O objetivo deste estudo foi determinar o papel do GDF-9 sozinho ou em combinaÃÃo com FSH sobre a viabilidade, crescimento e expressÃo do RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, versican e perlecan em folÃculos secundÃrios bovinos cultivados in vitro. Para estudos in vitro, folÃculos secundÃrios bovinos foram isolados e cultivados por doze dias, na presenÃa de MEM sozinho ou suplementado com GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL e de D7-D12: 500 ng/mL) ou ambos. DiÃmetro folicular, viabilidade e formaÃÃo de antro foram avaliados durante o cultivo. Para avaliar os nÃveis de RNAm para PCNA, HAS 1, HAS 2, perlecan e versican em folÃculos apÃs 12 dias de cultivo, o RNA total foi extraÃdo e o cDNA foi sintetizado. Os nÃveis de RNAm foram quantificados por PCR em tempo real. O teste Kruskal-Wallis foi usado para comparar o diÃmetro folicular. O teste Qui-quadrado foi utilizado para comparar a porcentagem de viabilidade e formaÃÃo de antro de folÃculos apÃs o cultivo in vitro (p<0,05), enquanto ANOVA seguido pelo teste de Tukey foram utilizados para avaliar os dados de expressÃo do RNAm nos folÃculos cultivados (p<0,05). Os resultados mostram que apÃs 6 dias de cultivo, FSH sozinho ou associado com GDF-9 aumentaram o diÃmetro folicular em relaÃÃo ao meio controle. AlÃm disso, apÃs 12 dias de cultivo, FSH promoveu um aumento no diÃmetro folicular, enquanto a associaÃÃo de FSH com GDF-9 reduziu significativamente o diÃmetro folicular quando comparado com folÃculos cultivados em MEM acrescido de FSH. AlÃm disso, FSH e GDF-9 aumentaram a formaÃÃo de antro apÃs 12 dias de cultivo (P<0,05). Apesar de GDF-9 ter reduzido significativamente os nÃveis de RNA para HAS 1 quando comparado ao MEM, esse fator aumentou os nÃveis de versican e perlecan. AlÃm disso, a presenÃa de ambos FSH e GDF-9 aumentaram os nÃveis de RNAm para HAS 2, porÃm, reduziu os nÃveis de RNAm para PCNA. AlÃm disso, FSH tambÃm atua reduzindo os nÃveis de RNAm para o PCNA. Em conclusÃo, FSH e/ou GDF-9 promovem o crescimento folicular e formaÃÃo de antro, e GDF-9 estimula a expressÃo de versican e perlecan e interage positivamente com FSH para o aumento da expressÃo de HAS 2. / The aim of this study was to determine the role of GDF-9 alone or in combination with FSH on growth, viability and on the mRNA expression of PCNA, HAS 1, HAS 2, versican and perlecan in bovine secondary follicles cultured in vitro. For in vitro studies, bovine secondary follicles were isolated and cultured for twelve days in the presence of MEM alone or supplemented with GDF-9 (200 ng/mL), FSH (D0-D6: 100 ng/mL and of D7-D12: 500 ng/mL) or both. Follicular diameter, viability and antrum formation were evaluated during culture. To evaluate the mRNA levels for PCNA, perlecan, versican, HAS 1 and 2 in follicles after 12 days of culture, total RNA was extracted and cDNA was synthesized. The levels of mRNA were quantified by real time PCR. Kruskal-Wallis test were used to compare the follicular diameter. The chi-square test was used to compare the percentage of viability and antrum formation of follicles after in vitro culture (p<0.05), whereas ANOVA followed by Tukey's test were used to evaluate the mRNA expression data in cultured follicles (p<0.05). The results show that after 6 days of culture, FSH alone or associated with GDF-9 increased follicular diameter in relation to control medium. Moreover, after 12 days of culture, FSH promoted an increase in follicular diameter, while the association of FSH with GDF-9 significantly reduced follicular diameter when compared with follicles cultured in MEM plus FSH. Furthermore, FSH and GDF-9 increased the antrum formation after 12 days of culture (P<0.05). Despite GDF-9 had significantly reduced the levels of mRNA for HAS 1 when compared to MEM, this factor has increased the levels of versican and perlecan. In addition, the presence of both FSH and GDF-9 increased mRNA levels for HAS 2, but reduced level those for PCNA. In addition, FSH also acts by reducing mRNA levels for PCNA. In conclusion, FSH and/or GDF-9 promotes the follicular growth and antrum formation, and GDF-9 stimulates the expression of versican and perlecan and interact positively with FSH to the increased expression of HAS 2

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Este trabalho tem como objetivo avaliar a estabilidade de genes de referÃncia e a expressÃo de fatores de crescimento e de receptores de hormÃnios em folÃculos secundÃrios de caprinos. AlÃm disso, visa quantificar a expressÃo dos RNA mensageiros para BMP-6 e BMP-7 em folÃculos prÃ-antrais e antrais caprinos e avaliar os efeitos de FSH, BMP-6 e BMP-7 sobre o crescimento e expressÃo gÃnica em folÃculos secundÃrios caprinos durante 6 dias de cultivo. Para avaliar a estabilidade dos genes de referÃncia, folÃculos secundÃrios (150-200 Âm) foram isolados mecanicamente de ovÃrios caprinos. ApÃs a extraÃÃo do RNA total e sÃntese de DNA complementar, realizou a quantificaÃÃo dos mRNA, por PCR em tempo real, utilizando-se primers especÃficos para genes de referÃncia (GAPDH, &#946;-tubulina, &#946;-actina, PGK, UBQ, RPL-19, rRNA18S), fatores de crescimento (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL e IGF-1) e receptores de hormÃnio (FSH-R, LH-R e GH-R). Para avaliar a expressÃo de BMP-6 e BMP-7, folÃculos primordiais, primÃrios e secundÃrios, bem como pequenos e grandes folÃculos antrais foram obtidos e os nÃveis de mRNA de BMP-6 e 7 foram quantificados. Nos estudos in vitro, os efeitos da BMP-6 (50 ng/mL) e BMP-7 (50 ng/mL) na presenÃa ou ausÃncia de FSH (50 ng/mL) sobre o desenvolvimento in vitro de folÃculos secundÃrios e sobre a expressÃo de mRNA para BMP-6 e 7 e FSH-R foi avaliada apÃs 6 dias de cultivo. Os resultados mostraram que UBQ e &#946;-actina sÃo os genes de referÃncia mais estÃveis em folÃculos prÃ-antrais caprinos fresco cultivados por 12 dias. Os RNAs mensageiros para os fatores de crescimento (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 e KL) e os receptores de FSH, LH e GH sÃo expressos em diferentes nÃveis em folÃculos prÃ-antrais de caprinos, sendo que o IGF-1 e o EGF apresentaram, respectivamente, o maior e o menor nÃvel de mRNA. O nÃvel de mRNA para BMP-6 em folÃculos primÃrios e secundÃrios foi significativamente maior do que aqueles em primordial, enquanto que os nÃveis de mRNA para BMP-7 foi maior nas cÃlulas da granulosa/teca de grandes do que nos pequenos folÃculos antrais. ApÃs o cultivo de folÃculos secundÃrios durante 6 dias, FSH aumentou o diÃmetro folicular e FSH e BMP-7 aumentou significativamente os nÃveis de mRNA para BMP-7 e FSH-R. Jà a BMP-6 na presenÃa ou ausÃncia de FSH aumentou o diÃmetro dos folÃculos secundÃrios. AlÃm disso, FSH aumentou os nÃveis de mRNA para BMP-6, enquanto ambos BMP-6 e FSH e aumentaram os nÃveis de mRNA para FSH-R, apÃs o perÃodo de cultivo. Em conclusÃo, UBQ e &#946;-actina sÃo os dois genes mais estÃveis para folÃculos secundÃrios caprinos e o FSH e as BMPs dos tipos 6 e 7 estimulam o crescimento de folÃculos prÃ-antrais in vitro durante 6 dias de cultivo. / This study aims to evaluate the stability of reference genes and the expression of growth factors and hormone receptors in goat secondary follicles. It also seeks to quantify the expression of messenger RNA for BMP-6 and BMP-7 in goat preantral follicles and to evaluate the effects of FSH, BMP-6 and BMP-7 on growth and gene expression in secondary follicles goats after 6 days of culture. To evaluate the stability of reference genes, secondary follicles (150-200 &#956;m) were mechanically isolated from goat ovaries. After extraction of total RNA and synthesis of complementary DNA, the quantification of mRNA was carried out by real-time PCR using specific primers for genes of reference (GAPDH, &#946;-tubulin, &#946;-actin, PGK, UBQ, RPL - 19, rRNA18S), growth factors (GDF-9, BMP-15, BMP-6, FGF-2, VEGF, KL and IGF-1) and hormone receptor (FSH-R, LH-R and GH-R). To evaluate expression of BMP-6 and BMP-7, primordial follicles, primary and secondary as well as small and large antral follicles were obtained and the mRNA levels of BMP-6 and 7 were measured. For in vitro studies, the effects of BMP-6 (50 ng / mL) and BMP-7 (50 ng / mL) in the presence or absence of FSH (50 ng / mL) on the development of secondary follicles and on the expression of mRNA for BMP-6 and 7 and FSH-R was evaluated after 6 days of culture. Results showed that mRNA for growth factors (EGF, GDF-9, BMP-15, VEGF, FGF-2, BMP-6, IGF-1 and KL) and the receptors for FSH, LH and GH are expressed in at different levels in preantral follicles of goats. Moreover, among the growth factors studied, IGF-1 and EGF had higher and lower levels or RNA, respectively. UBQ and &#946;-actin genes were the mostr stable reference in fresh and cultured preantral follicles. The level of mRNA for BMP-6 in primary and secondary follicles was significantly higher than those in primordial follicles, while the levels of mRNA for BMP-7 was higher in granulosa cells / theca in large antral follicles than in small antral follicles. After culture of secondary follicles for 6 days, FSH increased follicular diameter and FSH and BMP-7 significantly increased the levels of mRNA for BMP- 7 and FSH-R. In addition, BMP-6 in the presence or absence of FSH increased the diameter of secondary follicles after 6 days of culture. Real-time PCR shoed that FSH increased the levels of mRNA for BMP-6, while both BMP-6 and FSH and increased levels of mRNA for FSH-R, after a period of 6 days of culture. In conclusion, UBQ and &#946;-actin are the two most stable genes for secondary follicles goats and FSH and BMPs of types 6 and 7 stimulate the growth of preantral follicles after 6 days of in vitro culture.