Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El factor de crecimiento diferencial 9 (GDF-9) y la proteína morfogénica ósea 15 (BMP-15) regulan en diferentes especies procesos esenciales para la maduración del ovocito, tales como la expansión del cúmulo. Este estudio evaluó en caninos la expresión génica de GDF-9 y BMP-15 en las células del cúmulo (CCs) obtenidas de complejos cúmulos ovocitos (COCs) a través del ciclo estral en relación a la maduración in vitro (IVM) de los ovocitos y la expansión de estas células. Las CCs se obtuvieron de COCs de folículos antrales de anestro, proestro, estro y diestro, previo y después de la IVM, expandidas y no expandidas. Para lograr mayor cantidad de CCs, antes y después de la IVM, estas se cultivaron in vitro por 48 h en medio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) con suero fetal bovino. El desarrollo meiótico luego de la IVM se evaluó mediante microscopía de fluorescencia, clasificándolo en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), primera metafase (MI) y segunda metafase (MII). La expresión relativa de GDF-9 y BMP-15 en las CCs se evaluó mediante q-PCR. Estos genes se encontraron en todas las etapas del ciclo antes y después de la IVM, con diferencias significativas entre estas en relación a la expansión y maduración de los ovocitos. De acuerdo a los estados del ciclo estral, en las CCs de COCs no madurados, los niveles de GDF-9 fueron mayores (P < 0,05) durante el estro, seguido por el diestro y los menores (P < 0,05) niveles en proestro y anestro. En BMP-15, los mayores (P < 0,05) niveles de mRNA se observaron en estro y diestro. En las CCs expandidas no hubo diferencias en GDF-9 entre las distintas etapas del ciclo, pero en BMP-15 los menores (P < 0,05) niveles de mRNA se observaron en estro. Luego de la maduración, hubo un incremento (P < 0,05) de los transcriptos de ambos genes en las CCs de anestro, proestro y diestro, excepto los niveles de mRNA de BMP-15 durante el diestro. En estro en cambio, hubo una disminución significativa de la expresión de los dos genes luego de la IVM. No se encontraron diferencias significativas en la capacidad de alcanzar el estado de MII al considerar la etapa del ciclo. Sin embargo, los COCs obtenidos de proestro y diestro que expandieron sus CCs pudieron reiniciar la meiosis en mayor (P < 0,05) porcentaje en comparación con las demás etapas del ciclo y los COCs de estro que expandieron sus CCs lograron mayores (P < 0,05) porcentajes de MII en relación a los que no expandieron el cúmulo. En conclusión, GDF-9 y BMP-15 se expresan en las CCs en todas las etapas del ciclo con un patrón diferente de acuerdo a cada una y estarían involucrados en la expansión del cúmulo de la perra, pudiendo estar relacionado con la maduración meiótica in vitro, al menos en aquellos ovocitos en etapa estral. / Differential growth factor 9 (GDF-9) and bone morphogenic protein 15 (BMP-15) regulate essential processes for oocyte maturation in different species, such as cumulus expansion. This study evaluated gene expression of GDF-9 and BMP-15 in canine cumulus cells (CCs) obtained from cumulus-oocyte complexes (COCs) through the estrous cycle in relation to oocyte in vitro maturation (IVM) and the expansion of CCs. The CCs were obtained from COCs of antral follicles from anestrus, proestrus, estrus, diestrus phases, before and after IVM, expanded and non-expanded. To achieve more CCs, before and after IVM, these were cultured in vitro for 48 h in Dulbecco's Medium Modified Eagle's Medium (DMEM) with fetal calf serum. The meiotic development after IVM was evaluated by fluorescence microscopy, classifying it in germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD), first metaphase (MI) and second metaphase (MII). The relative expression of GDF-9 and BMP-15 in the CCs was evaluated by q-PCR. These genes were found in all stages of the reproductive cycle, before and after IVM, with significant differences between them in relation to the expansion and oocytes maturation. According to the estrous cycle stages, CCs from non-matured COCs expressed higher (P < 0.05) levels of GDF-9 mRNA during estrus in comparison with the other phases and the lowest (P < 0.05) levels at proestrus and anestrus. The highest (P < 0.05) levels of BMP-15 transcripts were observed in estrus and diestrus. There were no differences in GDF-9 gene expression comparing expanded CCs among the different phases of the estrous cycle, regarding BMP- 15 transcripts, the lowest (P < 0.05) levels were registered in estrus. After IVM, the level of both genes increased (P < 0.05) in CCs of anestrus, proestrus and diestrus, except BMP-15 during diestrus. In contrast, in estrus GDF-9 transcripts significantly decreased after IVM. Non expanded CCs exhibited the lowest levels of both genes at anestrus and proestrus, whereas at diestrus the levels of GDF-9 in non-matured CCs were lower (P < 0.05) than that of the expanded cells, the levels of BMP-15 were similar. No differences were found in the oocyte ability to reach MII state when comparing the phases of the estrous cycle. However, COCs obtained from proestrus and diestrus that expanded their CCs showed higher (P < 0.05) percentage of meiosis resumption than to the other phases. At estrus expanded CCs achieved higher (P < 0.05) percentages of MII in comparison to those did not expand. In conclusion, GDF-9 and BMP-15 are expressed in the CCs over the estrous cycle with different patterns according each phase and these genes maybe involved in the cumulus expansion in canines, maybe related to the in vitro maturation, at least in oocytes at estrus phase / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1171670

Orientador: Anthony César de Souza Castilho / Resumo: A fim de mimetizar melhores condições do sistema in vivo, um meio de cultura mais proximo à composição do fluido do oviduto foi criado, denominado fluido ovidutal sintético (SOF), este foi formulado com base na análise bioquímica do oviduto das ovelhas. In vivo os momentos finais de maturação oocitária ocorrem em contato com o FO, já in vitro a maturação oocitária é realizada com protocolos de maturação 24h sem nenhuma alteração no meio de maturação. Portanto, o presente estudo investigou o impacto do meio de cultivo SOF durante as últimas quatro horas da maturação in vitro (MIV) e seus efeitos sobre a progressão meiótica e taxa de produção embrionária. Para tanto, os CCOs foram recuperados de ovário de vacas abatidas e maturados in vitro, nos seguintes grupos: SFB/ SFB; SFB/ SFB+SOF; BSA/BSA; BSA/BSA+SOF, todos submetidos há uma troca total de meio nas últimas quatro horas de maturação, adicionando o meio SOF de acordo com os grupos citados anteriormante. Os CCOs maturados foram fertilizados e cultivados em atmosfera e umidade controlada até o estágio de blastocisto (7 e 8 dias após a fertilização). A análise estatística foi realizada transformando os dados em arcoseno e as médias foram comparadas pelo teste T usando JMP (software JMP, SAS Institute Cary, NC). Diferenças significativas foram consideradas quando p≤ 0,05. O resultado obtido mostrou que o tratamento com SOF não tem efeito na progressão da meiose (p= 0,5944). Entretanto, quando analisamos as taxas embrionárias e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The oviduct and its secretion, the ovidutal fluid (OF), promote an adequate environment for the final maturation of the oocyte, sperm training, fertilization, transport and initial development of the embryo. In this context, in order to mimic better conditions of in vivo mechanisms, a culture medium similar to the composition of the oviduct fluid, called synthetic ovidutal fluid (SOF), was formulated based on biochemical analysis of the oviduct of sheep. Specifically, regarding the importance of OF for the final maturation of the oocyte in cattle, only the last four hours of oocyte maturation occur in the oviduct, which therefore pemits a new strategy of oocyte maturation in vitro (MIV) in the bovine species. Therefore, the present study aimed to investigate the impact of SOF culture medium during the last four hours of IVM and its effects on the meiotic progression and embryonic production rate. Therefore, the COCs were recovered from ovaries of slaughtered and matured cows in vitro, in base medium (composed of 199 MCT with Earles salts supplemented with pyruvate, amicacin, BSA, follicle stimulating hormone and luteinizing hormone, and another group in 199 MCT medium with Earles salts supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), pyruvate, both in moist atmosphere at 5% CO2 for 20 hours (4 replicates with 20 COCs/group). In the last four hours of maturation, the medium was completely changed by adding the SOF medium. Matured COCs were fertilized and cultivated in a control... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

La progresión meiótica y el desarrollo embrionario temprano están programados, en parte, por la activación tradcuccional de mRNAs maternos como lo son los que codifican para las proteinas de ciclina B1 o mos. Estos mRNAs no son traducidos al mismo tiempo ni en el mismo lugar. Por lo contrario, su traducción está especificamente regulada por elementos de poliadenilación citoplasmática (CPEs) presentes en sus 3'UTRs. Los elementos CPEs reclutan a la proteina de unión a CPE (CPE-binding protein CPEB (Colegrove-Otero et al., 2005; de Moor et al., 2005; Mendez and Richter, 2001; Richter, 2007)). Esta proteina de unión al RNA no sólo determina cuándo y en qué medida un mRNA será activado traduccionalmente por poliadenilación citoplasmática (Mendez et al., 2000a; Mendez et al., 2000b; Mendez et al., 2002) sino que también participa, junto con el represor de la traducción Maskin, en el transporte y la localización de sus mRNAs diana hacia los sitios de localización subcelular donde su traducción ocurrirá (Huang et al., 2003; Huang and Richter, 2004). Durante el desarrollo embrionario de Xenopus, CPEB se encuentra localizada en el polo animal de los oocitos y más tarde, sobre el huso mitótico y centrosomas en el embrión (Groisman et al., 2000). Se ha demostrado que embriones de Xenopus inyectados con agentes que interrumpen la traducción dependiente de poliadenilación citoplasmática, detienen la división celular y presentan estructuras mitóticas anormales (Groisman et al., 2000). En este trabajo que derivó en mi tesis doctoral, hemos demostrado que la activación traduccional localizada en el huso mitótico de mRNAs regulados por CPEB que codifican para proteinas con una conocida función en aspectos estructurales del ciclo celular como la formación del huso mitótico y la segregación cromosómica, es esencial para completar la primera división meiótica y para la correcta segregación cromosómica en oocitos de Xenopus.