Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El avance de las biotecnologías reproductivas en caninos ha sido más lento que en otras especies animales. El estudio del proceso de capacitación espermática es un factor determinante para el desarrollo exitoso de estas técnicas, siendo aún poco estudiado en caninos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar en caninos, el efecto del tiempo de capacitación espermática in vitro a través de la fecundación in vitro, evaluando la penetración espermática obtenida en ovocitos de perra previamente madurados en el laboratorio. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvieron los ovocitos por corte fino a través de réplicas experimentales, los que se seleccionaron de acuerdo: mayor tamaño, citoplasma oscuro y homogéneo y con más de 3 capas compactas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados se incubaron para maduración en medio TCM 199 suplementado, a 38,5°C, 5 % CO2 y 98% de humedad, durante 72 y 96 horas. Se obtuvieron 6 eyaculados de 3 perros adultos utilizando la segunda fracción espermática de cada eyaculado, los que fueron centrifugados y el pellet resuspendido en medio de capacitación canino (CCM), dejándolos en incubación a temperatura ambiente (20° - 22°C) durante 1, 2 y 3 horas en forma separada para capacitarlos. Al término de cada período de capacitación se extrajo el CCM mediante centrifugación y los espermatozoides se resuspendieron en medio Fert-Talp, con el cual se prepararon gotas de 100 μL (10 x 106 espermatozoides/mL) para ser coincubados con los ovocitos (10 – 15 ovocitos por gota) previamente madurados in vitro por los diferentes tiempos en forma separada. La coincubación gamética se realizó en la estufa de cultivo por 3 horas a 38,5°C y 5% de CO2 en 98% de humedad. 7 Luego de la coincubación los ovocitos inseminados se lavaron y se fijaron en ácido acético, metanol y cloroformo 3:6:2, respectivamente, por tres minutos y luego en ácido acético y metanol 1:3 por 72 horas a 4 °C. Finalmente, los ovocitos se tiñeron con ioduro de propidio (1μg/mL) y fueron evaluados mediante microscopia de epifluorecencia. Se evaluó un total de 425 ovocitos, determinando el porcentaje de ovocitos penetrados por espermatozoides a nivel de la zona pelúcida (ZP), espacio perivitelino (EP) o en el citoplasma ovular (C). Los resultados se evaluaron por ANDEVA y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P ≤ 0,05. Se logró penetración con espermatozoides incubados en los tres tiempos de capacitación empleados, sin encontrar diferencias significativas (P>0,05) respecto a los tiempos de capacitación espermática empleados. Hubo mayores porcentajes de penetración (P<0,05) en los ovocitos madurados durante 72 horas (promedio 60,6%) que en aquéllos madurados durante 96 horas (promedio 45,1%). Se obtuvieron porcentajes de penetración similares al comparar los diferentes niveles evaluados (ZP, EP y C) entre ambos tiempos de maduración ovocitaria, con los 3 tiempos de capacitación empleados. Tanto en ovocitos de 72 horas, como de 96 horas de maduración, se encontró mayor porcentaje de penetración a nivel de C (P > 0,05), promedio 55,0% y 50,0% respectivamente, en comparación con los otros niveles de penetración evaluados. Estos porcentajes son superiores a los obtenidos en otros estudios en los cuales se ha medido la penetración al citoplasma ovular. Se puede concluir que los espermatozoides caninos pueden ser capacitados por períodos de 1 a 3 horas, logrando porcentajes de penetración importantes en ovocitos de perras, en orden de obtener fecundación in vitro exitosa en esta especie. / Proyecto FONDECYT No.1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En este trabajo se estudió el efecto del tiempo de capacitación en la actividad enzimática de acrosina en espermatozoides refrigerados de perro a través de dos métodos de evaluación: digestión de gelatina en placa y la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE) a través de espectrofotometría. La obtención de semen se realizó a 4 perros adultos sanos, mediante estimulación digital del pene, utilizando sólo la fracción espermática de cada eyaculado. El volumen, la motilidad y la concentración espermática se evaluaron de acuerdo a las técnicas estandarizadas en el laboratorio. El trabajo se realizó con semen fresco (control) y semen refrigerado proveniente de los mismos machos. Las muestras obtenidas fueron incubadas a temperatura ambiente con medio Fert Talp durante diferentes tiempos de capacitación (0, 1, 2 y 3 horas), para inducir la capacitación. Luego de cada tiempo de capacitación se evaluó la actividad enzimática de acrosina mediante ambas técnicas señaladas. En la digestión de gelatina se midió el tamaño de los halos obtenidos a través de un microscopio de contraste de fase, obteniendo un promedio de los tamaños de cada tiempo. Mediante la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), se midió la actividad de acrosina a través de la absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro. Se realizaron 4 replicas experimentales y los resultados obtenidos se evaluaron mediante análisis de varianza ANOVA y LSD Fisher a posteriori. Se observó que la actividad enzimática de acrosina de los espermatozoides refrigerados, medida a través del tamaño de los halos de digestión de gelatina, no mostró variaciones estadísticas durante los diferentes tiempos de incubación (p > 0,05). Mientras que los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad durante el tiempo 1 (p < 0,05). Al medir la actividad enzimática de acrosina a través de la hidrólisis de ester de bajo peso molecular (BAEE), no se observó en los espermatozoides refrigerados diferencias entre los tiempos de incubación (p > 0,05). Sin embargo, los espermatozoides frescos mostraron un aumento significativo de su actividad a la primera hora de incubación (p < 0,05). Al comparar la actividad enzimática de la acrosina de los espermatozoides refrigerados y frescos, no se observaron diferencias (p > 0,05) en los diferentes tiempos de incubación, tanto en su actividad proteolítica de gelatina como en espectrofotometría con BAEE. Esto podría indicar que el daño o alteraciones sufridas por los espermatozoides refrigerados, durante el proceso de criopreservación, no produciría un cambio significativo en la actividad de acrosina / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Memoria Para Optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Existe poca información en espermatozoides caninos sobre la dinámica y factores que influyen sobre la capacitación espermática y la reacción del acrosoma (RA), procesos fundamentales para una exitosa fecundación. Con el fin de implementar biotecnologías reproductivas más avanzadas, se hace imperativo profundizar los conocimientos sobre estos procesos espermáticos. El objetivo de este estudio fue inmunolocalizar, por inmunofluorescencia indirecta, la enzima acrosina en espermatozoides caninos eyaculados capacitados in vitro, con el propósito de determinar el efecto del tiempo y temperatura de incubación sobre la cinética de liberación de esta enzima durante la reacción del acrosoma. Se recolectó la fracción espermática de un total de 5 eyaculados, a partir de 3 perros adultos. Cada muestra fue una réplica experimental, evaluándose en cada una la concentración espermática y motilidad progresiva (MP). Los espermatozoides eyaculados fueron capacitados en medio de capacitación canino (CCM) en diferentes tiempos de incubación (0, 1, 2 y 3 horas) y temperaturas de incubación (20°C y 37°C). Cada muestra espermática fue evaluada en las diferentes condiciones de tiempo y temperatura de incubación en su motilidad progresiva y procesada para inmunofluorescencia indirecta, utilizando el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10 y, luego, un anticuerpo secundario antiratón fluorescente, mediante un microscopio de epifluorescencia (Nikon Optiphot 2). La presencia de acrosina se determinó en base a la marca fluorescente a nivel acrosomal, clasificándose en dos patrones de inmunomarcaje: a. sin marca fluorescente o nulos y b. con marca fluorescente o marcados, indicativo de la liberación de acrosina o la permanencia de ésta dentro del acrosoma, respectivamente. Los patrones de inmunomarcaje fueron analizados mediante regresión logística y la motilidad progresiva a través de análisis de varianza, en ambos casos, diferencias de p≤0,05 se consideraron significativas. El porcentaje de espermatozoides sin marca fluorescente o nulos fue aumentando (p<0,0001) a través del tiempo de incubación desde 13,9 % a la hora 0, a 35,7 % y 32,1 % a las 3 horas de incubación, a 20°C y 37°C, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre las temperaturas de incubación (p>0,05). La MP, evaluada subjetivamente mediante microscopía de contraste de fases, indicativa de la viabilidad espermática, fue disminuyendo (p≤ 0,05) a medida que transcurrió el tiempo de incubación, desde un 81% en la hora 0, a un 50% a 20°C y a un 53% a 37°C, a las hora 3 de incubación, sin existir diferencias significativas entre ambas temperaturas de incubación. Los resultados obtenidos permiten concluir que la liberación de acrosina en los espermatozoides caninos eyaculados sometidos a capacitación in vitro es afectada por el tiempo de incubación e independiente de la temperatura de capacitación. Del mismo modo, la motilidad espermática se vio influenciada sólo por el tiempo de capacitación, sin mostrar efecto significativo la temperatura de incubación. Por primera vez, fue posible determinar el curso del tiempo de capacitación en el espermatozoide fresco de perro, mediante la inmunolocalización de la acrosina, pudiendo ser los cambios en los patrones de inmunomarcaje el reflejo de cambios en la reacción acrosomal de los espermatozoides / FONDECYT 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Dentro de las biotecnologías reproductivas, la criopreservación de espermatozoides presenta grandes ventajas, sin embargo, involucra cambios en el espermatozoide, tanto estructurales como funcionales, que alterarían eventos fisiológicos asociados a la fecundación, como la capacitación y reacción acrosómica. Esto puede significar cambios en la activación y liberación del sistema proacrosina/acrosina, involucrada en los primeros eventos de interacción ovocito-espermatozoide, por tanto, el objetivo de este trabajo, fue evaluar el sistema proacrosina/acrosina mediante western blot en espermatozoides congelados de perro, en comparación con aquellos frescos, durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se recolectaron 6 eyaculados, de tres perros sanos, a través de estimulación digital. Se utilizó la fracción espermática de cada eyaculado tanto para los controles (frescos) y los congelados. Las muestras procesadas como frescas fueron resuspendidas luego de una centrifugación en medio Fert-Talp y los espermatozoides que se sometieron a congelación se resuspendieron en diluyente en base a fructosa, TRIS, 20% de yema de huevo, ácido cítrico y 5% de glicerol y fueron posteriormente congelados a -196ºC en nitrógeno líquido. La descongelación se realizó a 60º C durante 8 segundos en agua. Las muestras se centrifugaron y el pellet de espermatozoides se diluyó en medio Fert-Talp dejándose en incubación en el mismo medio para capacitación durante 0, 30, 60 y 90 minutos. Posteriormente las muestras fueron sometidas a extracción de proteínas espermáticas a las cuales se les adicionó buffer de carga 4X para ser separadas mediante electroforesis y luego detectadas a través de western blot utilizando el anticuerpo C5F10 (anticuerpo de ratón antiacrosina humana). Una vez obtenidas las bandas de proacrosina y acrosina ( y β) se evaluó la densidad óptica de cada una de ellas con el programa PhotoShop 8.0. Los resultados obtenidos fueron analizados a través del análisis de varianza y prueba de Tukey. Los resultados mostraron la presencia del zimógeno proacrosina y las subunidades de la enzima activa ( y β acrosina) en los diferentes tiempos de capacitación en los espermatozoides frescos y congelados. En cada uno de los tiempos de capacitación se encontró mayor densidad óptica de proacrosina (P<0,05) en las muestras frescas lo cual indica una mayor cantidad del zimógeno. En la enzima activa -acrosina de las muestras congeladas, hubo diferencias (P<0,05), siendo mayor la densidad óptica a los 30 minutos de capacitación en comparación con los otros tiempos de capacitación. Se encontró mayor reactividad de -acrosina en las muestras congeladas a los 0 y 30 minutos en comparación con las muestras frescas. En β-acrosina se encontró en las muestras congeladas una mayor densidad óptica a los 0 minutos la que disminuyó hasta los 90 minutos de capacitación. Al analizar β -acrosina en cada uno de los tiempos de capacitación entre congelados y frescos se encontraron diferencias significativas (P< 0.05) a los 0, 30, 60 y 90 minutos de capacitación siendo mayor en las muestras congeladas. En conclusión los espermatozoides congelados presentan mayor activación del zimógeno al comparar con los frescos, la cual va disminuyendo en la medida que el tiempo de capacitación es mayor / Financiamiento: Proyectos Fondecyt 1060602 y 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La inseminación artificial con espermatozoides refrigerados es empleada en varias especies animales incluidos los perros, sin embargo, aunque en menor grado que la congelación, la refrigeración tiene efectos detrimentales sobre el espermatozoide pudiendo afectar procesos como la capacitación espermática y reacción acrosómica, donde se libera el sistema enzimático proacrosina/acrosina. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante Western Blot en espermatozoides de perro sometidos a refrigeración, la reactividad del sistema proacrosina/acrosina durante diferentes tiempos de capacitación in vitro. Se utilizaron 7 eyaculados de 3 perros adultos. En cada muestra se evaluó la concentración espermática y la motilidad progresiva. Los espermatozoides de cada eyaculado fueron procesados como muestras frescas y refrigeradas. Los espermatozoides frescos fueron resuspendidos en medio Fert Talp en cantidad suficiente para lograr una concentración de 5 x 106 espermatozoides/mL y los que se refrigeraron, se resuspendieron en diluyente en base a TRIS en proporción 2:1 (TRIS-semen), yema de huevo, ácido cítrico, fructosa y antibióticos, en cantidad suficiente para lograr una concentración de 200 x 106 espermatozoides/mL, manteniéndolos a 4 ºC por 24 horas. Tanto los espermatozoides frescos (control) como los refrigerados/entibiados, se incubaron en medio de cultivo Fert Talp por periodos de 0 a 3 h para inducir la capacitación espermática. Posterior a cada tiempo de incubación los espermatozoides fueron sometidos a extracción proteica, las que fueron separadas utilizando electroforesis. Luego, a través de Western Blot, las proteínas en estudio se incubaron con el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10, en donde se observaron bandas correspondientes a proacrosina y las formas activas -acrosina y β-acrosina en cada tiempo de capacitación espermática en los espermatozoides caninos frescos y en los refrigerados. La densidad óptica de las bandas se analizó mediante análisis de varianza y posterior prueba de Tukey. Los resultados en espermatozoides frescos mostraron que tanto proacrosina como la forma activa -acrosina no cambiaron en forma significativa durante los diferentes tiempos de incubación, sin embargo, β-acrosina presentó una mayor actividad a partir de la 2 h de incubación (p < 0,05). En espermatozoides refrigerados, la reactividad con el anticuerpo, de proacrosina como tampoco las de sus formas activas  y β, mostró diferencias significativas durante los diferentes periodos. Sin embargo, al comparar la reactividad presentada por proacrosina,  y β-acrosina entre espermatozoides frescos y aquellos sometidos a refrigeración, proacrosina no presentó diferencias significativas entre ambos tratamientos. Se obtuvieron valores mayores (p  0,05) de densidad óptica de -acrosina en espermatozoides refrigerados, a partir de las 3 horas de incubación. En relación a β-acrosina, se pudo observar una mayor reactividad de esta molécula con el anticuerpo al inicio del período de capacitación, en espermatozoides refrigerados en comparación a los frescos. A partir de la segunda hora de capacitación in vitro, no se observaron diferencias significativas en la detección de - acrosina entre estos tipos de espermatozoides. En conclusión, los espermatozoides caninos refrigerados, presentaron una activación más temprana de proacrosina hacia su forma activa β-acrosina, en comparación con los espermatozoides caninos frescos, durante la incubación para capacitación a que fueron sometidos / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1060602-1080618

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La fecundación es el proceso de unión entre el espermatozoide y el ovocito durante la reproducción sexual para dar lugar a un nuevo individuo. En vertebrados la fecundación puede ser interna o externa. La fecundación interna implica que el encuentro de los gametos tiene lugar dentro de la hembra y es característica de mamíferos, reptiles y aves. En la fecundación externa la unión de ambos gametos ocurre fuera del cuerpo de la hembra y se da principalmente en peces y anfibios. Los espermatozoides de mamíferos adquieren la capacidad fecundante en el tracto reproductor femenino en un proceso dinámico llamado capacitación, el cual puede requerir entre algunos minutos hasta varias horas en función de la especie. Sabemos que la capacitación espermática implica cambios moleculares como la eliminación de colesterol de membrana, la entrada de calcio o la fosforilación de proteínas implicadas en la hiperactivación. Entre las diversas modificaciones, se le ha otorgado un papel destacado al glucocáliz debido a su implicación en el proceso de fecundación en mamíferos. Los glucoconjugados que constituyen el glucocáliz espermático se reorganizan considerablemente durante la capacitación, preparándose así para interaccionar con la zona pelúcida y el oolema del ovocito. Esta reorganización de azúcares de membrana plasmática ha sido ampliamente estudiada en especies como el ratón, jabalí, cabra, toro y primates no-humanos. Sin embargo, los cambios estructurales y funcionales de los espermatozoides durante la capacitación en humanos actualmente permanecen poco definidos. Además, la elevada heterogeneidad de las muestras de semen humanas y la limitación de las técnicas convencionales para predecir la funcionalidad espermática, hace necesario profundizar en la fisiología espermática durante la capacitación. En la Fase I de este trabajo se utilizaron múltiples biomarcadores espermáticos con el fin de evaluar el impacto de diferentes tiempos de capacitación (una y cuatro horas) sobre la calidad del espermatozoide humano. Los resultados demostraron que los espermatozoides recuperados tras cuatro horas de capacitación presentaron mayor funcionalidad que aquellos que únicamente capacitaron una hora. En concreto, se observó un número significativamente mayor de células con morfología normal y tasas de fragmentación de ADN más bajas. Además, tras capacitar durante cuatro horas se observó un incremento significativo de espermatozoides con fosforilación en los residuos de tirosina de la pieza principal, así como una mayor redistribución de los azúcares presenten en la membrana plasmática. El análisis multivariante, considerando diferentes biomarcadores morfológicos y moleculares, mostró que la subpoblación de espermatozoides recuperada tras cuatro horas de capacitación fue más homogénea que la subpoblación recuperada tras una hora de capacitación. Estos hallazgos subrayan la importancia del tiempo de capacitación como variable a considerar en los métodos de selección espermática, tanto en investigación básica como en las técnicas de reproducción asistida. La finalidad de las técnicas de reproducción asistida es favorecer el embarazo en casos de infertilidad masculina, femenina o de ambos. En la mujer, una de las causas más comunes de infertilidad es la presencia de endometriosis. La endometriosis es una enfermedad crónica que consiste en el crecimiento de tejido endometrial fuera de la cavidad uterina y se asocia con disfunciones ovulatorias secundarias, alteraciones en la foliculogénesis, en el líquido peritoneal y/o en el sistema inmune. El líquido peritoneal de las mujeres con esta patología contiene una elevada concentración de sustancias inflamatorias y debido a la permeabilidad de las trompas es capaz de difundir al interior y afectar a la calidad de los gametos. Dado que es una enfermedad femenina, pocos estudios han relacionado el efecto del líquido peritoneal procedente de mujeres con endometriosis sobre la calidad espermática. Entre ellos, se ha visto que el líquido peritoneal de estas pacientes deteriora parámetros espermáticos como: la motilidad, la reacción acrosómica, la fragmentación del ADN y la capacidad de unión a la zona pelúcida del ovocito. Sin embargo, la implicación del líquido peritoneal procedente de pacientes con endometriosis en la redistribución de los glucoconjugados en la membrana del espermatozoide humano no ha sido estudiada hasta el momento. En la Fase II de este trabajo se evaluó el efecto del líquido peritoneal procedente de mujeres con y sin endometriosis sobre el espermatozoide humano mediante diversos biomarcadores. Para ello, se realizaron cultivos espermáticos durante 24 y 48 horas con líquido peritoneal al 20%. Los resultaron mostraron que la viabilidad espermática y la reacción acrosómica espontánea no se vieron afectadas en ninguna de las condiciones experimentales. No obstante, tras 48 horas, los espermatozoides cultivados con líquido peritoneal procedente de mujeres con endometriosis presentaron significativamente menor motilidad, menor fosforilación en los residuos de tirosinas y diferente reorganización de azúres de superficie en comparación con las células control. Estos datos aportan información sobre la fisiología de los espermatozoides humanos al interaccionar con el líquido peritoneal de mujeres con endometriosis, destacando el deterioro de la calidad espermática conforme aumenta el tiempo de exposición. Los modelos biomédicos son una fuente de gran valor en todos los campos de investigación. El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo animal con un elevado potencial en la biología del desarrollo, la genética, la inmunología, el comportamiento, la fisiología y la nutrición, debido a las numerosas ventajas que ofrece frente a otras especies. Además, presenta una elevada homología genética con la especie humana y sus costes de mantenimiento son relativamente bajos. En la fisiología reproductiva y del desarrollo, el modelo biológico del pez cebra destaca por presentar una tasa de fecundación elevada, un ciclo reproductivo corto y un desarrollo embrionario rápido. La fecundación y el desarrollo son externos, condición que facilita el estudio directo de las etapas tempranas de la ontogenia. Además, una de las características más relevantes es que tanto los embriones como las larvas tempranas son transparentes lo que permite el seguimiento visual durante el desarrollo de los distintos tejidos y órganos. Este hecho ha conllevado que la gran mayoría de los estudios realizados se hayan concentrado en diferentes aspectos de las etapas del desarrollo, siendo muy pocos los que han analizado la fisiología del espermatozoide. Se sabe que los espermatozoides de Danio rerio al igual que la gran mayoría de peces no presentan acrosoma. Además, tras la activación de la motilidad, debido al deterioro que les produce el choque hipoosmótico, tienen apenas un minuto para llegar al ovocito y fecundarlo. Por otra parte, al tratarse de un pez con fecundación externa, los espermatozoides están sometidos a una elevada competencia espermática, ya que tienen que competir con los espermatozoides de los otros machos por fecundar los ovocitos. Un estudio previo caracterizó la influencia negativa de la elevada competencia espermática en la descendencia de Danio rerio. Sin embargo, nada se sabe acerca de los cambios fisiológicos antes y tras la activación de la motilidad al someter al espermatozoide de Danio rerio a diferentes niveles de competencia. En la Fase III de este trabajo se analizó el efecto de la competencia espermática a distintos tiempos de activación (30 segundos, 1, 5 y 10 minutos) sobre diferentes biomarcadores en el espermatozoide de Danio rerio. Para ello, se partió de espermatozoides procedentes de machos expuestos a diferentes niveles de competencia espermática, alta competencia (dos machos y una hembra) y baja competencia (un macho y dos hembras). Los resultados mostraron un incremento de espermatozoides con flagelos enrollados y fragmentación de ADN a medida que incrementaba el tiempo de activación. No obstante, los espermatozoides procedentes de machos sometidos a elevada competencia, presentaron significativamente menor porcentaje de espermatozoides con flagelos enrollados tras la activación pero mayor porcentaje de células con fragmentación en el ADN antes de la activación en comparación con las células procedentes de baja competencia. Adicionalmente, mediante morfología y morfometría geométrica (aislando forma y tamaño como variables independientes) se analizaron las distintas partes del espermatozoide (cabeza, pieza intermedia y flagelo) tras 30 segundos de activación en ambos tratamientos de competencia. Los gametos procedentes de machos expuestos a elevada competencia mostraron cabezas de menor tamaño, piezas intermedias más grandes y flagelos más largos que los espermatozoides procedentes de baja competencia. Por lo tanto, los datos sugieren que la presencia de un macho rival podría tener un efecto positivo en el fenotipo del espermatozoide pero un efecto negativo sobre la integridad del ADN. Estos hallazgos proporcionan una perspectiva nueva de como el entorno social puede afectar a los parámetros espermáticos y su influencia en la biología de la reproducción.