La llet s'ha processat tradicionalment mitjançant mètodes tèrmics que permeten assegurar la seva qualitat microbiològica i estabilitat enzimàtica. Malgrat això, els canvis organolèptics i la pèrdua de components nutritius induïts pel mateix escalfament podrien minimitzar-se gràcies a la utilització de mètodes no tèrmics de tractament, com els polsos elèctrics d'alta intensitat de camp (PEAIC). L'objectiu general d'aquest treball va ser l'estudi de l'efectivitat del tractament de polsos elèctrics d'alta intensitat de camp sobre el microorganisme patogen Staphylococcus aureus en llet, així com l'efecte resultant de la seva combinació amb l'addició d'agents antimicrobians. La inactivació de Staph. aureus deguda a l'aplicació de PEAIC es va estudiar mitjançant un disseny experimental de superfície de resposta en el que les variables independents van ésser el nombre, l'amplada i la polaritat de pols, la intensitat de camp i la quantitat de grassa de la llet. De mode similar, s'avaluà l'efecte de l'addició de nisina, lisozima, enterocina AS-48 i les seves combinacions juntament amb l'aplicació de PEAIC. En aquest darrer cas, es va observar el grau de destrucció en funció del temps de tractament, la intensitat de camp, la concentració i temps d'exposició a l'antimicrobià, el pH, la temperatura d'emmagatzemament i la seqüència dels tractaments. Es va determinar la vida útil en refrigeració (4ºC) de llet tractada amb PEAIC i antimicrobians a partir de l'evolució de la flora mesòfila, d'enterobactèries, de coliforms i dels patògens Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp. i Staphylococcus aureus. Es va comparar també l'evolució de la flora de llet pasteuritzada amb la de la llet sotmesa simultàniament a un escalfament moderat, l'addició d'antimicrobians i l'aplicació de PEAIC. En general, polsos bipolars o una major intensitat de camp, nombre o amplada de pols es va traduir en un menor nombre de cèl·lules viables de Staph. aureus. Ara bé, es va obtenir un màxim d'inactivació que oscil·là entre 6.3 i 7.1 μs d'amplada de pols en el rang de 50 a 150 polsos de 35 kV/cm. Al mateix temps, la interacció entre l'amplada i el nombre de polsos o la intensitat de camp van proporcionar diferents combinacions de les variables amb igual nivell de destrucció microbiana. La combinació de PEAIC amb l'addició a dosis subletals de nisina o enterocina AS-48 actuà de forma sinèrgica a la inactivació de Staph. aureus en llet al seu pH natural. Aquest efecte va ser encara superior quan es combinaren dos antimicrobians, com la nisina i la lisozima o la nisina i l' enterocina AS-48. La mescla de 300 IU/mL de lisozima y 1 IU/mL de nisina va produir prop de 6.4 cicles logarítmics de reducció quan s'aplicaren 1,200 μs de polsos bipolar de 6 μs d'amplada i 35 kV/cm. El tractament de llet amb PEAIC o PEAIC simultàniament amb l'addició d'antimicrobians va augmentar la seva vida útil en refrigeració. L'addició d'1 IU/mL de nisina i 300 IU/mL de lisozima va allargar la vida útil de la llet fins a 7 dies si es processava amb polsos de 6 μs d'amplada i 1,200 μs de temps de tractament a 35 kV/cm, no detectant-ne la presència dels patògens en estudi. La combinació de PEAIC, escalfament moderat a 55ºC durant 16 s i l'addició d'antimicrobians en llet crua va inactivar les enterobactèries i coliforms durant 4 dies i allargà l'emmagatzemament fins a 8 dies. En el cas particular d'augmentar la temperatura fins a 65ºC, la vida útil (26 dies) i la qualitat microbiològica de les mostres amb 20 IU/mL de nisina i tractades amb PEAIC va superar i millorar a la de la llet pasteuritzada a 75ºC durant 16 s. En conseqüència, el tractament simultani de llet amb antimicrobians, com la nisina, la lisozima, l'enterocina AS-48 o les seves combinacions, mitjançant PEAIC i/o un escalfament moderat del medi podria millorar la qualitat organolèptica de múltiples productes làctics a la vegada que asseguraria la seva qualitat microbiològica. / La leche se ha procesado tradicionalmente mediante el uso de calor para asegurar su calidadmicrobiológica y su estabilidad enzimática. Sin embargo, los cambios organolépticos y la pérdida decomponentes nutritivos inducidos por el calentamiento podrían minimizarse con el empleo detratamientos no térmicos, como los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC). El presentetrabajo tuvo como objetivo general estudiar la efectividad del tratamiento con PEAIC sobre lasupervivencia del patógeno Staphylococcus aureus en leche, así como el efecto resultante de sucombinación con substancias antimicrobianas.La inactivación de Staph. aureus debida a la aplicación de PEAIC se estudió mediante un diseñoexperimental de superficie de respuesta en el que las variables independientes fueron el número, anchuray polaridad de pulso, la intensidad de campo y el porcentaje de grasa de la leche. De modo similar, seevaluó el efecto individual y conjunto de la adición de nisina, lisozima, enterocina AS-48 o de suscombinaciones con la aplicación de PEAIC. En este último caso, se determinó el grado de destrucción enfunción del tiempo de tratamiento, la intensidad de campo, la concentración y tiempo de exposición alantimicrobiano, el pH, la temperatura de almacenamiento y la secuencia de tratamiento. Se determinó lavida útil en refrigeración (4ºC) de leche tratada con PEAIC y antimicrobianos a partir de la evolución de laflora mesófila, enterobacterias, coliformes y los patógenos Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp.y Staphylococcus aureus. Se comparó también la evolución de la flora de la leche pasteurizada con la deleche sometida simultáneamente a un calentamiento moderado, la adición de antimicrobianos y laaplicación de PEAIC.En general, pulsos bipolares o una mayor intensidad de campo, número o anchura de pulsos se tradujo enun menor número de células viables de Staph. aureus. Si bien, se obtuvo un máximo de inactivación queosciló entre 6.3 y 7.1 μs de anchura de pulso en el rango de 50 a 150 pulsos a 35 kV/cm. Al mismo tiempo,la interacción entre la anchura de pulsos y el número de pulsos o la intensidad de campo definió distintascombinaciones de las variables con igual nivel de destrucción microbiana. La combinación de PEAIC con laadición a dosis subletales de nisina o enterocina AS-48 actuó de forma sinérgica en la inactivación deStaph. aureus en leche a su pH natural. Este efecto fue aún mayor cuando se combinaron dosantimicrobianos, como nisina y lisozima o nisina y enterocina AS-48. La combinación de 300 IU/mL delisozima y 1 IU/mL de nisina redujo la población hasta 6.4 ciclos logarítmicos cuando se aplicaron 1,200 μscon pulsos bipolares de 6 μs de anchura y 35 kV/cm. El tratamiento de leche con PEAIC o PEAIC junto a laadición de antimicrobianos alargó su vida útil en refrigeración. La adición 1 IU/mL de nisina y 300 IU/mLde lisozima la aumentó hasta 7 días si se procesaba con pulsos de 6 μs de anchura y 1,200 μs de tiempode tratamiento a 35 kV/cm, no detectándose, además, la presencia de los patógenos en estudio. Lacombinación de PEAIC, calentamiento moderado a 55ºC durante 16 s y adición de antimicrobianos enleche cruda consiguió inactivar a enterobacterias y coliformes durante 4 días y prolongar sualmacenamiento hasta 8 días. En el caso particular de aumentar la temperatura hasta 65ºC, la vida útil (26días) y la calidad microbiológica de muestras con 20 IU/mL de nisina y tratadas con PEAIC superó y mejorórespecto a la de la leche pasteurizada a 75ºC durante 16 s.En consecuencia, el tratamiento simultáneo de leche con antimicrobianos, tales como nisina, lisozima,enterocina AS-48 o sus combinaciones, mediante PEAIC y/o un calentamiento moderado del medio podríamejorar la calidad organoléptica de los productos lácteos a la par que asegurar su calidad microbiológica. / Milk has been traditionally processed by thermal treatments that assure their microbiological acceptance and enzimatical stability. However, changes of sensory properties induced by heating may be minimized by using nonthermal treatments, such as the use of high-intensity pulsed-electric field (HIPEF). Thus, the main purpose of this work was to study the lethal effect of applying high-intensity pulsed-electric field against Staphylococcus aureus inoculated in milk, as well as the effect of combining HIPEF with the addition of antimicrobial compounds. Cell death of Staph. aureus was studied by a response surface methodology, in which the independent variables were pulse number and width, pulse polarity, electric field intensity and fat content. Similarly, the joint effect of the addition of nisin, lysozyme, enterocin AS-48 or their combination with the application of HIPEF was also considered by varying the HIPEF treatment time, electric field intensity, concentration and exposure time to the antimicrobials, pH, storate temperature and the sequence of application. Shelf-life of milk treated by HIPEF and added antimicrobial compounds was determined. A microbial screening of mesophilic bacteria, enterobacteria, coliforms and the pathogens Escherichia coli, Listeria spp., Salmonella spp. and Staphylococcus aureus was performed periodically during refrigerated storage. Fate of survivors of pasteurized milk was compared to that of milk submitted to mild heating, HIPEF and added antimicrobials. In general, the highest microbial inactivation was shown setting bipolar pulses or by increasing field intensity or pulse number and width. However, a maximum on cell death was observed depending on pulse width, which varied from 6.3 to 7.1 μs when pulse number ranged from 50 to 150 pulses, respectively, at 35 kV/cm of field intensity. Likewise, different levels of pulse width and pulse number or pulse width and field intensity reached the same level of inactivation. The combination of HIPEF with the addition of antimicrobial peptides (nisin, enterocina AS-48, nisin with lysozyme and nisin with enterocina AS-48) at sublethal doses acted synergistically against Staph. aureus in milk at its natural pH. A reduction over 6.4 log cycles was registered when 300 IU/mL of lysozyme and 1 IU/mL of nisin were added to milk prior to treating by HIPEF (1,200 μs treatment time and 6 μs pulse width at 35 kV/cm). Shelf-life of milk processed by HIPEF or by combining HIPEF and the addition of antimicrobial compounds was prolonged under refrigeration conditions. Milk with added 300 IU/mL of lysozyme and 1 IU/mL of nisin and treated by HIPEF (1,200 μs treatment time and 6 μs pulse width at 35 kV/cm) was stored for 7 days before reaching the limit of microbial acceptance. Moreover, absence of the considered pathogens was found on the latter treated samples. Counts of enterobacteria and coliforms remained below the detection limit during 4 days of storage at 4ºC and shelf-life prolonged for 8 days when milk was submitted to HIPEF, mild heating at 55ºC for 16 s and the addition of antimicrobial compounds. In the particular case of increasing temperature up to 65ºC, shelf-life (26 days) and microbial counts of milk with 20 IU/mL was longer and lower than milk pasteurized at 75ºC for 16 s. In conclusion, milk and dairy products simultaneously processed by the addition of antimicrobial peptides, such as nisin, lysozyme, enterocina AS-48 or their combination, mild heating and HIPEF may improve their sensory properties while microbial acceptance is assured.

En l'actualitat, el mètode més utilitzat per a la pasteurització d'aliments es l'aplicació decalor, encara que en aquestes darreres dècades estan sorgint tecnologies alternatives, entreles quals cal destacar l'ús dels polsos elèctrics d'alta intensitat de camp (PEAIC).En llet, s'ha vist que amb l'aplicació d'aquesta tècnica es poden aconseguir alts nivellsd'inactivació microbiana, encara que igual que en altres productes, hi ha pocs estudis sobrel'efecte que produeixen en enzims i components minoritaris. En aquest treball, s'ha estudiatl'efecte dels PEAIC en una lipasa i una proteasa produides per dos bacteris psicròtrofs,Pseudomonas fluorescens i Bacillus subtilis, respectivament, en llet o solució modeld'ultrafiltrat de llet (SMUL). A més, s'ha estudiat l'efecte dels PEAIC en diversesvitamines tant hidrosolubles como liposolubles; per així, avaluar 1' efectivitat d'aquestatècnica en la inactivació d'enzims i el grau d'alteració que provoca en el valor nutricionalde la llet.En primer lloc, es van elegir i validar els mètodes que s'utilitzarien per quantificar lesactivitats d'ambdós enzims i el contingut en vitamines, observant-se que en tots els casos,els mètodes van resultar fiables pel seu ús previst.La llet o la SMUL amb la lipasa o proteasa es van processar mitjançant PEAIC o calor,observant-se que amb PEAIC es va poder reduir en un elevat percentatge l'activitatd'aquests enzims termoresistents, encara que l'efectivitat del tractament depèn de lescaracterístiques del medi, les condicions de processat i de les característiques de l'equip detractament.La lipasa de Pseudomonas fluorescens suspesa en SMUL va resultar resistent alstractaments tèrmics de pasteurizació, mentre que quan es va sotmetre a un tractamentmitjançant PEAIC per tandes o en fluxe continu, l'activitat va disminuir amb l'augment dela intensitat de camp (16.4-37.3 kV/cm) i el nombre de polsos (fins a 80 polsos). Eltractament per tandes va ser molt més efectiu que el continu, ja que aplicant densitats d'energia similars (504.97 y 424.36 kJ/1) l'activitat es va reduir un 62.1% i un 13%,respectivament.La proteasa de Bacillus subtilis va resultar molt més resistent que la lipasa estudiada alstractaments mitjançant PEAIC, tant en SMUL com en llet desnatada, ja que després d'aplicar fins a 500 kJ/1 en tres equips diferents es va observar poca efectivitat en lainactivació de la proteasa tant en el procés en tandes com en el continu. Per aconseguir unainactivació considerable de l'enzim es van requerir tractaments de densitats d' energiasuperiors a 6000 kJ/1. L'activitat de l'enzim suspès en SMUL o en llet (desnatada i sencera)es va reduir amb 1' increment de la duració del tractament (fins a 895.8 (is), la intensitat decamp (19.7-35.5 kV/cm), la densitat d'energia (fins a 6786.8 kJ/1) i la freqüència (66.66-111.11 Hz). El medi en que els tractaments van resultar més efectius va ser la lletdesnatada, on es va aconseguir una inactivació del 81.1% després d'un tractament de6559.8 kJ/1 a 111.11 Hz. Al pasteuritzar les mostres tèrmicamente es va observar uncomportament similar, ja que en condicions de pasteurización alta (75°C-15 s) l'enzim varesultar molt més sensible en llet desnatada que en SMUL.En ambdós casos, la reducció de l'activitat enzimàtica es va poder relacionar mitjançantdiversos models matemàtics respecte a la densitat d'energia, temps de tractament i/ointensitat de camp.L'efecte dels PEAIC en les vitamines (tiamina, riboflavina, àcid ascorbic, colecalciferol itocoferol) en llet i SMUL, es va estudiar aplicant tractaments de fins a 400 (is a intensitatsde camp de 18.3 a 27.1 kV/cm. L'efecte també es va comparar amb el resultant d'aplicardiversos tractaments tèrmics. A excepció de l'àcid ascorbic, en cap cas es va produirpèrdues significatives del contingut en vitamines. La llet va retenir major quantitat d'àcidascorbic després d'un tractament de 400 |j.s a 22.6 kV/cm (93.4%) que després d'aplicarprocessos tèrmics de pasteurització baixa (49.7%) o alta (86.7%). La disminució delcontingut en àcid ascorbic va seguir una tendència de tipus exponencial en ambdós tipus detractament (PEAIC i calor). També es va observar que la retenció de vitamina després d'aplicar el tractament mitjançant PEAIC va ser més alta en llet que en SMUL, demostrant-seun efecte protector dels components naturals de la llet.En aquest treball s'ha provat que els PEAIC poden ser una bona alternativa al tractamenttèrmic per la conservación de llet; ja que amb aquesta tècnica es poden aconseguir nivellsalts d'inactivació d'enzims indesitjables sense causar grans alteracions en el contingut envitamines. / En la actualidad, el método más usado para la pasteurización de alimentos es la aplicaciónde calor, aunque en estas últimas décadas están surgiendo tecnologías alternativas entre lasque cabe destacar el uso de los pulsos eléctricos de alta intensidad de campo (PEAIC).Se ha visto que con esta técnica se pueden conseguir altos niveles de inactivaciónmicrobiana en leche, aunque al igual que en otros productos, hay pocos estudios acerca delefecto que produce en enzimas y componentes minoritarios. En este trabajo, se ha estudiadoel efecto de los PEAIC en una lipasa y una proteasa producidas por dos bacteriaspsicrótrofas, Pseudomonas flúor escens y Bacillus subtilis, respectivamente, suspendidas enleche o solución modelo de ultrafiltrado de leche (SMUL). Además, se ha estudiado elefecto de los PEAIC en diversas vitaminas tanto hidrosolubles como liposolubles; para así,evaluar la efectividad de esta técnica en la inactivación de enzimas y el grado de alteraciónque provoca en el valor nutricional de la leche.En primer lugar, se eligieron y validaron los métodos que iban a ser usados para lacuantificación de las actividades de ambos enzimas y el contenido en vitaminas,observándose que en todos los casos, los métodos resultaron fiables para el uso previsto.La leche o la SMUL conteniendo la lipasa o proteasa se procesó mediante PEAIC o calor,observándose que mediante PEAIC se pudo reducir en un elevado porcentaje la actividadde estos enzimas termoresistentes, aunque la efectividad del tratamiento dependió de lascaracterísticas del medio, las condiciones de procesado y de las características del equipode tratamiento.La lipasa de Pseudomonas fluorescens suspendida en SMUL resultó resistente a lostratamientos térmicos de pasteurización, mientras que cuando se sometió a tratamientosmediante PEAIC por tandas o en flujo continuo, la actividad disminuyó con el aumento dela intensidad de campo (16.4-37.3 kV/cm) y el número de pulsos (hasta 80 pulsos). Eltratamiento por tandas fue mucho más efectivo que el continuo, ya que aplicandodensidades de energía similares (504.97 y 424.36 kJ/1) la actividad se redujo un 62.1% y un13%, respectivamente.La proteasa de Bacillus subtilis resultó mucho más resistente a los tratamientos mediantePEAIC que la lipasa estudiada, tanto en SMUL como en leche desnatada, ya que despuésde aplicar hasta 500 kJ/1 en equipos diferentes se observó poca efectividad en lainactivación de la proteasa tanto en tratamiento por tandas como en flujo continuo. Paraconseguir una inactivación considerable del enzima se requirieron tratamientos dedensidades de energía superiores a 6000 kJ/1. La actividad del enzima suspendido en SMULo en leche (desnatada y entera) se redujo al aumentar la duración del tratamiento (hasta895.8 u.s), la intensidad de campo (19.7-35.5 kV/cm), la densidad de energía (hasta 6786.8U/1) y la frecuencia (66.66-111.11 Hz). El medio en que los tratamientos resultaron másefectivos fue la leche desnatada, consiguiéndose una inactivación del 81.1% después de untratamiento de 6559.8 kJ/1 a 111.11 Hz. Al pasteurizar las muestras térmicamente, seobservó un comportamiento similar, ya que en condiciones de pasteurización alta (75°C-15s) el enzima resultó mucho más sensible en leche desnatada que en SMUL.En ambos casos, la reducción de la actividad enzimàtica se pudo relacionar mediantediversos modelos matemáticos respecto a la densidad de energía, tiempo de tratamiento y/ointensidad de campo.El efecto de los PEAIC en las vitaminas (tiamina, riboflavina, ácido ascòrbico,colecalciferol y tocoferol) en lèche y SMUL, se estudió aplicando tratamientos de hasta 400(is a intensidades de campo de 18.3 a 27.1 kV/cm. El efecto también se comparò con elresultante de aplicar diversos tratamientos térmicos. A excepción del ácido ascòrbico, enningún caso se produjeron pérdidas significativas del contenido en vitaminas. La lecheretuvo mayor cantidad de ácido ascòrbico después de un tratamiento de 400 jas a 22.6kV/cm (93.4%) que después de aplicar procesos térmicos de pasteurización baja (49.7%) oalta (86.7%). La disminución del contenido en ácido ascòrbico siguió una tendencia de tipoexponencial en ambos tipos de tratamiento (PEAIC y calor). También se observó que laretención de vitamina después de aplicar el tratamiento mediante PEAIC fue mayor enleche que en SMUL, demostrándose un efecto protector de los componentes naturales de laleche.En este trabajo se ha probado que los PEAIC pueden ser una buena alternativa altratamiento térmico para la conservación de leche; ya que con esta técnica se puedenconseguir niveles altos de inactivación de enzimas indeseables sin causar grandesalteraciones en el contenido en vitaminas. / Nowadays, the most used method for food pasteurization is the application of heat.Nevertheless, in the last decades, several alternative technologies are emerging and one ofthe most promising is high intensity pulsed electric fields (HIPEF).In milk, high levels of microbial destruction can be achieved using this technology.However, as for other products, few studies exist about the effect of HIPEF on enzymesand other minor food components. In this work, the effect of HIPEF on a lipase and aprotease produced by the psychrothophic bacteria Pseudomonas fluorescens and Bacillussubiilis, suspended in milk or simulated milk ultrafiltrate (SMUF) has been studied. Theeffect of HIPEF on several hidro or liposoluble vitamins has also been studied in order toknow the effectiveness of this technology in inactivating undesirable enzymes and thechanges that cause on the nutritional value of milk.First or all, the methods required for the quantification of enzyme activities and vitamincontent were chosen and validated. It was observed that in all the cases, the methodsresulted reliable for their use.Milk or SMUF samples containing lipase or protease were processed by HIPEF or heat.HIPEF could reduce quite a lot the activity of this thermorésistant enzymes, althoughtreatments effectiveness depended on the medium characteristics, process conditions andequipment configuration.Lipase from Pseudomonas fluorescens suspended in SMUF resulted resistant to thermalpasteurization, whereas when subjected to a batch or a continuous mode HIPEF treatment,its activity decreased with the increase of the field strength (16.4-37.3 kV/cm) and thenumber of pulses (up to 80 pulses). The batch mode treatment was much more effectivethan that on continuous mode, since after applying similar energy densities (504.97 and424.36 kJ/1) the activity was reduced a 62.1% and a 13%, respectively.Protease from Bacillus subtilis resulted much more resistant than the evaluated lipase toHIPEF processes whatever was the treatment medium (SMUL, skim milk). After FflPEFtreatments of up to 500 kJ/1 using different equipments (batch or continuous), loweffectiveness on protease inactivation was observed. To achieve a notable level of enzymeinactivation, treatments of energy densities higher than 6000 kJ/1 were required.Protease activity suspended in SMUF or milk (skim or whole milk) subjected to HIPEFdecreased with the increase of the treatment duration (up to 895.8 (as), field strength (19.7-35.5 kV/cm), energy density (up to 6786.8 kJ/1) and the pulse repetition rate (66.66-111.11Hz).Treatments resulted more effective in skim milk than in SMUF and whole milk, since up toa 81.1% inactivation was achieved after a HIPEF treatment of 6559.8 kJ/1 at 111.11 Hz.When samples were processed thermally, a similar behavior was observed, since theenzyme resulted more sensitive in skim milk than in SMUF after a pasteurization process(75°C-15 s).In both cases, the reduction of enzyme activity could be fitted to several mathematicalmodels related to the energy density, treatment time and/or field strength.The effect of HIPEF on vitamins (thiamin, riboflavin, ascorbic acid, cholecalciferol andtocopherol) in milk and SMUF, was studied by applying treatments of up to 400 (is at fieldstrengths form 18.3 to 27.1 kV/cm. The effect of HIPEF on vitamins was also compared tothat of thermal pasteurization. Only ascorbic acid showed changes on its content afterHIPEF or thermal treatments. Milk retained higher levels of ascorbic acid after a HIPEFtreatment of 400 (is at 22.6 kV/cm (93.4%) than after thermal pasteurization processes of63°C-30 min (49.7%) or 75°C-15 s (86.7%). Ascorbic acid content reduction followed anexponential model in both cases (HIPEF and heat). It was also observed that vitaminretention after a HIPEF treatment was higher in milk than in SMUF, demonstrating aprotective effect of milk components.In this work, it has been proved that HIPEF might be a good alternative to thermal processfor food preservation. Using this technology, high levels of enzyme inactivation can beachieved without causing important changes in the vitamin content.