VASCONCELOS, G. L. Efeitos do fator de crescimento e diferenciação-9 e do hormônio folículo estimulante sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais bovinos. 2012. 93 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2012. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T14:29:51Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_glvasconcelos.pdf: 1200212 bytes, checksum: a407d9f70fa82b6a4fd6ccd68998217d (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-29T14:30:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_glvasconcelos.pdf: 1200212 bytes, checksum: a407d9f70fa82b6a4fd6ccd68998217d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T14:30:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_glvasconcelos.pdf: 1200212 bytes, checksum: a407d9f70fa82b6a4fd6ccd68998217d (MD5) Previous issue date: 2012 / The results show that after 6 days of culture, FSH alone or associated with GDF-9 increased follicular diameter in relation to control medium. Moreover, after 12 days of culture, FSH promoted an increase in follicular diameter, while the association of FSH with GDF-9 significantly reduced follicular diameter when compared with follicles cultured in MEM plus FSH. Furthermore, FSH and GDF-9 increased the antrum formation after 12 days of culture (P<0.05). Despite GDF-9 had significantly reduced the levels of mRNA for HAS 1 when compared to MEM, this factor has increased the levels of versican and perlecan. In addition, the presence of both FSH and GDF-9 increased mRNA levels for HAS 2, but reduced level those for PCNA. In addition, FSH also acts by reducing mRNA levels for PCNA. In conclusion, FSH and/or GDF-9 promotes the follicular growth and antrum formation, and GDF-9 stimulates the expression of versican and perlecan and interact positively with FSH to the increased expression of HAS 2 / O objetivo deste estudo foi determinar o papel do GDF-9 sozinho ou em combinação com FSH sobre a viabilidade, crescimento e expressão do RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, versican e perlecan em Folículos secundários bovinos cultivados in vitro. Para estudos in vitro, folículos secundários bovinos foram isolados e cultivados por doze dias, na presença de MEM sozinho ou suplementado com GDF-9 (200 g/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL e de D7-D12: 500 ng/mL) ou ambos. Diâmetro folicular, viabilidade e formação de antro foram avaliados durante o cultivo. Para avaliar os níveis de RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, Perlecan e versican em folículos após 12 dias de cultivo, o RNA total foi extraído e o cDNA foi sintetizado. Os níveis de RNAm foram quantificados por PCR em tempo real. O teste Kruskal-Wallis foi usado para comparar o diâmetro folicular. O teste Qui-quadrado foi utilizado para comparar a porcentagem de viabilidade e formação de antro de folículos após o cultivo in vitro (p<0,05), enquanto ANOVA seguido pelo teste de Tukey foram utilizados para avaliar os dados de expressão do RNAm nos folículos cultivados (p<0,05). Os resultados mostram que após 6 dias de cultivo, FSH sozinho ou associado com GDF-9 aumentaram o diâmetro folicular em relação ao meio controle. Além disso, após 12 dias de cultivo, FSH promoveu um aumento no diâmetro folicular, enquanto a associação de FSH com GDF-9 reduziu significativamente o diâmetro folicular quando comparado com folículos cultivados em MEM acrescido de FSH. Além disso, FSH e GDF-9 aumentaram a formação de antro após 12 dias de cultivo (P<0,05). Apesar de GDF-9 ter reduzido significativamente os níveis de RNA para HAS 1 quando comparado ao MEM, esse fator aumentou os níveis de versican e perlecan. Além disso, a presença de ambos FSH e GDF-9 aumentaram os níveis de RNAm para HAS 2, porém, reduziu os níveis de RNAm para PCNA. Além disso, FSH também atua reduzindo os níveis de RNAm para o PCNA. Em conclusão, FSH e/ou GDF-9 promovem o crescimento folicular e formação de antro, e GDF-9 estimula a expressão de versican e perlecan e interage positivamente com FSH para o aumento da expressão de HAS 2.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Factor de Crecimiento Diferencial 9 (GDF9) cumple un rol esencial en el desarrollo ovocitario de los mamíferos, sin embargo, en ovocitos caninos se desconoce su presencia y participación durante la maduración. En este estudio, se evaluó la presencia de GDF9 en ovocitos de perra madurados in vitro (MIV) y su relación con la expansión del cúmulo, para lo cual complejos cúmulo ovocito (COC’s) se cultivaron por 0, 48, 72 y 96 h. Posteriormente, algunos COC’s fueron desprendidos del cúmulo. De este modo, ovocitos sin células del cúmulo y COC’s se procesaron para su evaluación a través de Inmunofluorescencia Indirecta y Western blot con el anticuerpo anti GDF9 humano. Con ambas técnicas, la proteína se detectó principalmente en el ovocito y en menor proporción en las células del cúmulo. Además, en ambos tipos celulares, la detección de GDF9 disminuyó a medida que progresó el tiempo de cultivo. En ovocitos denudados y COC’s, se detectó una banda de ~56 kDa correspondiente a la pro-proteína en todos los tiempos de maduración. Sin embargo, sólo en COC’s no madurados y MIV por 48 h se detectaron dos bandas de proteína madura de ~18 y 19 kDa. Finalmente, se observó una relación inversa entre la expansión del cúmulo durante la MIV y la detección de GDF9 por Western blot. Por consiguiente, GDF9 está presente en ovocitos de perra y tendría participación en los procesos iniciales del crecimiento y desarrollo ovocitario / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1110265

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O objetivo deste estudo foi investigar os nÃveis de RNA mensageiro (RNAm) para ativina-A em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos e os efeitos do hormÃnio folÃculo estimulante (FSH), ativina-A e fator de crescimento e diferenciaÃÃo - 9 (GDF-9) sobre o crescimento e a expressÃo de RNAm para ativina-A, GDF-9, proteÃna morfogenÃtica Ãssea (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 e receptor de FSH (R-FSH) em folÃculos prÃ-antrais caprinos cultivados in vitro. Inicialmente, folÃculos primordiais, primÃrios e secundÃrios, bem como complexos cumulus-oÃcito (COCs) e cÃlulas da granulosa mural/teca de pequenos e grandes folÃculos antrais foram isoladas mecanicamente a partir de ovÃrios de cabra e a expressÃo de RNAm para ativina-A foi avaliada por PCR em tempo real. Para os estudos in vitro, folÃculos secundÃrios caprinos foram isolados e cultivados por 6 dias na presenÃa de FSH sozinho (50 ng/mL) ou em combinaÃÃo com ativina-A (100 ng/mL) ou GDF-9 (200 ng/mL). Isoladamente ou em combinaÃÃo com FSH, a influÃncia de ativina-A na expressÃo de ativina-A e R-FSH, e o efeito do GDF-9 sobre os nÃveis de RNAm para GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4 , -6, -7 e -15 em folÃculos secundÃrios apÃs 6 dias de cultivo foram testados. Para isso, apÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese do cDNA, os nÃveis de RNAm para ativina-A, GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4, -6, -7 e -15 foram quantificados por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que folÃculos secundÃrios apresentavam nÃveis menores de RNAm para ativina-A comparado aos folÃculos primÃrios (p<0,05). NÃo houve diferenÃa nos nÃveis de RNAm para ativina-A entre folÃculos primordial e primÃrio ou secundÃrio (p>0,05). Aliado a isso, nÃo houve diferenÃa entre COCs de pequenos e grandes folÃculos antrais (p>0,05). AlÃm disso, as cÃlulas da granulosa e da teca de grandes folÃculos antrais apresentaram maiores nÃveis de RNAm para ativina-A do que de pequenos folÃculos antrais (p<0,05). Quando comparamos a expressÃo do RNAm para ativina-A entre COCs de pequenos e grandes folÃculos antrais e suas cÃlulas da granulosa e da teca, nenhuma diferenÃa nos nÃveis de expressÃo foi observada (p>0,05). ApÃs o cultivo in vitro de folÃculos secundÃrios, a presenÃa de FSH sozinho ou associado com ativina-A ou GDF-9 aumentou a sobrevivÃncia, crescimento folicular e formaÃÃo de antro (p<0,05). O FSH tambÃm aumentou o RNAm para ativina-A, enquanto os folÃculos cultivados com ativina-A apresentaram nÃveis aumentados de RNAm para R-FSH (p<0,05). AlÃm disso, o GDF-9 diminuiu a expressÃo de RNAm para BMP -2 e -15 (p<0,05), mas nÃo teve efeito sobre a expressÃo de BMP -4, -6 e -7 (p>0,05). Em conclusÃo, durante a transiÃÃo de folÃculo primÃrio para secundÃrio hà uma diminuiÃÃo do RNAm para ativina-A, enquanto ocorre um aumento da expressÃo deste fator durante o crescimento de folÃculos antrais. FSH, ativina-A e GDF-9 estimulam o crescimento de folÃculos secundÃrios caprinos apÃs 6 dias de cultivo. ApÃs cultivo folicular, FSH controla a expressÃo de ativina-A e a expressÃo do R-FSH à regulada por ativina-A. Ainda, GDF-9 reduz a expressÃo do RNAm para BMP -2 e -15. / The aim of this study was to investigate the levels of messenger RNA (mRNA) for activin-A on goat preantral and antral follicles and the effects of follicle stimulating hormone (FSH), activin-A and growth and differentiation factor - 9 (GDF-9) on growth and mRNA expression for activin-A, GDF-9, bone morphogenetic protein (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 and FSH receptor (FSH-R) in goat preantral follicles cultured in vitro. Initially, primordial, primary and secondary follicles, as well as cumulus-oocyte complexes (COCs) and mural granulosa/theca cells of small and large antral follicles were isolated mechanically from goat ovaries and the expression of mRNA for activin-A was evaluated by real-time PCR. For in vitro studies, goat secondary follicles were isolated and cultured for 6 days in the presence of FSH alone (50 ng/mL) or in combination with activin-A (100 ng/mL) or GDF-9 (200 ng/mL). Alone or in combination with FSH, the influence of activin-A on expression of activin-A and FSH-R, and the effect of GDF-9 on the levels of mRNA for GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 in secondary follicles after 6 days of culture were tested. For this, after extraction of total RNA and cDNA synthesis, the levels of mRNA for activin-A, GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 were quantified by real time PCR. The results showed that secondary follicles had lower levels of mRNA for activin-A, than compared to primary follicles (p<0.05). There was no difference in levels of mRNA for activin-A between primordial and primary or secondary (p>0.05). Allied to this, there was no difference between COCs of small and large antral follicles (p>0.05). Moreover, granulosa and theca cells of large antral follicles showed higher levels of mRNA for activin-A than in small antral follicles (p<0.05). When comparing mRNA expression for activin-A between COCs from small and large antral follicles and their granulosa and theca cells, no difference in expression levels was observed (p>0.05). After in vitro culture of secondary follicles, the presence of FSH either alone or associated with activin-A or GDF-9 increased survival, follicular growth and antrum formation (p<0.05). The FSH increased mRNA for activin-A, while the follicles cultured with activin-A showed increased levels of mRNA for FSH-R (p<0.05). In addition, GDF-9 decreased mRNA expression for BMP -2 and -15 (p<0.05), but had no effect on expression of BMP -4, -6, and -7 (p>0.05). In conclusion, during the transition from primary to secondary follicles there is a reduction of mRNA for activin-A, whereas there is an increased expression of this factor during the growth of antral follicles. FSH, activin-A and GDF-9 stimulate growth of goat secondary follicles after 6-day culture. After follicle culture FSH controls the expression of activin-A, and the expression of FSH-R is regulated by activin-A. Furthermore, GDF-9 reduces the mRNA expression for BMP-2 and -15.

O objetivo deste estudo foi determinar o papel do GDF-9 sozinho ou em combinaÃÃo com FSH sobre a viabilidade, crescimento e expressÃo do RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, versican e perlecan em folÃculos secundÃrios bovinos cultivados in vitro. Para estudos in vitro, folÃculos secundÃrios bovinos foram isolados e cultivados por doze dias, na presenÃa de MEM sozinho ou suplementado com GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL e de D7-D12: 500 ng/mL) ou ambos. DiÃmetro folicular, viabilidade e formaÃÃo de antro foram avaliados durante o cultivo. Para avaliar os nÃveis de RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, perlecan e versican em folÃculos apÃs 12 dias de cultivo, o RNA total foi extraÃdo e o cDNA foi sintetizado. Os nÃveis de RNAm foram quantificados por PCR em tempo real. O teste Kruskal-Wallis foi usado para comparar o diÃmetro folicular. O teste Qui-quadrado foi utilizado para comparar a porcentagem de viabilidade e formaÃÃo de antro de folÃculos apÃs o cultivo in vitro (p<0,05), enquanto ANOVA seguido pelo teste de Tukey foram utilizados para avaliar os dados de expressÃo do RNAm nos folÃculos cultivados (p<0,05). Os resultados mostram que apÃs 6 dias de cultivo, FSH sozinho ou associado com GDF-9 aumentaram o diÃmetro folicular em relaÃÃo ao meio controle. AlÃm disso, apÃs 12 dias de cultivo, FSH promoveu um aumento no diÃmetro folicular, enquanto a associaÃÃo de FSH com GDF-9 reduziu significativamente o diÃmetro folicular quando comparado com folÃculos cultivados em MEM acrescido de FSH. AlÃm disso, FSH e GDF-9 aumentaram a formaÃÃo de antro apÃs 12 dias de cultivo (P<0,05). Apesar de GDF-9 ter reduzido significativamente os nÃveis de RNA para HAS 1 quando comparado ao MEM, esse fator aumentou os nÃveis de versican e perlecan. AlÃm disso, a presenÃa de ambos FSH e GDF-9 aumentaram os nÃveis de RNAm para HAS 2, porÃm, reduziu os nÃveis de RNAm para PCNA. AlÃm disso, FSH tambÃm atua reduzindo os nÃveis de RNAm para o PCNA. Em conclusÃo, FSH e/ou GDF-9 promovem o crescimento folicular e formaÃÃo de antro, e GDF-9 estimula a expressÃo de versican e perlecan e interage positivamente com FSH para o aumento da expressÃo de HAS 2. / The aim of this study was to determine the role of GDF-9 alone or in combination with FSH on growth, viability and on the mRNA expression of PCNA, HAS 1, HAS 2, versican and perlecan in bovine secondary follicles cultured in vitro. For in vitro studies, bovine secondary follicles were isolated and cultured for twelve days in the presence of MEM alone or supplemented with GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL and of D7-D12: 500 ng/mL) or both. Follicular diameter, viability and antrum formation were evaluated during culture. To evaluate the mRNA levels for PCNA, perlecan, versican, HAS 1 and 2 in follicles after 12 days of culture, total RNA was extracted and cDNA was synthesized. The levels of mRNA were quantified by real time PCR. Kruskal-Wallis test were used to compare the follicular diameter. The chi-square test was used to compare the percentage of viability and antrum formation of follicles after in vitro culture (p<0.05), whereas ANOVA followed by Tukey's test were used to evaluate the mRNA expression data in cultured follicles (p<0.05). The results show that after 6 days of culture, FSH alone or associated with GDF-9 increased follicular diameter in relation to control medium. Moreover, after 12 days of culture, FSH promoted an increase in follicular diameter, while the association of FSH with GDF-9 significantly reduced follicular diameter when compared with follicles cultured in MEM plus FSH. Furthermore, FSH and GDF-9 increased the antrum formation after 12 days of culture (P<0.05). Despite GDF-9 had significantly reduced the levels of mRNA for HAS 1 when compared to MEM, this factor has increased the levels of versican and perlecan. In addition, the presence of both FSH and GDF-9 increased mRNA levels for HAS 2, but reduced level those for PCNA. In addition, FSH also acts by reducing mRNA levels for PCNA. In conclusion, FSH and/or GDF-9 promotes the follicular growth and antrum formation, and GDF-9 stimulates the expression of versican and perlecan and interact positively with FSH to the increased expression of HAS 2

Philosophiae Doctor - PhD / The aim of this thesis is first, to evaluate various culture conditions to improve embryo development, and secondly, to analyze spent culture media for any biomarkers that may be predictive of embryo health. Single-step and sequential culture media were compared in both Planer and EmbryoScope™ incubators. Single-step media resulted in better blastocyst development compared to sequential media and the EmbryoScope™ incubation system showed slight improvements in embryo development than the Planer system. The benefits of supplementing the culture medium with either insulin or insulin-like growth factor 1 (IGF-1) or culturing in a 2% O2 environment, using two different strains of mice (hybrid and C57), as well as the suitability of these strains for quality control were compared. In insulin, hybrid embryos were slower to blastulate and had a lower blastocyst rate, whereas C57 embryos were slower to the morula and faster to blastocyst stages, and lower blastocyst rate than the controls. IGF-1 showed no difference in time-lapse morphokinetics (TLM) or blastocyst rates compared to controls in both hybrid and C57 embryos. Under 2% O2, hybrid embryos showed no significant difference in TLM up to the 8-cell stage, but slowed down afterwards, resulting in blastocysts with significantly lower cell counts than the 6% O2 group. The C57 embryos were slower to reach morula and expanded blastocyst, and had lower blastocyst rates in 2%O2 vs 6%O2. The C57 strain had significant slower overall embryo development for all time points than hybrid embryos in insulin, IGF-1 and ultra-low O2, as well as lower blastocyst rates. Measurement of growth differentiation factor 9 (GDF-9) and oxidation-reduction potential (ORP) in spent media as markers for embryo health were evaluated. Day 5 human blastocysts yielded higher pregnancy rates and GDF-9 levels in spent media compared to Day 6 blastocysts, but TLM parameters showed no impact on pregnancy outcome. In Day 6 blastocysts, the non-pregnant group showed significantly faster embryo development compared to the clinically pregnant group up to the 8-cell stage and start of blastulation. GDF-9 did not show any significant differences between non-pregnant and pregnant groups of Day 5 or Day 6 embryo transfers. ORP in spent media from good quality Day 3 embryos that developed into blastocysts were significantly higher than from those that did not, with no difference in control medium ORP. Spent media from arrested embryos showed lower ORP than their corresponding controls. Arrested embryos had slower development at syngamy, morula, blastulation and blastocyst stages. The single step medium in the EmbryoScope™ is the preferred choice for embryo culture. Insulin or IGF-1 media supplementation or 2% O2 culture did not provide any benefit to embryo development. The C57 mouse strain is more sensitive and may be better to detect changes in culture conditions, and therefore better model for quality control assays. GDF-9 values decrease from Day 5 to Day 6 which gives new insight to understanding the role of GDF-9 during embryogenesis. ORP in spent media indicate that embryos that developed into blastocysts did not contribute to ROS, but maintained ORP balance.