Memoria para optar el título de Bioquímico / TonEBP es el factor transcripcional de eucariontes responsable de regular la transcripción de genes involucrados en la respuesta al estrés osmótico. Las proteínas codificadas por estos genes permiten la acumulación de osmolitos orgánicos compatibles, tales como sorbitol. Este se genera a partir de glucosa por la acción de aldosa reductasa (AR). Se desconoce si TonEBP está presente en el cardiomiocito neonato como en el adulto y si se regula por cambios en la osmolaridad externa como también por estrés oxidativo. Los resultados inmunocitoquímicos y de Western blot mostraron que basalmente TonEBP y AR están en el citosol y núcleo de manera homogénea en cardiomiocito de rata neonata, sin embargo en cardiomicitos adultos TonEBP y AR basalmente se encuentran sólo en la periferia celular. Cultivos primarios de cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico (Sorbitol 600 mOSm) por 8, 16 y 24 h, mostraron un aumento de TonEBP y de su translocación al núcleo. Los niveles de AR y su actividad también aumentaron significativamente a las 8, 16 y 24 h postestímulo. En cambio, los cultivos expuestos a estrés hiposmótico (30% de dilución del medio de cultivo, 202 mOsm), la cantidad de proteína de TonEBP y AR disminuyeron respecto al control y no se detectó actividad de AR. Dado que nuestro laboratorio previamente demostró que el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol genera ROS y aumenta los niveles intracelulares de Ca2+, también se estudió sus efectos en la regulación de TonEBP. Los resultados mostraron que la translocación de TonEBP al núcleo es independiente del calcio y que las ROS son necesarias pero no suficiente para su completa activación. Bajo estas últimas condiciones, TonEBP migró al núcleo pero no se activó dado que no aumentaron sus niveles de proteína ni los de su gen blanco AR. En su conjunto, estos resultados sugieren que TonEBP está presente en el cardiomiocito y tanto este factor transcripcional como AR modifican sus niveles y actividad en respuesta a cambios en la osmolaridad externa en forma independiente del calcio. El estrés oxidativo estimuló su translocación al núcleo pero no su activación / The transcription factor TonEBP has been implicated in regulation of gene transcription involved in the response to osmotic stress. These genes allow the accumulation of intracellular organic osmolytes and protect to the cell against hypertonicity, normalizing both cell volume and inorganic ion concentration. Sorbitol, one of these compatible organic osmolytes, is generated from glucose by action of Aldose Reductase (AR). It remains unknown whether TonEBP is present in the neonate and adult cardiac myocytes and if it is regulated by changes in the external osmolality and also by oxidative stress. Both immunofluorescence and Western blot results showed that in basal conditions, TonEBP and AR were localized in the cytosol and nucleus in equal amount of cultured neonatal cardiac myocytes. But in adult rats in basal conditions, TonEBP and AR were localizated only in the external membrane cellular. When these cells were exposed to hyperosmotic stress (Sorbitol 600 mOSm) by 8, 16 and 24 h, TonEBP levels increased and it is translocated to the nucleus. Levels of AR and their activity also increased significantly after 8, 16 and 24 h post-stimulus. However, cells exposed to hyposmotic stress (30% dilution in culture medium, 202 mOsm), the amounts of TonEBP and AR decreased respect to controls and AR activity was not detected. On the other hand, our laboratory has previously shown that hyperosmotic stress induced by Sorbitol generates ROS and induces increase in intracellular calcium levels. We tested whether these variables regulates TonEBP. The results showed that nuclear translocation of TonEBP was independent of calcium but ROS were necessary but not sufficient for a complete TonEBP activation. Under these conditions, TonEBP is translocated to the nucleus but that was not induced and neither increased AR levels. Collectivelly, these results suggest TonEBP is present in cultured cardiac myocytes and response to changes in the external osmolality independent of calcium. Nevertheless oxidative stress was not sufficient for a complete activation of TonEBP

El objetivo general del presente estudio de Tesis es la “Caracterización funcional del cotransportador Na<SUP>+</SUP>/HCO<SUB>3</SUB>- (NBC) cardíaco”, investigando la implicancia de sus diferentes isoformas en la fisiología cardíaca y esclareciendo el papel que cumple la Angiotensina II (Ang II) en la modulación de su actividad. Para ello se utilizaron miocitos ventriculares de gato adulto en los cuales se midió el pH intracelular (pHi) por epifluorescencia y se realizaron registros de potenciales de acción (PA) con la técnica de Patch-clamp para evaluar la implicancia de las isoformas electrogénicas del NBC en su morfología y duración. La producción de anticuerpos contra la isoforma electrogénica NBC1 se utilizó para evaluar la expresión y función del NBC1 en los miocitos ventriculares.

El objetivo del presente trabajo de tesis doctoral es estudiar y caracterizar la formación de un complejo físico-funcional entre el cotransporte sodio/bicarbonato electrogénico Na<SUP>+</SUP>/HCO<SUB>3</SUB><SUP>-</SUP> (NBCe1) y la AC IX.

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las enfermedades cardiovasculares isquémicas son una de las principales causas de muerte en Chile. En estas patologías, los cardiomiocitos están expuestos a privación de nutrientes, hipoxia y estrés osmótico. Nuestro laboratorio ha estudiado el efecto del estrés hiperosmótico sobre el cardiomiocito. Sin embargo se desconocen las consecuencias del estrés hiposmótico ya que a diferencia de otros tipos celulares, las células cardíacas no están expuestas fisiológicamente a grandes fluctuaciones en la osmolaridad externa. Durante los procesos de isquemia y reperfusión, los cardiomiocitos se exponen a estrés oxidativo, desbalance redox intracelular e hiposmolaridad, pudiendo ser las consecuencias de esta última muy severas para el corazón, debido a los cambios electrofisiológicos que acompañan al hinchamiento celular. Este aumento del volumen celular es especialmente marcado durante la reperfusión, evento indispensable para reestablecer la irrigación sanguínea y rescatar al miocardio. Esta memoria estudió el efecto de las especies reactivas de oxígeno en la regulación del volumen y muerte activada por estrés hiposmótico en cardiomiocitos. Nuestros resultados a través de calceína-AM y microscopia confocal, muestran que cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiposmótico con soluciones 248 ó 202 mOsm (medio de cultivo diluido 15% y 30% con agua), aumentaron su volumen en un 40 y 60%, respectivamente. Estas células no presentaron disminución regulada de volumen (RVD) espontáneamente, ni en presencia de gramicidina (inductor de RVD). El estrés hiposmótico generó especies reactivas del oxígeno (ROS), evaluada por diclorofluoresceina, siendo el radical hidroxilo la principal especie radicalaria detectada por resonancia de espín electrónico (ESR), usando el atrapador 5,5-dimetilpirrolina 1-óxido. El origen de ROS se determinó observando el efecto de apocinina (inhibidor NADPH oxidasa), rotenona (inhibidor mitocondria), alopurinol (inhibidor xantino oxidasa) y N-acetil-cisteína sobre la oxidación de diclorofluoresceina (DCF-DA). Los resultados muestran que sólo apocinina inhibió la generación de ROS dependiente del estrés hiposmótico. Mediante ESR y células transducidas con AdCAT (catalasa), AdSOD1(superóxido dismutasa citosólica), AdSOD2 (superóxido dismutasa mitocondrial) y AdGPx (glutatión peroxidasa) se identificó a NADPH oxidasa como principal fuente de las ROS. Por otra parte, su generación también se asoció a una disminución en el nivel total de GSH desde los 60 min post-estímulo, siendo significativo a las 4 h, para 202 mOsm. El estrés hiposmótico disminuyó la viabilidad de los cardiomiocitos, determinada por azul de tripán, a las 6 h en un 45 y 40% según el nivel de hiposmolaridad, A diferencia del estrés hiperosmótico no se detectó activación de las caspasas 9 y 3, sugiriendo la existencia de una muerte independiente de caspasas. Dado que no se evaluaron otros parámetros de muerte, aún se desconoce la participación de necrosis o autofagia en la muerte de los cardiomiocitos activada por estrés hiposmótico. La viabilidad celular se recuperó en células transducidas con AdCAT y expuestas a estrés hiposmótico. Además en estas células hubo un RVD parcial. En conclusión, los resultados indican que el estrés hiposmótico aumenta el volumen del cardiomiocito, siendo NADPH oxidasa una de las principales fuentes en la generación de ROS. Estos últimos inhiben el mecanismo de RVD y median la muerte celular estimulada por el estrés hiposmótico.

Magíster en fisiología / Introducción: La muerte de los cardiomiocitos induce la pérdida de función del corazón y el desarrollo de diferentes patologías, sin embargo, se desconoce a cabalidad los mecanismos implicados. La policistina-1 (PC1) es un mecanosensor presente en los cardiomiocitos, clave en la función cardiaca, por lo que su presencia en los cardiomiocitos podría implicar la protección de los mismos ante un estrés celular. La necrosis y la apoptosis son dos principales tipos de muerte celular. Durante la apoptosis diferentes vías de señalización son reguladas, donde BCL-2 es una proteína clave como anti-apoptótica mientras NIX es pro-apoptótica. Las variaciones entre ellas son importantes para determinar las vías implicadas en la apoptosis. Debido a que la PC1 es un mecanosensor, en este proyecto se propuso estudiar el papel de la PC1 en la protección de los cardiomiocitos ante procesos de muerte celular, especialmente el ligado a la apoptosis inducida por estrés hiposmótico. Hipótesis: La ausencia de la policistina-1 induce la muerte del tejido cardiaco en condiciones basales y predispone a la muerte de los cardiomiocitos en cultivo sometidos a estrés mecánico, asociado a una disminución de la relación BCL-2/NIX.Materiales y métodos: Se utilizaron cardiomiocitos de ventrículo de ratas neonatas en cultivo, silenciadas para la PC1 (siPC1), en condiciones basales y sometidas a estrés mecánico con un medio hipo-osmótico (HS) y muestras de tejido cardiaco de ratones jóvenes y seniles, controles y knockout para la PC1 (PC1 KO) en los cardiomiocitos. Resultados: La deficiencia de PC1 en los cardiomiocitos (siPC1) induce la muerte por apoptosis de los mismos mientras aumenta la muerte posterior a un estrés hiposmótico. La relación BCL-2/NIX disminuye en los cardiomiocitos siPC1 sometidos a estrés mecánico, debido principalmente a la disminución del contenido de BCL-2 en condiciones basales. Por otro lado, los animales PC1 KO no muestran diferencias en el contenido de BCL-2 o NIX, pero sí muestran un aumento del contenido de Bax, otra proteína pro-apoptótica. Conclusión: Nuestros datos indican que la PC1 tiene un papel regulador de la apoptosis en los cardiomiocitos, aún en condiciones basales y, al menos en parte, por evitar la disminución del contenido de proteínas pro-apoptóticas como BCL-2 y el aumento de NIX ante un estrés hiposmótico. / Background: Cardiomyocyte death leads to the loss of the heart function and the development of different pathologies; however, the implied mechanisms are poorly understood. Polycystin-1 (PC1) is a mechanosensor present in the cardiomyocytes, key in the heart function, so its presence in cardiomyocytes may involve the protection of them against a cellular stress. Necrosis and apoptosis are the two major classes of cellular death. During apoptosis, different signaling pathways are regulated, where BCL-2 is a key anti-apoptotic protein whereas NIX is pro-apoptotic. The variations between them are relevant to determinate the implied pathways in the apoptosis. Since PC1 is a mechanosensor, this project aims to study the role of PC1 in the protection of the cardiomyocytes against the processes of cellular death, especially the one linked to apoptosis induced by hiposmotic stress. Hypothesis: The absence of Polycystin-1 induces the death of the cardiac tissue in basal conditions and predisposes to the death the cardiomyocytes in culture subjected to mechanical stress, associated with a decrease in the BCL-2/NIX ratio.Materials and methods: Neonatal rat ventricular cardiomyocytes, PC-1 silenced (siPC1), where used, in basal conditions and subjected to mechanical stress with a hypo-osmotic medium (HS), and samples of young and senile rat cardiac tissue, control and knockout for PC1 (PC1 KO) in the cardiomyocyte. Results: PC1 deficiency in cardiomyocytes (siPC1) induces death by apoptosis of them while increasing death following hypo-osmotic stress. The BCL-2/NIX ratio decreases in siPC1 cardiomyocytes subjected to mechanical stress, mainly due to the decrease in BCL-2 content at baseline conditions. Conversely, PC1 KO animals do not show differences in BCL-2 or NIX content, but they do show an increase in the content of Bax, another pro-apoptotic protein. Conclusion: Our data suggest that PC1 has a regulatory role for apoptosis in the cardiomyocytes, even under basal conditions and, at least in part, to avoiding the reduction of the pro-apoptotic protein content as BCL-2, and the increase in NIX content to a hypo-osmotic stress.

El propósito general del presente trabajo de Tesis Doctoral fue estudiar la participación de la ET-1 endógena en el desarrollo de HC inducida por Ang II así como las vías de señalización intracelular involucradas. En virtud de los antecedentes expuestos se elaboró la siguiente hipótesis: la HC patológica se produciría como resultado de la activación de un mecanismo autocrino/paracrino desencadenado por el estiramiento del miocardio y que involucra la liberación de Ang II y ET-1, el aumento de las ERO y la activación del NHE-1. La figura 8 muestra la secuencia propuesta de los eventos que se desencadenarían en los miocitos cardíacos adultos cuando son expuestos a Ang II y/o ET-1.