar la importancia que tienen los iones Ca2+, K+, Na+, H+ tanto en el plasma seminal como en el medio activador, y su función en la activación de la motilidad espermática. Así pues, nuestros resultados demostraron que la presencia de Na+ o K + en el plasma seminal (diluyente) fue necesaria para preservar la motilidad espermática en la anguila europea. Sin embargo, la presencia de Na+ o K + en el medio activador no es esencial para la activación espermática. En contra, la presencia del ion Ca2+ tanto en el plasma seminal como en el medio activador no es esencial para la activación espermática en la anguila europea. Además, algunos autores han sugerido que el medio acuático hiperosmótico causa una salida de agua a través de la membrana del espermatozoide, y ésta salida causa un incremento en la concentración de iones intracelulares (provocada por un descenso del volumen celular). Sin embrago, dicha hipótesis no ha sido demostrada. En este trabajo, se ha estudiado los cambios que se producen en el tamaño del espermatozoide (área de la cabeza) durante la pre- y post- activación tanto en agua de mar, como en diferentes condiciones. Por primera vez en una especie de agua marina, se ha demostrado un descenso significativo en el área de la cabeza tras la activación con agua de mar. Además, los resultados de esta tesis también mostraron una importante reducción en el área de la cabeza del espermatozoide cuando Na+ o K+ fueron eliminados del plasma seminal, al igual que una importante reducción de la motilidad espermática. Por lo tanto, nuestros resultados demostraron que la presencia de Na+ y K + en el plasma seminal es importante para la preservación de la motilidad espermática en la anguila europea, en parte debido al mantenimiento de un volumen celular adecuado en estado quiescente. En el presente trabajo, se ha desarrollado un método cuantitativo de análisis de [Na+ ] ([Na+ ]i) y pH (pHi) intracelulares para el esperma de la anguila europea, y mediante el uso de esta metodología se han estudiado las variaciones de [Na+ ]i (por primera vez en un pez marino) y pHi durante la activación espermática en la anguila europea. El pHi en estado quiescente fue 1.3 unidades menor que el pH del plasma seminal, demostrando la existencia de un gradiente de H+ en estado quiescente mayor que la [H+ ]i en el plasma seminal, siendo dicha diferencia importante para la motilidad espermática. En cambio, se observó un equilibrio de Na+ dentro y fuera del espermatozoide en estado quiescente. Nuestros resultados mostraron que para una correcta activación de la motilidad, el pHi debería de ser menor que el pH del plasma seminal y menor o igual que el pH del medio RESUMEN 4 activador. Después de la activación espermática, la concentración de [Na+ ]i en términos absolutos del espermatozoide de un pez marino fue 1.5 veces mayor que en estado quiescente. Este incremento en Na+ intracelular después de la activación podría ser causado tanto por / En general, els espermatozoides dels peixos es troben inactius als testicles. L'activació dels espermatozoides es produeix per mitjà d'un xoc osmòtic (hipo o hiperosmòtic, segons es tracte d'espècies de peixos d'aigua dolça o marins) quan són alliberats a l'exterior. No obstant això, no hi ha un consens sobre el mecanisme fisiològic que ocorre després de l'activació espermàtica. L'objectiu d'aquest treball fou estudiar la importància dels ions i proteïnes presents en el mig en l'activació de l'esperma d'anguila europea, i aplicar aquest coneixement a la millora de la preservació de l'esperma. . Així doncs, els nostres resultats van demostrar que la presència de Na+ o K+ en el plasma seminal va ser necessària per a preservar la motilitat espermàtica en anguila europea. No obstant això, la presència de Na+ o K+ en el mig activador no fou essencial per a l'activació espermàtica. En contra, la presència de l'ió Ca2+ tant en el plasma seminal com en el mig activador no fou essencial per a l'activació espermàtica en anguila europea. A més, alguns autors han suggerit que el medi aquàtic hiperosmòtic causa una eixida d'aigua a través de la membrana de l'espermatozoide, i aquesta eixida causa un increment en la concentració d'ions intracel¿lulars (provocada per un descens del volum cel¿lular). No obstant, aquesta hipòtesi encara no ha sigut demostrada. En aquest treball, s'han estudiat els canvis que es produeixen en la grandària de l'espermatozoide (àrea del cap) durant la pre- i post- activació tant en aigua de mar, com en diferents condicions. Per primera vegada en una espècie d'aigua marina, s'ha demostrat un descens significatiu en l'àrea del cap després de l'activació amb aigua de mar. A més, els resultats d'aquesta tesi també van mostrar una important reducció en l'àrea del cap de l'espermatozoide quan Na+ o K+ van ser eliminats del plasma seminal, igual que una important reducció de la motilitat espermàtica. Per tant, els nostres resultats van demostrar que la presència de Na+ i K+ en el plasma seminal és important per a la preservació de la motilitat espermàtica en anguila europea, en part a causa del manteniment d'un volum cel¿lular adequat en estat quiescent. En el present treball, s'ha desenvolupat un mètode quantitatiu d'anàlisi de [Na+ ] ([Na+ ]i) i pH (pHi) intracel¿lulars per a l'esperma d'anguila europea, i per mitjà de l'ús d'aquesta metodologia s'han estudiat les variacions de [Na+ ]i (per primera vegada en un peix marí) i pHi durant l'activació espermàtica en anguila europea. El fi en estat quiescent va ser 1.3 unitats menor que el pH del plasma seminal, demostrant l'existència d'un gradient de H+ en estat quiescent major que la [H+ ]i en el plasma seminal, sent aquesta diferència important per a la motilitat espermàtica. En canvi, es va observar un equilibri de Na+ dins i fora de l'espermatozoide en estat quiescent. Els nostres resultats van mostrar que per a una correcta activació de la motilitat, el pHi deuria ser menor que el pH del plasma seminal i menor o igual que el pH del mig activador. Després de l'activació espermàtica, la concentració de [Na+ ]i en termes absoluts de l'espermatozoide d'un peix marí va ser 1.5 vegades major que en estat quiescent. Aquest RESUM 6 increment en Na+ intracel¿lular després de l'activació podria ser causat tant per un descens en el volum cel¿lular com per un flux d'entrada de Na+ de l'exterior. Respecte a l'ió Ca2+ , / Vílchez Olivencia, MDC. (2017). Influence of the ionic and protein environment on sperm motility activation in the European eel [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90408 / TESIS