Chez les vertébrés, les neurones qui contactent le LCR (NcLCR) sont présents autour des cavités ventriculaires et tout le long du canal central (cc). Par la combinaison d'enregistrements électrophysiologiques sur tranche de tronc cérébral et d'analyses immunohistochimiques, nous avons réalisé la première caractérisation de cette population neuronale chez la souris adulte. Nous montrons que les NcLCR sont présents autour du cc au niveau du complexe vagal dorsal (CVD), une structure bulbaire impliquée dans la régulation des fonctions autonomes, où ils sont principalement GABAergiques, reçoivent des afférences synaptiques GABA/Glycinergiques et expriment le canal PKD2L1 ("polycystin kidney disease 2-like 1"), un membre de la famille des canaux TRP ("transient receptor potential"). Nous montrons que l'activité de PKD2L1 est modulée par les variations de pH et d'osmolarité et que son augmentation module l'excitabilité des NcLCR. Finalement, nous démontrons que les NcLCR existent dans un état de maturité intermédiaire caractérisé par propriétés fonctionnelles de neurones matures combinées à la conservation de l'expression de marqueurs d'immaturités.Les NcLCR étant stratégiquement positionné entre le LCR et le parenchyme, ils pourraient détecter des signaux circulant grâce à l'activation de PKD2L1 puis distribuer le message collecté à leurs partenaires. Un tel rôle, apparaît particulièrement intéressant au niveau du CVD, un site de régulation majeur des fonctions autonomes et pourrait être démontré par l'identification du réseau neuronal où les NcLCR sont intégrés. / In vertebrates, cerebrospinal fluid contacting neurons (CSF-cN) are present around the ventricular cavities and along the central canal (cc). In this study, by the combination of whole cell patch-clamp recordings on brainstem slice and immunohistochemistry analysis, we realize the first characterization of this neuronal population in adult mice. We show that CSF-cN are present around the cc in the dorsal vagal complex (DVC), a major hindbrain structure regulating autonomic functions. There, CSF-cN are mostly GABAergics, receive GABA- and glycinergic synaptic entries and express functional polycystin kidney disease 2-like 1 (PKD2L1) channels. These channels are a subtype of the transient receptor potential (TRP) channels superfamily and this study represent the first analysis of PKD2L1 properties in a native system. We show that PKD2L1 channel activity is modulated by variations in extracellular pH and osmolarity and in turn, an enhanced activity of only few PKD2L1 channels participates in the modulation of CSF-cN excitability. Finally, we demonstrate that CSFcN exhibit another interesting property since they exist in an intermediate stage of maturity by displaying many mature functional properties combined to the conservation of the expression of immature markers.Because CSF-cN are strategically positioned between CSF and parenchyma, they could detect circulating signals through PKD2L1 activation and convey the collected messages to cellular partners. Such a role might be particularly relevant at the level of the DVC a major regulatory site for autonomic functions and should be demonstrated by identifying and characterizing the neuronal network CSFcN are involved in.

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire auto-immune du SNC qui affecte 90 000 personnes en France et génère un coût important pour la société. La forme la plus fréquente (85% des cas) est la SEP récurrente-rémittente (RRMS) caractérisée par des poussées démyélinisantes entrecoupées de périodes de rémission après un syndrome cliniquement isolé (CIS). La conversion en RRMS après un CIS, caractérisée par une nouvelle poussée ou de nouvelles lésions sur les IRM de suivi, survient après un délai variant de quelques mois à plus de 10 ans (20% des cas, « SEP bénigne »). Les traitements disponibles (immunomodulateurs et immunosuppresseurs) ont une efficacité indéniable pour la prévention des poussées et doivent être initiés dès le diagnostic pour une efficacité maximale, surtout chez les patients montrant une conversion rapide en SEP après un CIS. Leur intérêt est en revanche négligeable pour les formes bénignes. Ainsi, il existe un besoin d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces de la SEP pour une prise en charge optimale des patients. Le but de ma thèse est d’identifier des biomarqueurs pronostiques de SEP en utilisant différentes approches de protéomique quantitative,. Dans un premier temps, nous avons utilisé des échantillons cliniques de LCR de patients. Ces travaux m’ont permis d’identifier, en protéomique quantitative utilisant un marquage chimique des peptides (TMT), plusieurs candidats biomarqueurs de SEP. Ceux-ci incluent deux chitinase-3-like protéines, CHI3L1 et CHI3L2 dont le taux mesuré en ELISA, dans le LCR, augmente avec l’évolution de la maladie. Ces travaux ont également démontré que la concentration sanguine de CHI3L1 constituait un biomarqueur de la progression de la maladie. Dans un second temps, nous avons combiné l’analyse du LCR de différents patients SEP et contrôles en protéomique Label-Free avec un modèle préclinique analysant les modifications du sécrétome d’oligodendrocytes murins en culture primaire par approche SILAC. Les biomarqueurs potentiels, 87 protéines correspondant à 226 peptides cibles, ont été ensuite vérifiés en protéomique quantitative ciblée ou parallel reaction monitoring (PRM), à l’aide de peptides marqués servant de référence. Les 11 candidats les plus discriminants issus de cette étape ont ensuite été vérifiés en PRM sur une cohorte plus large d’échantillons de patients. Finalement, 7 candidats ont montré un profil significatif au cours de cette première validation. Ces candidats biomarqueurs permettent notamment de discriminer les différentes formes évolutives de la SEP et de distinguer cette pathologie d’autres maladies inflammatoires et neurologiques. De plus, ces derniers pourraient avoir un intérêt prognostique permettant d’identifier les patients qui vont développer une SEP après la découverte fortuite de lésions typiques de la maladie à l’IRM. Ce travail de thèse a donc caractérisé de nouveaux biomarqueurs de SEP devant être validés sur de larges cohortes multicentriques de patients et ouvre de nouvelles perspectives sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la SEP. / Discovery, confirmation and verification of candidate biomarkers for multiple sclerosis diagnosis and prognosis in cerebrospinal fluid.Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory disease of the central nervous system. Most often the disease initiates by a first demyelinating event called clinically isolated syndrome (CIS), followed by remission periods and relapses occurring at irregular intervals. Clinical symptoms and MRI are used for diagnosis, but clinicians lack tools to predict the rate of disease progression. This study aims at identifying biomarkers that predict the delay of conversion to MS after a CIS. We compared the cerebrospinal fluid (CSF) proteome from MS patients and symptomatic controls and the CSF from CIS patients with rapid conversion to MS (<1 year) and CIS patients with slow conversion to MS (>2 years). For the discovery step, human CSF samples (n=40) depleted of the 20 major plasma proteins were digested using a modified filter-assisted sample preparation (FASP) and analysed by high-resolution mass spectrometry using isobaric mass tag labelling or label-free quantification procedures. Proteins upregulated in CSF from MS patients included two proteins involved in tissue remodeling, namely chitinase-3-like protein-1 (CHI3L1) and chitinase-3-like protein-2 (CHI3L2). Their increased level in CSF of MS patients was confirmed by ELISA in a new cohort comprising CIS and MS patients (n=123) at different disease stages. Moreover, CHI3L1 levels in CSF and serum from CIS patients discriminated patients with rapid conversion to MS (< one year) from those with slower conversion.We also implemented a PRM method (peptide selection, dilution optimization of heavy isotope labeled non-purified peptides, reproducibility evaluation and method validation) to qualify a larger set of candidate biomarkers (226 peptides corresponding to 87 proteins) in a cohort different from the one used for the discovery step (n=60), including CSF from controls and MS patients at different disease stages. Finally, to further verify the 11 candidate biomarkers that passed this qualification step, we monitored 16 peptides in a new PRM assay, using shorter gradient and high-purity heavy isotope labeled peptides. This new PRM analysis was performed on a larger cohort (n=189) that included CSF of patients with other inflammatory and non-inflammatory neurological disorders in addition to control and MS patients. These analyses identified seven robust candidate biomarkers, which might help to discriminate patients suffering from MS or other neurological disorders.

Les erreurs innées du métabolisme (EIM) constituent un large panel de désordres métaboliques héréditaires. Parmi les EIM, les anomalies de la neurotransmission peuvent affecter, entre autres, la synthèse ou le transport des neurotransmetteurs, notamment les amines biogènes (dopamine et sérotonine) et les folates. La reconnaissance de ces affections est d’une importance capitale pour le diagnostic et le traitement éventuel. L’analyse chimique du liquide céphalo-rachidien (LCR) est incontournable pour le diagnostic de ces pathologies. Or, les méthodes actuelles de dosage ne sont pas simples. Longues et fastidieuses, elles ont été, pendant longtemps, réservées aux laboratoires spécialisés. L’objectif de ce travail était de développer des méthodes simples et rapides de diagnostic des troubles de la neurotransmission et d’établir les valeurs normales fréquentes dans la population française. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de développer une méthode de dosage directe, en une seule étape, de la tetrahydrobioptérine (BH4), cofacteur des hydroxylases intervenant dans la synthèse des amines biogènes, et des ptérines impliquées dans le cycle de synthèse et de dégradation de ce cofacteur, dans le LCR. Auparavant, le dosage de ces substances nécessitait au moins deux analyses chromatographiques précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Par la suite, nous avons développé une méthode de diagnostic rapide, en moins de 10 minutes, par UHPLC (chromatographie liquide à ultra haute performance), couplée à une détection séquentielle par coulométrie et par fluorescence, des troubles dopaminergique et sérotoninergique. Cette méthode permet de doser simultanément, en une seule étape, tous les métabolites de la dopamine, de la sérotonine et de la noradrénaline, ainsi que les ptérines d’intérêt diagnostic, principalement la dihydroneoptérine (NH2) et la dihydrobioptérine (BH2). L’ensemble de ces explorations nécessitait, auparavant, la mise en œuvre d’au moins trois méthodes de dosage par HPLC (chromatographie liquide à haute performance), précédées chacune d’une étape propre de préparation de l’échantillon. Pour compléter l’exploration du métabolisme de la BH4 et du suivi thérapeutique des troubles de la neurotransmission, nous avons également proposé une méthode de dosage rapide, en une seule étape, par UHPLC, de tous les métabolites et de toutes les ptérines, incluant la BH4. Enfin, une méthode rapide de dosage (moins de 2 minutes), par UHPLC, du 5-méthyltetrahydrofolate dans le LCR a été développée, afin de compléter le diagnostic biologique de l’ensemble des troubles neurologiques visés. L’application des outils ainsi développés à plus de 1400 patients nous a permis d’établir des valeurs normales fréquentes dans la population française ainsi que de poser le diagnostic de quelques déficits enzymatiques. / Inborn errors of metabolism (IEM) consist of a wide range of hereditary metabolic disorders. Among IEM, neurotransmission anomaly can affect the synthesis or the transport of neurotransmitters, notably biogenic amines (dopamine and serotonin) and folates. Early diagnosis of such affections is of utmost importance especially as some of them can be treated effectively. Chemical analysis of cerebrospinal fluid (CSF) is essential for the diagnosis of neurotransmitter disorders; however, current quantitative methods are tedious and time consuming. For a long time the chemical diagnosis of neurotransmitter disorders has been available only in specialized laboratories. The purpose of this work was to develop simple and fast diagnosis methods of neurotransmitter disorders as well as to establish the reference values in French population. For this purpose, in a first step, we developed a single step direct method of simultaneous quantification of tetrahydrobiopterin (BH4), which is the main cofactor of the hydroxylases involved in biogenic amines syntheses, and the relevant reduced and oxidized forms of pterins involved in the cycle of synthesis – regeneration of BH4. Formerly, the quantification of those compounds required at least two chromatographic methods with two specific sample preparation procedures. Thereafter we developed a method of fast diagnosis in less than 10 minutes of dopaminergic and serotoninergic disorders using UHPLC (ultra high performance liquid chromatography) hyphenated to a sequential coulometric and fluorimetric detection. With only a simple filtration step as sample preparation procedure, this method enables the simultaneous quantification of all dopamine, serotonin and noradrenaline metabolites as well as dihydroneopterin (NH2) and dihydrobiopterin (BH2), the relevant pterin forms for the complete diagnosis. Formerly, at least three HPLC (high performance liquid chromatography) quantification methods preceeded by three tedious specific sample preparation procedures were required for such a diagnosis. To complete the investigation of BH4 metabolism and the follow up of neurotransmission disorders, we also developed a fast UHPLC method of simultaneous quantification of all the cited metabolites and pterins including BH4. In order to complete the rapid diagnosis of all targeted neurological disorders, we finally developed an UHPLC method of 5-methyltetrahydrofolate quantification in CSF. The application of these analytical tools in more than 1400 CSF samples, collected from patients followed in some Neurology centers located in several French areas covering nearly the entirety of the territory, allowed us to establish the reference values in French population as well as to diagnose several cases of enzymatic deficits.

Les entérovirus humains (EV) constituent un groupe de virus à ARN d'une grande diversité génétique. Ils sont responsables d'infections cérébrales graves mais rares et de méningites bénignes mais fréquentes. Les évènements conduisant à l'entrée des EVs dans le système nerveux central (SNC), l'importance de la charge virale dans le liquide céphalo rachidien (LCR) et sa corrélation éventuelle avec l'intensité du processus inflammatoire réactionnel restent peu explorés. Comme de nombreux génotypes d'EV sont associés à des manifestations neurologiques semblables, des processus pathologiques communs sont envisageables. Le premier volet de cette thèse avait pour objectif d'étudier prospectivement la charge virale EV dans le LCR de patients présentant une méningite à l'aide d'une technique de RT-QPCR. Nos résultats montrent que les différences significatives de charge virale retrouvées dans le LCR en fonction de l'âge, des leucocytes et de la protéinorachie sont reliées au génotype de l'EV responsable de l'infection. Le second volet de cette thèse avait pour but d'explorer l'hypothèse qu'une infection de la barrière hémato-Encéphalique (BHE), peut représenter une voie d'accès commune à une majorité d'EVs vers le SNC. La réplication et la translocation des EVs ont été évaluées avec un modèle in vitro de BHE basé sur la lignée cellulaire hCMEC/D3. Nous avons validé ce modèle cellulaire en montrant une permissivité différentielle à un large éventail d'EVs et montré les spécificités du franchissement de cette barrière par l'EV-A71. Ces données soulèvent la question de l'origine de l'ARN EV dans le LCR au cours des premiers stades d'une méningite. / Human enteroviruses (EV) are RNA viruses characterized by a large genetic variability. They are associated with severe but rare neurological infections and frequent but self-Limiting meningitis. The processes of entry into the central nervous system (CNS), the level of EV viral load in the cerebrospinal fluid (CSF) and its possible relation to the intensity of the associated inflammatory process remain poorly understood. As several EV genotypes are related to common neurological disorders, common pathological processes may be involved. In the first part of this PhD thesis, we have prospectively investigated the EV viral load in the CSF of patients with meningitis using a RT-QPCR assay. Our results showed that significant differences between viral load levels and the age groups, the leukocytes count, the protein levels in the CSF, and with the EV genotype involved in the infection. We also explored the hypothesis that an infection of the blood brain barrier (BBB) could be a common pathway used by EVs released in the bloodstream to gain access into the CNS. The EV replication and translocation were analyzed with an in vitro model of BBB based on the hCMEC/D3 cell line. We validated this cell model by showing different permissivity patterns among a large array of EV genotypes. In addition, we showed the specificities in how the EV-A71 crosses the endothelial barrier. The overall data raise the unresolved issue of the origin of viral RNA in the CSF and the sources of infection during the early acute stage of EV meningitis.

Facial Artery Musculomucosal Flap in Skull Base Reconstruction Xie L. MD, Lavigne F. MD, Rahal A. MD, Moubayed SP MD, Ayad T. MD Introduction: Failure in skull base defects reconstruction can have serious consequences such as meningitis and pneumocephalus. The nasoseptal flap is usually the first choice but alternatives are necessary when this flap is not available. The facial artery musculomucosal (FAMM) flap has proven to be successful in head and neck reconstruction but it has never been reported in skull base reconstruction. Objective: To show that the FAMM flap can reach some key areas of the skull base and be considered as a new alternative in skull base defects reconstruction. Methods: We conducted a cadaveric study with harvest of modified FAMM flaps, endoscopic skull base dissection and maxillectomies in 13 specimens. Measures were taken for each harvested FAMM flap. Results: The approximate mean area for reconstruction from the combination of the distal FAMM and the extension flaps is 15.90 cm2. The flaps successfully covered the simulated defects of the frontal sinus, the ethmoid areas, the planum sphenoidale, and the sella turcica. Conclusion: The FAMM flap can be considered as a new alternative in the reconstruction of skull base defects. Modifications add extra length to the traditional FAMM flap and can contribute to a tighter seal of the defect as opposed to the FAMM flap alone. / Le lambeau musculomuqueux de la joue dans la reconstruction de la base du crâne Xie L. MD, Lavigne F. MD, Rahal A. MD, Moubayed SP MD, Ayad T. MD Introduction: Un échec dans la reconstruction de la base du crâne peut avoir des conséquences graves telles que la méningite ou la pneumocéphalie. Le premier choix de la reconstruction est le lambeau nasoseptal. Lorsque ce dernier n’est pas disponible, d’autres alternatives sont nécessaires. Le lambeau musculomuqueux de la joue (FAMM) a une place établie dans la reconstruction des déficits de la tête et du cou, mais il n’a pas jamais été décrit dans la reconstruction de la base du crâne. Objectif: Démontrer que le lambeau de FAMM peut atteindre des zones clés de la base du crâne et être considéré comme une nouvelle option de reconstruction de cette région. Méthode: Nous avons entrepris une étude cadavérique avec prélèvement de lambeaux de FAMM modifiés et une dissection endoscopique de la base du crâne sur 13 spécimens. Des mesures ont été prises pour chaque lambeau prélevé. Résultats: L’aire de reconstruction moyenne du lambeau de FAMM et des extensions est de 15.90 cm2. Les lambeaux couvrent totalement les déficits simulés du sinus frontal, des ethmoïdes, le toit du sphénoïde et la selle turcique. Conclusion: Le lambeau de FAMM peut être considéré comme une nouvelle alternative dans la reconstruction des déficits de la base du crâne. Les modifications apportent une longueur additionnelle et contribuent à une couverture plus étanche du déficit que le lambeau de FAMM seul.

Facial Artery Musculomucosal Flap in Skull Base Reconstruction Xie L. MD, Lavigne F. MD, Rahal A. MD, Moubayed SP MD, Ayad T. MD Introduction: Failure in skull base defects reconstruction can have serious consequences such as meningitis and pneumocephalus. The nasoseptal flap is usually the first choice but alternatives are necessary when this flap is not available. The facial artery musculomucosal (FAMM) flap has proven to be successful in head and neck reconstruction but it has never been reported in skull base reconstruction. Objective: To show that the FAMM flap can reach some key areas of the skull base and be considered as a new alternative in skull base defects reconstruction. Methods: We conducted a cadaveric study with harvest of modified FAMM flaps, endoscopic skull base dissection and maxillectomies in 13 specimens. Measures were taken for each harvested FAMM flap. Results: The approximate mean area for reconstruction from the combination of the distal FAMM and the extension flaps is 15.90 cm2. The flaps successfully covered the simulated defects of the frontal sinus, the ethmoid areas, the planum sphenoidale, and the sella turcica. Conclusion: The FAMM flap can be considered as a new alternative in the reconstruction of skull base defects. Modifications add extra length to the traditional FAMM flap and can contribute to a tighter seal of the defect as opposed to the FAMM flap alone. / Le lambeau musculomuqueux de la joue dans la reconstruction de la base du crâne Xie L. MD, Lavigne F. MD, Rahal A. MD, Moubayed SP MD, Ayad T. MD Introduction: Un échec dans la reconstruction de la base du crâne peut avoir des conséquences graves telles que la méningite ou la pneumocéphalie. Le premier choix de la reconstruction est le lambeau nasoseptal. Lorsque ce dernier n’est pas disponible, d’autres alternatives sont nécessaires. Le lambeau musculomuqueux de la joue (FAMM) a une place établie dans la reconstruction des déficits de la tête et du cou, mais il n’a pas jamais été décrit dans la reconstruction de la base du crâne. Objectif: Démontrer que le lambeau de FAMM peut atteindre des zones clés de la base du crâne et être considéré comme une nouvelle option de reconstruction de cette région. Méthode: Nous avons entrepris une étude cadavérique avec prélèvement de lambeaux de FAMM modifiés et une dissection endoscopique de la base du crâne sur 13 spécimens. Des mesures ont été prises pour chaque lambeau prélevé. Résultats: L’aire de reconstruction moyenne du lambeau de FAMM et des extensions est de 15.90 cm2. Les lambeaux couvrent totalement les déficits simulés du sinus frontal, des ethmoïdes, le toit du sphénoïde et la selle turcique. Conclusion: Le lambeau de FAMM peut être considéré comme une nouvelle alternative dans la reconstruction des déficits de la base du crâne. Les modifications apportent une longueur additionnelle et contribuent à une couverture plus étanche du déficit que le lambeau de FAMM seul.