Memoria Para Optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Existe poca información en espermatozoides caninos sobre la dinámica y factores que influyen sobre la capacitación espermática y la reacción del acrosoma (RA), procesos fundamentales para una exitosa fecundación. Con el fin de implementar biotecnologías reproductivas más avanzadas, se hace imperativo profundizar los conocimientos sobre estos procesos espermáticos. El objetivo de este estudio fue inmunolocalizar, por inmunofluorescencia indirecta, la enzima acrosina en espermatozoides caninos eyaculados capacitados in vitro, con el propósito de determinar el efecto del tiempo y temperatura de incubación sobre la cinética de liberación de esta enzima durante la reacción del acrosoma. Se recolectó la fracción espermática de un total de 5 eyaculados, a partir de 3 perros adultos. Cada muestra fue una réplica experimental, evaluándose en cada una la concentración espermática y motilidad progresiva (MP). Los espermatozoides eyaculados fueron capacitados en medio de capacitación canino (CCM) en diferentes tiempos de incubación (0, 1, 2 y 3 horas) y temperaturas de incubación (20°C y 37°C). Cada muestra espermática fue evaluada en las diferentes condiciones de tiempo y temperatura de incubación en su motilidad progresiva y procesada para inmunofluorescencia indirecta, utilizando el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10 y, luego, un anticuerpo secundario antiratón fluorescente, mediante un microscopio de epifluorescencia (Nikon Optiphot 2). La presencia de acrosina se determinó en base a la marca fluorescente a nivel acrosomal, clasificándose en dos patrones de inmunomarcaje: a. sin marca fluorescente o nulos y b. con marca fluorescente o marcados, indicativo de la liberación de acrosina o la permanencia de ésta dentro del acrosoma, respectivamente. Los patrones de inmunomarcaje fueron analizados mediante regresión logística y la motilidad progresiva a través de análisis de varianza, en ambos casos, diferencias de p≤0,05 se consideraron significativas. El porcentaje de espermatozoides sin marca fluorescente o nulos fue aumentando (p<0,0001) a través del tiempo de incubación desde 13,9 % a la hora 0, a 35,7 % y 32,1 % a las 3 horas de incubación, a 20°C y 37°C, respectivamente. No se encontraron diferencias significativas entre las temperaturas de incubación (p>0,05). La MP, evaluada subjetivamente mediante microscopía de contraste de fases, indicativa de la viabilidad espermática, fue disminuyendo (p≤ 0,05) a medida que transcurrió el tiempo de incubación, desde un 81% en la hora 0, a un 50% a 20°C y a un 53% a 37°C, a las hora 3 de incubación, sin existir diferencias significativas entre ambas temperaturas de incubación. Los resultados obtenidos permiten concluir que la liberación de acrosina en los espermatozoides caninos eyaculados sometidos a capacitación in vitro es afectada por el tiempo de incubación e independiente de la temperatura de capacitación. Del mismo modo, la motilidad espermática se vio influenciada sólo por el tiempo de capacitación, sin mostrar efecto significativo la temperatura de incubación. Por primera vez, fue posible determinar el curso del tiempo de capacitación en el espermatozoide fresco de perro, mediante la inmunolocalización de la acrosina, pudiendo ser los cambios en los patrones de inmunomarcaje el reflejo de cambios en la reacción acrosomal de los espermatozoides / FONDECYT 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El estudio de las biotecnologías reproductivas ha conducido a generar nueva y mejor información sobre la reproducción en mamíferos. Sin embargo, en caninos estos estudios se han desarrollado de manera más lenta que en otras especies. Es así como las técnicas de criopreservación de espermatozoides de perro representan aún un tópico que necesita ser más estudiado con el fin de lograr mejores índices de preñez. El objetivo del presente trabajo fue inmunolocalizar la enzima acrosina en espermatozoides caninos refrigerados/entibiados y capacitados in vitro, con el fin de determinar el efecto del tiempo y temperatura de incubación sobre la cinética de liberación de la acrosina durante la Reacción del Acrosoma (RA). Se recolectó un total de 7 eyaculados de 3 perros mediante manipulación digital. En cada muestra se evaluó la concentración y motilidad progresiva (MP). Los espermatozoides de cada eyaculado se refrigeraron con un diluyente en base a TRIS, fructosa, ácido cítrico y yema de huevo (20%). Luego de 24 horas en refrigeración (4º C), cada muestra libre del diluyente y resuspendida en medio de capacitación canino (CCM) fue dividida en 7 alícuotas, las que fueron incubadas separadamente por 0, 1, 2 y 3 horas a 20º y 37º C. Cada muestra en las diferentes condiciones de incubación de tiempo y temperatura fue procesada para inmunofluorescencia indirecta, empleando un anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10 y luego un anticuerpo secundario “antimouse” fluorescente. Mediante un microscopio de epifluorescencia (Nikon Optiphot2), se evaluó la ausencia (no marcados) o presencia (marcados) de marca fluorescente a nivel acrosomal, indicativo de la liberación de acrosina o la permanencia de ésta dentro del acrosoma, respectivamente. Los porcentajes de no marcados (sin marca fluorescente) obtenidos fueron aumentando significativamente a través del tiempo de incubación desde 45,14% a la hora 0 a 81,21% a las 3 h de incubación a 20º C (P < 0,05). Los espermatozoides incubados a 37° C presentaron un aumento significativo del patrón no marcado; desde 45,14% a la hora 0 a 78, 86% a las 3 horas de incubación, presentando la mayor pérdida a la segunda hora de incubación. La MP fue evaluada subjetivamente, mediante microscopIa de contraste de fases, para determinar la viabilidad espermática. Se obtuvo que a medida que transcurrió el tiempo de capacitación la MP fue disminuyendo de 78,57% a la hora 0 a 55% en la tercera hora a 20º C (P < 0,05). La MP a 37º C no experimentó una variación significativa en el tiempo. Con los resultados obtenidos se puede concluir que en espermatozoides caninos refrigerados/entibiados y capacitados in vitro, la liberación de acrosina es dependiente del tiempo, y que esta liberación se produce de manera más acelerada al aumentar la temperatura a 37º C. La motilidad, sin embargo, se vio afectada sólo por el tiempo de capacitación, sin mostrar efecto significativo la temperatura de incubación / Proyectos ENL 05/8 DID; FONDECYT 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En espermatozoides caninos criopreservados, existen pocos antecedentes respecto de la dinámica del proceso de Capacitación Espermática (CE) y de los factores que la influencian. La Reacción Acrosómica (RA), paso final de la CE, permite la liberación de la enzima acrosina, proteasa presente en el acrosoma de los espermatozoides mamíferos, que ha sido involucrada en la unión y penetración de la Zona Pelúcida (ZP). El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto del tiempo y la temperatura sobre la cinética de la liberación de la enzima acrosina a través de su localización, mediante inmunofluorescencia indirecta. Los eyaculados fueron obtenidos mediante manipulación digital, siendo evaluados a través de microscopía de contraste de fases, para el análisis subjetivo de Motilidad Progresiva (MP) y el recuento de la concentración espermática, para luego ser congelados con diluyente en base a fructosa, TRIS, ácido cítrico, 20% de yema de huevo y 5% de glicerol y descongelados en agua a 60º C por 8 segundos. Los espermatozoides descongelados fueron capacitados utilizando el Medio de Capacitación Canino (CCM) a diferentes tiempos y temperaturas de incubación. Posteriormente, las muestras fueron procesadas para inmunofluorescencia, mediante la fijación de los espermatozoides y la aplicación de los anticuerpos; como primer anticuerpo se utilizó el anticuerpo monoclonal antiacrosina humana C5F10. La evaluación de los espermatozoides se realizó observando la presencia de la enzima acrosina, de acuerdo a la marca fluorescente a nivel acrosomal mediante Microscopía de Epifluorescencia (Nikon Optihot 2). Los espermatozoides caninos congelados mostraron la presencia de acrosina sólo a nivel acrosomal. Se pudo identificar 2 patrones según la presencia de la marca: a) sin marca fluorescente o patrón nulo y b) con marca fluorescente o patrón marcado. Al patrón nulo, corresponderían los espermatozoides que han experimentado la RA y por lo tanto, han liberado la enzima acrosina desde el acrosoma, mientras que al patrón marcado pertenecerían aquellos espermatozoides que no han cursado la RA y contienen la enzima en el interior del acrosoma. Al incubar los espermatozoides en medio capacitante (CCM), por periodos de 0, 30, 60 y 90 minutos y a temperaturas de 20 y 37º C se observó que el porcentaje de espermatozoides reaccionados o sin marca fluorescente aumentó a través del tiempo desde 29,71% a 65,43% a 20º C y desde 50,29% a 73,43% a 37º C de incubación. La motilidad espermática fue medida subjetivamente, mediante microscopía de contraste de fases en cada protocolo de capacitación (tiempo y temperatura) y se utilizó como medida de la viabilidad espermática. Los resultados de este estudio indicaron que la motilidad disminuyó a medida que aumentó el tiempo y la temperatura de incubación, desde un 67,14% a un 41,43% a 20º C (p < 0,05) y desde un 45% a un 25,71% a 37º C (p < 0,05). En base a los resultados obtenidos, se puede concluir que la ocurrencia de la liberación de la enzima acrosina en espermatozoides caninos congelados es afectada tanto por el tiempo de CE, como por la temperatura de incubación, traduciéndose en mayores porcentajes de liberación o pérdida de la enzima. Asimismo, la motilidad espermática disminuye a través del tiempo y al aumentar la temperatura de incubación. / Proyectos ENL 05/8 DID y FONDECYT 1060602