Thesis (Ph. D.)--Auburn University, 2008. / Abstract. Vita. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Virginia Polytechnic Institute and State University, 1994. / Vita. Abstract. Includes bibliographical references (leaves 110-123). Also available via the Internet.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 51-57).

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 1998. / Includes bibliographical references (leaf 151-168).

Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2002. / Includes bibliographical references (leaves 107-114).

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, Dept. of Organismal Biology and Anatomy, March 1997. / Includes bibliographical references. Also available on the Internet.

The three isoforms of nitric oxide synthase (NOS) are classified based on their mode of regulation by calmodulin (CaM). The "calcium-independent" inducible isoform (iNOS) contains tightly-bound CaM and is active at all levels of intracellular calcium. In contrast, the two calcium-dependent isoforms (neuronal, nNOS and endothelial eNOS) are activated by CaM-binding following stimulus-evoked increases in intracellular calcium. However, both the structural basis for these differences in regulation and the molecular basis for CaM-induced cNOS activation remained unclear. Given that the regulation of calmodulin regulated enzyme systems often involves the displacement of an intrinsic autoinhibitory domain, we attempted to identify regions of eNOS which may fulfill this autoinhibory function. Herein, I describe the identification of two autoinhibitory control elements (ACEs) in eNOS, one within the FMN binding domain (ACE-I) and one located at the C-terminus (ACE-2). Together with CaM, these form a tripartite system for the regulation of eNOS. ACE-lIACE-2 exerting negative effects to attenuate catalytic activity, which are overcome by the conformational changes induced by CaM-binding. The mechanism of ACE-lIACE-2-mediated inhibition and the alleviation of this inhibition were investigated.

Alzheimer’s disease (AD) is neuropathologically characterized by excessive beta -amyloid (Abeta)plaques and neurofibrillary tangles composed of hyperphosphorylated tau in the brain. Although the etiology of genetic cases of AD has been attributed to mutations in presenilin and amyloid precursor protein (APP) genes, in most sporadic cases of AD, the etiology is still unknown and various predisposing factors could contribute to the pathology of AD. Predominant among these possible predisposing factors that have been implicated in AD are age, hypertension, traumatic brain injury, diabetes, chronic neuroinflammation, alteration in calcium levels and oxidative stress. Since both inflammation and altered calcium levels are implicated in the pathogenesis of AD, we wanted to study the effect of altered levels of calcium on inflammation and the subsequent effect of selective calcium channel blockers on the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. Our hypothesis is that Abeta depending on it conformation, may contribute to altered levels of intracellular calcium in neurons and glial cells. We wanted to determine which conformation of Abeta was most pathogenic in terms of increasing inflammation and calcium influx and further elucidate the possibility of a link between altered calcium levels and inflammation. In addition, we wanted to test whether calcium channel blockers could inhibit the inflammation mediated by the most pathogenic form of Abeta by antagonizing the calcium influx triggered by Abeta. Our results in human glial and neuronal cells demonstrate that the high molecular weight oligomers are the most potent at stimulating the release of pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 as well as increasing intracellular levels of calcium compared to other conformations of Abeta. Further, L-type calcium channel blockers and calmodulin kinase inhibitors are able to significantly reduce the levels of IL-6 and IL-8. These results suggest that Abeta induced alteration of intracellular calcium levels contributes to its pro-inflammatory effect.

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Die Inositolmonophosphatase (IMPase) reguliert als Schlüsselenzym des Phosphatidyl-Inositol-Signalwegs den Abbau des second messenger Inositoltrisphophat (IP3). Als wahrscheinliche molekulare Zielstruktur in der Behandlung der Bipolar Affektiven Störung ist die Erforschung der Regulation der IMPase von hoher medizinischer Relevanz. Seit Jahrzehnten werden Lithiumsalze, die die IMPase in therapeutischen Konzentrationen hemmen, in der Prophylaxe manischer Phasen eingesetzt. Die Therapie mit Lithiumsalzen birgt jedoch die Gefahr zahlreicher schwerwiegender Nebenwirkungen. Außerdem besitzt das Medikament eine geringe therapeutische Breite. Dies macht die Untersuchung alternativer Regulationsmöglichkeiten der IMPase als möglichem Ansatzpunkt für neue pharmakologische Therapien der Bipolar Affektiven Störung hochinteressant. In den letzten Jahren mehrten sich die Hinweise auf eine Regulation der IMPase durch Ca2+-bindende Proteine. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels verschiedener in vitro-Methoden der Einfluss der Ca2+-bindenen Proteine Calbindin D28k (CB) sowie Calmodulin (CaM) auf die Enzymaktivität der IMPase untersucht. Hierzu wurden die Proteine heterolog in E. coli exprimiert und ein Phosphat-Akkumulationsassay zur Untersuchung der Enzymaktivität der IMPase etabliert. Für die funktionellen Untersuchungen mit CB konnte eine signifikante Steigerung der Aktivität der IMPase nachgewiesen werden. Im Vorfeld der funktionellen Untersuchungen der Enzymaktivität mit CaM konnte eine Ca2+-abhängige Bindung von CaM an die IMPase mittels zweier unabhängiger Experimente gezeigt werden. Da die freie Ca2+-Konzentration einen hemmenden Einfluss auf die Aktivität der IMPase hat, wurde die Ca2+-Bindung durch CaM mit einem Fluoreszenz-Assay kontrolliert. Hierdurch konnten die funktionellen Experimente mit CaM unter genau definierten Ca2+-Konzentrationen durchgeführt werden. In den funktionellen Untersuchungen mit CaM zeigte sich keine Modulation der IMPase. Weiterführende Experimente sollten der Identifizierung möglicher zusätzlicher Interaktionspartner der IMPase dienen. Dazu würden sich Immunpräzipitationsexperimente anbieten. Außerdem sollte eine Untersuchung der Interaktion zwischen IMPase und CaM in einem eukaryotischen Zellsystem erfolgen. Dies würde eine Aussage unter physiologischen Bedingungen ermöglichen.