Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La maduración ovocitaria involucra cambios nucleares y citoplasmáticos que comprenden la reanudación de la meiosis y la redistribución de organelos como el aparato de Golgi. La coordinación de estos procesos en el tiempo es un evento crítico para el establecimiento de desarrollo embrionario normal. Este trabajo estudió la dinámica del aparato de Golgi (AG) durante la maduración de ovocitos de perra y su relación con la progresión nuclear. La localización del AG se evaluó mediante inmunofluorescencia indirecta en ovocitos no madurados, madurados in vitro (IVM) hasta 96 hrs y madurados in vivo, los cuales fueron distribuidos aleatoriamente para ser incubados con los Ac contra las proteínas del AG GM130 y Giantin; la configuración cromatínica se determinó mediante tinción DAPI, en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), metafase I (MI) y II (MII). Los resultados mostraron dos patrones de distribución de la inmunomarca: a) Homogéneo en el citoplasma, que predominó en ovocitos no madurados (99%) presentando paralelamente el estado de VG (87%) y, b) Cortical, principalmente en ovocitos sometidos a IVM (97%), donde se reanuda la meiosis incrementando el desarrollo meiótico con el tiempo de cultivo y predominando el estado MI (75%). Todos los ovocitos madurados in vivo mostraron patrón cortical y 94% de MII. Estos resultados sugieren que el AG se relocaliza durante la IVM de ovocitos de perra, lo que se relaciona con la progresión meiótica pero de manera no coordinada, siendo in vitro menos eficiente que in vivo / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

Memoria para optar al Título Profesional de Médico veterinario / En el presente trabajo, se estudiaron los efectos de la suplementación con piruvato al medio de cultivo y del tiempo de incubación (72-96 h) sobre el desarrollo meiótico de ovocitos caninos. Los ovocitos utilizados se obtuvieron de ovarios de perras ovariohisterectomizadas, los que fueron liberados mediante cortes finos con hojas de disección, recolectándose bajo lupa estereoscópica. Se seleccionaron aquellos ovocitos de mayor tamaño, que presentaban citoplasma homogéneo y al menos dos capas de células del cúmulo, lavándose dos veces en medio PBS para posteriormente incubarlos en grupos de 8 a 10 ovocitos en gotas de 100 μL, bajo aceite mineral estéril. Se utilizó un medio de maduración A (control), preparado en base a TCM 199 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 10 UI/mL de gonadotrofina coriónica humana, 12 mg/mL de penicilina y 20 mg/mL de estreptomicina; y el medio de maduración B, que correspondió al medio control más la suplementación de 11,2 mg/mL de ácido pirúvico. Los ovocitos incubados en ambos medios se cultivaron por periodos de 72 y 96 horas a 38,5 ºC, en una atmósfera de 5% de CO2 y 98% de humedad. Luego de cada periodo de incubación, los ovocitos se fijaron en una solución de ácido acético, metanol y cloroformo (3:6:2 v/v) por tres minutos, y posteriormente en ácido acético y metanol (1:3 v/v) por 72 horas a 4º C. Los ovocitos fijados se tiñeron con 0,1% de ioduro de propídeo (PI) y se evaluaron bajo microscopia de epifluorecencia. Los distintos estados de desarrollo meiótico fueron clasificados como: estado de vesícula germinativa (GV), reinicio meiótico (GVBD), primera metafase (MI) y segunda metafase (MII). Se realizaron 9 réplicas experimentales. Para el análisis de los resultados los porcentajes fueron transformados: arc-sen √% y evaluados por ANDEVA. Los promedios fueron comparados a través de la prueba de Tukey. 7 Diferencias de p≤ 0,05 fueron consideradas significativas. Tanto a las 72 como a las 96 horas de cultivo el porcentaje de ovocitos que se mantuvieron arrestados al estado de vesícula germinativa, sin progresar en la meiosis, fue significativamente mayor (P≤ 0,05) en el medio control, que en el medio suplementado con piruvato. Por otra parte, la proporción de gametos en reinicio meiótico y primera metafase no varió en los distintos sistemas de cultivo, mientras que la maduración nuclear completa alcanzando el estado de segunda metafase (MII) fue favorecida por la presencia de ácido pirúvico en el medio (P≤ 0,05). No se observaron diferencias significativas asociadas al efecto del tiempo de incubación (72 y 96 horas) sobre los distintos estados de maduración nuclear en ninguno de los medios de cultivo. Los resultados muestran que la suplementación con piruvato mejora las tasas de maduración in vitro de ovocitos de perra y que la prolongación del tiempo de incubación no influye significativamente en el efecto que tiene el piruvato sobre el desarrollo nuclear de los ovocitos caninos madurados en cultivo / Financiamiento: Proyecto FONDECYT 1030380

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En caninos, el desarrollo de las biotecnologías reproductivas ha sido inferior en comparación al realizado en otras especies, básicamente debido a la baja eficiencia en la maduración in vitro de los ovocitos. La adecuada maduración comprende tanto al núcleo como al citoplasma, a nivel citoplasmático involucra la redistribución y desarrollo de organelos, entre estos, la organización y la actividad metabólica de las mitocondrias. Sin embargo, no hay mayores antecedentes respecto al desarrollo citoplasmático in vitro en los caninos, por lo que en la presente memoria se estudió la actividad y distribución mitocondrial en ovocitos de perras en estado inmaduro, madurados in vitro por 72 y 96h y madurados in vivo. Se analizó un total de 766 ovocitos obtenidos de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía. Del total de estos ovocitos estudiados, 215 fueron utilizados como inmaduros, 254 fueron madurados durante 72 horas y los otros 297 durante 96 horas. Adicionalmente se analizó una cantidad total de 15 ovocitos madurados in vivo, obtenidos por lavados del oviducto a perras en estro, ovariohisterectomizadas 72 h después de la ovulación, la que se determinó mediante análisis de progesterona sérica. Tanto los ovocitos inmaduros, madurados in vitro y madurados in vivo fueron procesados de forma separada para evaluar la distribución y actividad mitocondrial, usando la sonda de fluorescencia MitoTracker Red CMXRos®. Las observaciones se realizaron en un microscopio invertido con epifluorescencia. La actividad mitocondrial se evaluó de acuerdo a la fluorescencia emitida en alta, media y baja para cada uno de los estados de maduración de los ovocitos y se analizó mediante chi-cuadrado. Se estableció dependencia entre las frecuencias de ovocitos con distintas intensidades de fluorescencia (alta, media, baja) al comparar las muestras provenientes de ovocitos inmaduros, madurados in vitro por 72 y 96 h, y madurados in vivo (chi cuadrado = 30,59; p< 0,01), indicando que la actividad mitocondrial se encuentra directamente asociada al estado de maduración del ovocito de perra. En la actividad mitocondrial todos los ovocitos madurados in vivo presentaron fluorescencia de tipo media, la que predominó en ovocitos de perra inmaduros y madurados in vitro; sin embargo, se observó un aumento en el porcentaje de ovocitos con 3 esta emisión de fluorescencia durante la maduración in vitro que indicaría una actividad mitocondrial progresiva durante el cultivo, asociada al tiempo de maduración. La distribución mitocondrial se evaluó mediante análisis descriptivo, determinándose cuatro patrones: Homogéneo liso completo (A), Homogéneo granuloso completo (B), Heterogéneo granuloso periférico y central (C), y Heterogéneo granuloso central (D). En ovocitos inmaduros se encontraron dos patrones de distribución mitocondrial A (72,1%) y B (27,9%); en aquellos madurados in vitro por 72 h se presentaron los cuatro patrones, predominando el B (63,8%), seguido por C (20,5%), el A (9,8%) y finalmente el D (5,9%). en los ovocitos madurados por 96 h se observaron los patrones, B (63,6%), seguido por C (35,7%) y finalmente D (0,7%). En el caso de los ovocitos madurados in vivo se describió sólo un patrón de distribución mitocondrial que correspondió a B. Con estos antecedentes se indica que en ovocitos inmaduros de perra predomina una distribución uniforme de las mitocondrias en su citoplasma. Además la presentación de tres patrones diferentes en los ovocitos madurados in vitro a aquel descrito en ovocitos madurados in vivo podría indicar que durante la maduración in vitro se producen movimientos de las mitocondrias en el citoplasma ovular. También, las distribuciones de las mitocondrias, variaron a través de la maduración in vitro, asemejándose a aquellos madurados in vivo, sin embargo, hubo diferencias entre ambos tipos de maduración lo que podría estar asociado a las condiciones de cultivo. / Proyecto FONDECYT 1080618

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Factor de Crecimiento Diferencial 9 (GDF9) cumple un rol esencial en el desarrollo ovocitario de los mamíferos, sin embargo, en ovocitos caninos se desconoce su presencia y participación durante la maduración. En este estudio, se evaluó la presencia de GDF9 en ovocitos de perra madurados in vitro (MIV) y su relación con la expansión del cúmulo, para lo cual complejos cúmulo ovocito (COC’s) se cultivaron por 0, 48, 72 y 96 h. Posteriormente, algunos COC’s fueron desprendidos del cúmulo. De este modo, ovocitos sin células del cúmulo y COC’s se procesaron para su evaluación a través de Inmunofluorescencia Indirecta y Western blot con el anticuerpo anti GDF9 humano. Con ambas técnicas, la proteína se detectó principalmente en el ovocito y en menor proporción en las células del cúmulo. Además, en ambos tipos celulares, la detección de GDF9 disminuyó a medida que progresó el tiempo de cultivo. En ovocitos denudados y COC’s, se detectó una banda de ~56 kDa correspondiente a la pro-proteína en todos los tiempos de maduración. Sin embargo, sólo en COC’s no madurados y MIV por 48 h se detectaron dos bandas de proteína madura de ~18 y 19 kDa. Finalmente, se observó una relación inversa entre la expansión del cúmulo durante la MIV y la detección de GDF9 por Western blot. Por consiguiente, GDF9 está presente en ovocitos de perra y tendría participación en los procesos iniciales del crecimiento y desarrollo ovocitario / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Durante la maduración ovocitaria el ovocito experimenta cambios a nivel nuclear, citoplasmático y de sus cubiertas, encontrándose en esta última la zona pelúcida (ZP), cubierta extracelular que cumple importantes funciones en el reconocimiento gamético durante la fecundación. El objetivo de este trabajo fue evaluar mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) los cambios a nivel ultraestructural en la ZP durante la maduración ovocitaria in vitro, comparando la ZP de ovocitos inmaduros y aquellos madurados en cultivo. También se evaluó el estado morfológico de la ZP de ovocitos de perra durante el proceso de maduración in vitro, a través de dos tiempos de cultivo (72 y 96 horas). Paralelamente, se evaluó el diámetro de los ovocitos con su ZP, en estado inmaduro y sometidos a maduración en cultivo. De ovarios de perras sanas sometidas a ovariohisterectomía se obtuvo un total de 500 ovocitos a través de cortes finos, en un total de 15 réplicas experimentales. Se seleccionaron los ovocitos, de mayor tamaño (diámetro), con su citoplasma homogéneo y completamente rodeados por al menos tres capas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados en cada réplica fueron divididos en dos grupos: un grupo se incubó para maduración in vitro en medio TCM 199 suplementado y el otro grupo se procesó inmediatamente en estado de ovocitos inmaduros. La fijación de los ovocitos inmaduros y madurados in vitro se realizó posterior a la extracción de las células del cúmulo. Para ello, fueron lavados en buffer Cacodilato 50 mM por 15 minutos y luego fijados en glutaraldehído 2,5% por un mínimo de 24 h. Posteriormente se realizó una postfijación con Tetroxido de Osmio al 2%, luego los ovocitos fueron colocados en cámaras de cobre cerradas para ser deshidratados mediante concentraciones crecientes de acetona (30%, 50%, 70%, 90% y 100%). La deshidratación de los ovocitos se completó mediante secado de punto crítico del CO2. Luego fueron 5 montados en porta-especímen para ser sombreados con oro-paladio. Las muestras se analizaron bajo el MEB marca “LEO” modelo 1420 VP. La medición del trabeculado de la zona pelúcida y del tamaño ovocitario se llevó a cabo mediante el programa “AutoCad 2006” a un total de 93 ovocitos a partir de las fotografías tomadas en el MEB. Del total de ovocitos analizados 30 pertenecían a estado inmaduro, 31 a 72 horas de maduración y 32 a 96 horas de maduración. Los resultados se evaluaron por el análisis de varianza de un factor o clasificación simple y la prueba de Tukey para determinar la significancia de las diferencias P≤ 0,05. Se encontraron diferencias significativas (P≤ 0,05) entre ovocitos inmaduros y madurados in vitro, tanto a 72 como a 96 h. En ovocitos antes de la maduración en cultivo se observó que los agujeros de la ZP eran compactos y de poco tamaño, en cambio en los ovocitos ya madurados in vitro, los agujeros de la ZP presentaron un tamaño mayor. Comparando los dos tiempos de maduración in vitro empleados en este trabajo, se observó mayor tamaño de agujeros en el trabeculado de la ZP de ovocitos madurados por 72 h en comparación a aquellos madurados por 96 h. En el tamaño ovocitario no se encontró un aumento significativo entre los ovocitos madurados in vitro respecto a los inmaduros. Tanto en los ovocitos inmaduros como en los madurados en sistema de cultivo se observó en un alto porcentaje, aproximadamente un 81% de un total de 500 ovocitos, cierto grado de daño morfológico en la ZP, encontrando una mayor proporción de daño en los ovocitos que se sometieron a un sistema de maduración in vitro. De los resultados se puede concluir que durante la maduración ovocitaria in vitro hay cambios estructurales a nivel de la ZP en ovocitos caninos, los que podrían influir en la capacidad de unión y penetración del espermatozoide a través de la ZP durante la interacción de los gametos / Proyectos ENL 05/8 DID y FONDECYT 1060602

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo del presente estudio fue evaluar la distribución de los gránulos corticales (GC)en el citoplasma ovular, y su relación con el desarrollo meiótico en ovocitos caninos durante la maduración in vitro (MIV) a las 48, 72 y 96h, comparados con aquellos ovocitos no sometidos a cultivo (no madurados) y ovocitos madurados in vivo (ovulados). La distribución de los GC durante la MIV e in vivo fue evaluada a través de la tinción con la lectina lens culinaris conjugada con FITC mediante microscopia de epifluorescencia, en tanto, la configuración cromatínica se evaluó paralelamente mediante la tinción con DAPI y microscopia de epifluorescencia. A través del tiempo de incubación se pudieron establecer tres patrones de distribución de los GC que indicarían el movimiento de estas estructuras durante el proceso de maduración del ovocito. El patrón A, Homogéneo liso; en el cual la marca fluorescente se presentó fina y homogénea en todo el citoplasma ovular, Patrón B, Homogéneo granuloso; pequeñas agrupaciones o conglomerados de aspecto granular (“Clusters”) distribuidos uniformemente por todo el citoplasma, Patrón C, Granuloso cortical; de aspecto granular, en la cual los gránulos se ubicaron inmediatamente por debajo de la membrana plasmática del ovocito en todo su perímetro. El patrón A, se observó sólo en ovocitos en vesícula germinativa (VG) (19%), y fue encontrado sólo en ovocitos no madurados, no obstante la mayoría (p<0,05) de los ovocitos en VG presentó el patrón B, observándose mayoritariamente (p<0,05) en ovocitos no madurados (94%), también en ovocitos madurados en cultivo por 48h (4%), disminuyendo (P<0.05) al aumentar el tiempo de cultivo hasta las 96h. El patrón C se observó sólo en aquellos ovocitos sometidos a MIV aumentando significativamente con el tiempo de cultivo, además de observarse en todos (100%)los ovocitos ovulados. A medida que el tiempo transcurrió, la maduración meiótica progresó sólo con el tiempo de cultivo a una tasa menor que la alcanzada por los GC durante la MIV, a pesar de observar que ovocitos con una distribución cortical o periférica de los gránulos (patrón C), aumentaron en estados nucleares de metafase I (MI) y metafase II (MII) con el tiempo de cultivo. Además considerando que el desarrollo meiótico sólo alcanzó un 27 % de MII a las 96 h en comparación al 90% de ovocitos ovulados en MII, es posible establecer que sólo la distribución de los GC progresaría paralelamente al tiempo de cultivo indicando con esto que la maduración citoplasmática evaluada a través de la migración de estas vesículas no ocurre coordinadamente con la maduración nuclear

Este estudio fue diseñado para evaluar los efectos de la criopreservación de los ovocitos obtenidos de terneras prepúberes o de vacas adultas en la organización de los cromosomas, la morfología de los microtúbulos y la estructura del citoesqueleto, y el posterior desarrollo embrionario, para esto se realizaron tres grupos experimentales. En el primer grupo experimental los ovocitos una vez madurados in vitro (IVM), fueron divididos en 3 grupos según si eran: 1) sin ningún tratamiento (control); 2) expuesto a los agentes crioprotectores (CPAs); o 3) criopreservados por el método del vitrification de la open pulled straw (OPS). Después de descongelar los ovocitos una muestra de estos eran fijadas en paraformaldehido para posteriormente realizar técnicas de inmunofluorescencia específicas y examinadas debajo de un microscopio confocal. Los ovocitos restantes fueron fecundados y el porcentaje de división celular y desarrollo embrionario fueron registradas a las 48 h y 7 días post inseminación, respectivamente. Después de la vitrification o de la exposición a los CPAs, un porcentaje significativamente elevado de ovocitos mostraron cambios en la morfología del huso comparado al grupo control. La estructura de la placa metafásica de ovocitos de vaca madurados in vitro fue significativamente más resistente al proceso del vitrificación por OPS. La vitrificación de ovocitos procedentes de terneras o vacas adultas mostraron un aumento significativo en el porcentaje de ovocitos que presentaban banda de actina discontinua o ausencia de ésta comparado con los controles no tratados.Los ovocitos expuesto solamente a los CPAs mostraron un aspecto similar a los controles. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en los ovocitos tanto de vaca como de ternera, independientemente del tratamiento. La división embrionaria y el porcentaje de blastocistos fueron significativamente menores en aquellos ovocitos vitrificados comparado con los ovocitos control. Los ovocitos obtenido de vacas adultas fueron más sensibles a la exposición a los CPAs, mientras que el proceso de vitrificación parecía tener efectos más perjudiciales en los ovocitos de ternera.En el segundo experimento la Roscovitina fue utilizado para mantener ovocitos de ternera en la etapa de vesícula germinal durante un período de 24 h. Los complejos cúmulus-ovocito fueron aspirados de ovarios de ternera y cultivados durante 24 h en TCM199 que contenía diversas concentraciones de Roscovitina (0, 12.5, 25, 50 y 100 &#61549;m). Después de este período de premaduración, un grupo de ovocitos fueron fijados para lacmoide o para inmunohistoquímica y el resto fueron cultivados durante 24 h más en las condiciones permisivas de maduración. Los ovocitos cultivados con Roscovitina, en todas las concentraciones probadas, fueron bloqueados en estadio de vesícula germinal. El efecto inhibitorio varió según la dosis, siendo las concentraciones más altas las más eficientes, produciendo el bloqueo en estadio de Vesícula Germinal en más del 60.0% de los ovocitos. Sin embargo, este efecto inhibitorio de la Roscovitina fue completamente reversible. El porcentaje de división y desarrollo embrionario de aquellos ovocitos premadurados con 50 &#61549;m de Roscovitina no fueron significativamente diferentes comparado a los ovocitos control. La morfología de la placa metafásica fue la típica del estadio de metafase II en el 75.8% de los ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II después del tratamiento previo con 50 &#61549;m de Roscovitina no difiriendo significativamente del grupo control. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en un 97.0% y 98.2% de ovocitos expuestos a 50 &#61549;m Roscovitina comparada al control, respectivamente. Estos resultados demuestran la viabilidad de mantener los ovocitos de ternera en parada meiótica artificial sin comprometer su capacidad de desarrollo subsiguiente. En el último grupo experimental, el estudio fue diseñado para establecer los efectos del estadio de maduración nuclear de los ovocitos de ternera y de un tratamiento de premaduración con Roscovitina (ROS) sobre la resistencia a la criopreservación. Los ovocitos de ternera fueron vitrificados mediante OPS en estadio de vesícula germinal rota (GVBD) o en metafase II (MII). En otro experimento, los ovocitos en vesícula germinal rota fueron premadurados con 50 &#61549;M de ROS antes de la vitrificación. Después de la descongelación, los ovocitos en estadio de GVBD y aquellos premadurados con ROS y vitrificados en VGBD fueron madurados durante 18 h adicionales, mientras que aquellos vitrificados en estadio de MII fueron madurados durante 2 h más. Porcentajes significativamente más bajos de división embrionaria fueron obtenidos para el aquellos ovocitos vitrificados en estadio de GVBD y MII (9.9% y 12.6%, respectivamente) comparados con los ovocitos del grupo control (73.9%). Porcentajes de división embrionaria significativamente inferiores fueron obtenidos en aquellos ovocitos que fueron vitrificados en estadio de VGBD previa premaduración con ROS comparados con los ovocitos control o comparados con los ovocitos del grupo ROS-CONTROL. Independientemente del estadio de maduración nuclear en el que fueron vitrificados, no se obtuvo desarrollo embrionario. Un porcentaje significativamente inferior de ovocitos presentaban una placa metafásica normal después de ser expuestos a los crioprotectores y vitrificados (independientemente del estadio de maduración) comparado con los controles. Estos resultados indican que el protocolo del vitrification tiene un efecto negativo en la organización de la placa metafásica de los ovocitos de ternera vitrificados tanto en estadio de MI como de VGBD, lo cual afecta el posterior desarrollo embrionario. El tratamiento del premaduración con el ROS no tiene ningún efecto beneficioso en el resultado del vitrification por el método de OPS. / This study was designed to evaluate the effects of the cryopreservation of oocytes obtained from prepubertal calves or adult cows on chromosome organization, spindle morphology, cytoskeleton structures, and the ability of fertilized oocytes to develop to the blastocyst stage. Once in vitro matured (IVM), the oocytes were divided into 3 groups according to whether they were: 1) left untreated (control); 2) exposed to cryoprotectant agents (CPAs); or 3) cryopreserved by the open-pulled-straw (OPS) vitrification method. After thawing, oocyte samples were fixed, stained using specific fluorescent probes and examined under a confocal microscope. The remaining oocytes were fertilized, and cleavage and blastocyst rates recorded. After vitrification or CPA exposure, significantly higher proportions of oocytes showed changes in spindle morphology compared to the control group. The spindle structure of the adult cow IVM oocytes was significantly more resistant to the OPS vitrification process. Vitrification of oocytes from calves or adult cows led to significantly increased proportions of oocytes showing discontinuous or null actin staining of the cytoskeleton compared to non-treated controls. Oocytes only exposed to the cryoprotectants showed a similar appearance to controls. A normal distribution of actin microfilaments was observed in both calf and adult cow oocytes, irrespective of the treatment. Cleavage and blastocyst rates were significantly lower for vitrified versus non-treated oocytes. Oocytes obtained from adult cows were more sensitive to CPA exposure, while the vitrification procedure seemed to have more detrimental effects on the calf oocytes.In the second experiment Roscovitine, was used to maintain calf oocytes at the germinal vesicle stage for a 24-h culture period. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from slaughterhouse calf ovaries and cultured for 24 h in TCM199 containing different levels of roscovitine (12.5, 25, 50 and 100 &#61549;M). After this culture period, the oocytes were either fixed immediately or cultured for a further 24 h in conditions permissive of maturation. After fixing a sample of these oocytes, the remaining oocytes were subsequently fertilized and cleavage and blastocyst rates were recorded. Oocytes cultured in the presence of roscovitine, at all the concentrations tested, were significantly blocked at the germinal vesicle stage. The inhibitory effect varied according to the dose, with 50 &#61549;M and 100 &#61549;M roscovitine being the most efficient concentrations, producing developmental arrest at the GV stage in over 60.0% of oocytes. However, this inhibitory effect of roscovitine was fully reversible since over 73% of the oocytes cultured for 24 h in the presence of 50 &#61549;M roscovitine reached the metaphase II stage after a further 24 h of culture in a permissive medium. Cleavage rates and blastocyst yields were not significantly different for oocytes cultured under 50 &#61549;M roscovitine inhibition compared to oocytes not subjected to prematuration culture (rates of 76.7% cleavage and 8.7% blastocysts for control oocytes compared to 69.8% and 6.3% respectively for oocytes pretreated with 50 &#61549;M roscovitine). The morphology of the meiotic spindle was typical of metaphase II in 75.8% and 82.1% of the oocytes reaching the metaphase II stage after pretreatment with 50 &#61549;M roscovitine compared to control, respectively. A normal distribution of actin filaments was observed in 97.0% and 98.2% of oocytes exposed to 50 &#61549;M roscovitine compared to control, respectively. These results demonstrate the feasibility of maintaining calf oocytes in artificial meiotic arrest without compromising their subsequent developmental competenceThe third experiment was designed to establish the effects of the meiotic stage of bovine oocytes and of a prematuration treatment with roscovitine (ROS) on their resistance to cryopreservation. Calf oocytes at the stages germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II (MII) were vitrified by the open pulled straw (OPS) method. In another experiment, GVBD oocytes were prematured with 50 &#61549;M ROS before vitrification. After thawing, oocytes in the GVBD and ROS groups underwent an additional 18 h of maturation, while those in the MII group were only subjected to a further 2 h of maturation. After this post-thaw maturation period. Significantly lower cleavage rates were obtained for the vitrified GVBD and MII oocytes (9.9% and 12.6%, respectively) compared to control oocytes (73.9%). Significantly worse results in terms of cleavage rates were obtained when GVBD calf oocytes were exposed to cryoprotectant (CPA) (13.1%) or vitrified (1.6%) after a prematuration treatment with ROS, when compared to untreated control oocytes (68.7%) or ROS-control oocytes (56.6%). None of the vitrification procedures yielded blastocysts, irrespective of the initial meiotic stage or previous prematuration treatment. Significantly lower proportions of oocytes showing a normal spindle configuration were observed after CPA exposure or vitrification of either GVBD or MII calf oocytes, compared to controls. When GVBD oocytes were vitrified, high percentages of dispersed chromosomes were observed, whereas a prematuration treatment before vitrification increased the proportions of decondensed chromosomes. These results indicate that the vitrification protocol has a deleterious effect on the meiotic spindle organization of calf oocytes cryopreserved at both the GVBD and MII stage, which impairs the capacity for further development of the embryos derived from these vitrified oocytes. Prematuration treatment with ROS has no beneficial effect on the outcome of vitrification by the OPS method.

El objetivo de la presente tesis ha sido evaluar la utilización de las gonadotropinas recombinantes humanas (rhFSH y rhLH)) sobre la respuesta superovulatoria en conejas, estudiando el efecto de la utilización de las mismas sobre la calidad de los ovocitos y embriones obtenidos, y sobre la viabilidad embrionaria tras un proceso de crioconservación. Así, en el primer experimento se evaluó el efecto de la aplicación de 25 UI de rhFSH junto con un 0, 5 ó 10% de rhLH sobre el desarrollo de embriones frescos y congelados-descongelados. Se obtuvo una tasa de desarrollo hasta el estadio de blastocisto expandido significativamente mayor en embriones no superovulados frente a los superovulados con rhFSH y 10% de rhLH. En cuanto a la tasa de desarrollo de los embriones congelados-descongelados, fue similar en todos los grupos, alcanzando el estadio de blastocisto expandido el 83,5% de los embriones. Por otra parte, se estudió la evolución de la tasa de ovulación y la respuesta inmunitaria por hembra hasta el cuarto tratamiento de superovulación. Se observó que la tasa de ovulación disminuía a partir del segundo tratamiento mientras que el nivel de anticuerpos anti-FSH circulantes aumentaba a partir de la tercera aplicación del tratamiento de superovulación. En el segundo experimento se estudió cómo afectaba el protocolo de administración y la hormona utilizada en el tratamiento de superovulación a la calidad de los ovocitos producidos, analizando la cantidad de ATP presente en los mismos. Para ello, se comparó la administración cada 24 horas de rhFSH y de FSH porcina diluidas en PVP y la administración cada 12 horas de FSH porcina diluida en suero fisiológico. La concentración de ATP en el grupo de FSH porcina diluida en suero fisiológico fue significativamente menor que en los otros dos grupos de superovulación (5,63±0,14 frente a 6,42±0,13 y 6,19±0,15 para el grupo de rhFSH y pFSH, respectivamente). Esa disminución de la concentración de ATP podría estar relacionada c / Cortell Nicolau, C. (2012). EFECTO DE LA APLICACIÓN DE GONADOTROPINAS RECOMBINANTES HUMANAS SOBRE LA PRODUCCIÓN Y CALIDAD DE OVOCITOS Y EMBRIONES EN CONEJA [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/19091 / Palancia

La producción in vitro (PIV) de embriones caprinos mediante técnicas de maduración, fecundación y cultivo embrionario in vitro (MIV-FIV-CIV) proporciona un elevado número de embriones utilizables a nivel científico y/o comercial. El objetivo del este estudio ha sido seleccionar ovocitos de cabra prepuber y sistemas de maduración in vitro para mejorar la producción in vitro de embriones. Los ovocitos se maduraron en medio TCM199 + piruvato sódico + L-glutamina + gentamicina + 10% suero bovino de macho castrado (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. Tras 27 h de MIV, los ovocitos se inseminaron con semen fresco (3.5x106 espermatozoides/ml) en medio TALP suplementado con 1 mg/ml de hipotaurina. A las 24 h post-inseminación, se cultivaron en medio SOFm y se mantuvieron 7 días en cultivo. En el Estudio 1, se evaluó la utilidad del test de Azul de Cresol Brillante (BCB) para seleccionar los ovocitos de cabras prepúberes. Los ovocitos BCB+ (ovocitos con citoplasma coloreado de azul, crecimiento finalizado) presentaron un mayor diámetro (136.6 ¡À 6.3 mm; P<0.001) y mayores tasas de maduración nuclear (81.4%; P<0.05), fecundación normal (23.5%; P<0.0001) y desarrollo más allá del estadio de 8 células (41.3%; P<0.001) y de mórulas más blastocistos (12.0%; P<0.05) que los ovocitos no coloreados de azul.En el Estudio 2, se utilizó el Factor de Crecimiento Epid¨¦rmico (EGF), para la maduración in vitro. Para ello, se comparó un medio suplementado con hormonas (LH, FSH y 17b-estradiol) y suero (SS o FCS) con un medio suplementado con 10 ng de EGF en ausencia de suero y hormonas. El porcentaje de ovocitos fecundados de forma normal fue inferior (P<0.05) cuando se empleó EGF (17.3%) que SS (SS: 27.2%; FCS: 29.0%). Las tasas de embriones totales (71.5%) y de embriones que superaron el estadio de 8 células (26.2%) fueron superiores (P<0.05) al emplear SS y hormonas en el medio de maduración.En el Estudio 3, se analizó el efecto de la adición de compuestos tiol (100 ¦ÌM de cisteamina, 100 ¦ÌM de b-mercaptoetanol, 0.57 mM de cisteína y 0.57 mM de cistina) al medio de MIV. Los ovocitos madurados en presencia de cisteamina y b-mercaptoetanol mostraron mayor capacidad (P<0.01) para formar el pronúcleo masculino tras la penetración espermítica (88.0% y 97.1%) y para ser fecundados (P<0.01) de forma normal (72.0% y 77.1%) comparados con el grupo control (62.2% y 37.8%, respectivamente). Asimismo, la adición de cisteamina al medio de MIV mejoró (P<0.05) el porcentaje de embriones que alcanzaron los estadios de mórula y blastocisto (22.2%) y la tasa de blastocistos expandidos (13.0%) respecto al grupo control (6.4% y 2.6%, respectivamente). La concentración de GSH intracelular (pmol/ovocito) fue superior en los ovocitos MIV que en los ovocitos inmaduros.En el Estudio 4 se evaluó el efecto de la adición de cisteamina al medio de maduración de ovocitos de cabra prepúber seleccionados mediante el test de Azul de Cresol Brillante (BCB) sobre la maduración nuclear, fecundación y desarrollo embrionario in vitro. En presencia de cisteamina, el porcentaje de ovocitos BCB+ y madirados con cisteamina mejoraron la maduración nuclear, los fecundados normales, la formación del pronucleo masculino y el porcentage de embriones a las 8 celulas, comparados con el control y BCB-. En presencia de cisteamina, la formación de mórulas y blastocistos fue superior (P<0.001) en los ovocitos BCB+ (23.8%). En conclusión, la selección ovocitaria mediante el test de BCB y la MIV en presencia de cisteamina permiten una mayor capacidad de desarrollo tras MIV-FIV-CIV. Sin embargo, a pesar de obtener resultados aceptables en los parámetros de maduración nuclear y de fecundación in vitro, el desarrollo embrionario continúa siendo reducido. / In vitro production (IVP) of caprine embryos using techniques of in vitro maturation, fertilization and embryo culture (IVM-IVF-IVC) provide a high number of embryos.The aim of the present studies has been the establishment of a system of selection and in vitro maturation of oocytes adequate for competence to develop until blastocyst after in vitro fertilization and embryo culture. For this, oocytes were matured in TCM199 + sodium pyruvate + L-glutamine + gentamicine + 10% steer serum (SS) + 10 mg/ml LH + 10 mg/ml o-FSH + 1 mg/ml 17b-estradiol. After 27 h of IVM, the oocytes were inseminated with fresh sperm (3.5x106 sperm/ml) in TALP medium supplemented with 1 mg/ml hypotaurine. A t 24 h post-insemination, the presuntive zygotes were cultued in SOFm medium and were maintained 7 days in culture. In Study 1, the utility of the Brilliant Cresyl Blue (BCB) test was evaluated . The BCB+ oocytes (oocytes with blue coloured cytoplasm, fully-grown oocytes) presented a bigger diameter(136.6 ¡À 6.3 mm; P<0.001) and higher rates of nuclear maturation (81.4%; P<0.05), normal fertilization (23.5%; P<0.0001), development beyond the 8-cell stage (41.3%; P<0.001) and morulae plus blastocyts (12.0%; P<0.05) .In Study 2, the use of an chemically defined medium, based in Epidermal Growth Factor (EGF) for the in vitro maturation of prepubertal goat oocytes was investigated. A medium supplemented with hormones and serum (SS or FCS) was compared with a medium with 10 ng EGF. The percentage of normally fertilized oocytes was lower when EGF (17.3%) was employed (SS: 27.2%; FCS: 29.0%). The rate of total embryos (71.5%) and embryos that developed beyond the 8-cell stage (26.2%) were higher (P<0.05) when SS and hormones was used. In Study 3, the effect of the addition of thiol compounds (100 ¦ÌM cysteamine, 100 ¦ÌM b-mercaptoethanol, 0.57 mM cysteine and 0.57 mM cystine) to the IVM medium was analyzed. The oocytes matured in the presence of cysteamine and b-mercaptoethanol showed a better ability to form the MPN and to be normally fertilized (P<0.01; 72.0% y 77.1%) compared to the control group. The addition of cysteamine to the IVM medium improved the percentage of embryos that reached the m¨®rula plus blastocyst stage (22.2%) and the expanded blastocyst formation rate (13.0%) related to the control group. The intracellular GSH concentration (pmol/oocyte), was higher in the oocytes tIVM than immature oocytes. In Study 4, the addition of cysteamine to the IVM medium of oocytes selected by the Brilliant Cresyl Blue (BCB) was studied. The control group oocytes, no exposed to the BCB test, were matured in the same medium, but without cysteamine. In the presence of cyteamine, the percentage of oocytes that matured nuclearly was of BCB+ oocytes (89.5%)., while this rate was higher in the presence of cysteamine (77.8%). 97.0% of the penetrated oocytes exhibited ability to form MPN and a 69.7% were able to develop the 2 pronuclei, being these percentages significantly higher. The exposed oocytes to the BCB with cysteamine showed a lower percentage of non-decondensed heads (3.0%) than the control group (25.6%). Embryos developed beyond the 8-cell stage was higher in the BCB+ (68.3%). Likewise, in the presence of cysteamine, the morule plus blastocysts formation rate was higher (P<0.001) in the BCB+ oocytes (23.8%) related to the BCB- oocytes (5.1%). In conclusion, oocytes selection using the BCB test and the IVM in the presence of cysteamine allow a better development ability after IVM-IVF-IVC. In the present studies, we have been able to confirm an improvement in the oocytes development in relation with the initial IVM system, acting on growing and final maturation phases.

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