Investigaciones en nuestro y otros laboratorios han demostrado que la hormona 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) modula los niveles de Ca2+ intracelular en células de músculo esquelético y tejido óseo por un mecanismo genómico, característico de hormonas esteroideas en el cual la hormona interacciona con un receptor intracelular específico (VDR: vitamin D receptor). Esta molécula exhibe una localización citoplásmica/nuclear, siendo el complejo hormona-receptor el responsable de la regulación de la expresión de genes portadores de elementos de respuesta a VDR. Sin embargo, 1,25(OH)2D3 modula también los niveles de Ca2+ intracelular a través de un mecanismo rápido, no genómico, independiente de la transcripción génica y de la síntesis proteica que implica acciones directas del esteroide sobre la membrana celular. Las acciones rápidas, no nucleares de 1,25(OH)2D3 requieren la activación de varios sistemas de señalización (adenilil ciclasa/AMPc/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), integrados en un mecanismo complejo que involucra proteínas G, interacción positiva entre las vías PKA y PKC e incremento en la fosforilación de proteínas de membrana. En conjunto, estos eventos conducen a una rápida y transitoria liberación de Ca2+ de los depósitos internos y activación de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VDCC) tipo L, con el consecuente influjo sostenido de Ca2+ desde el medio extracelular. En el presente trabajo empleando el indicador fluorescente de Ca2+ Fura-2, se caracterizaron los efectos de la hormona 1,25(OH)2D3 sobre los niveles de Ca2+ citosólico en cultivos de osteoblastos de rata. Estos estudios pusieron de manifiesto que la fase de influjo de Ca2+ inducido por 1,25(OH)2D3 es mediada por los canales VDCC ya caracterizados, indicando además que existe una contribución parcial a la entrada de Ca2+ mediada por canales no dependientes de voltaje operados por el nivel de Ca2+ de los depósitos internos. Se introduce así el novedoso concepto sobre la participación de canales SOC (Store Operated Channels; CCE: Capacitative Ca2+ Entry ) en la respuesta rápida de Ca2+ a la hormona. A partir de este hallazgo, estudiamos y caracterizamos esta entrada capacitativa de cationes en líneas celulares derivadas de epitelio mamario y de cáncer mamario, ambas de origen humano. Estos canales, activados por depleción y/o movilización de Ca2+ de depósitos internos, independientes de voltaje y regulados por múltiples eventos de señalización intracelular, estarían constituídos por proteínas de la familia de genes TRP, originalmente descriptos en células fotoreceptoras de Drosophila (mutantes trp: Transient Receptor Potential). Sus genes han sido clonados, secuenciados y su funcionalidad como canales responsables del influjo de Ca2+ tipo SOC, ha sido demostrada mediante expresión de proteínas TRP en sistemas heterólogos. Además, en el sistema fototransductor de Drosophila, TRP forma parte de un complejo de señalización multiproteico junto con RH1 (rodopsina), NORPA (PLC específica de células fotoreceptoras), INAC (PKC específica de células fotoreceptoras) y una proteína adaptadora (scaffold protein) denominada INAD (Inactivation No After potential D) responsable de asociar todos los componentes en un complejo. INAD posee dominios PDZ, responsables de su función adaptadora mediante interacciones proteína-proteína. Recientes estudios bioquímicos, moleculares y electrofisiológicos, sugieren que INAD representa una subunidad constitutiva del canal TRP con función adaptadora en la formación del complejo supramolecular de señalización. Esta organización multiproteica de los componentes de señalización proporciona las bases estructurales para una eficiente y rápida activación y regulación de la entrada de Ca2+ a través de canales TRP. Se describieron recientemente homólogos de INAD en distintos tipos de células de vertebrados, donde se observó que cumplen función adaptadora en la formación de complejos de señalización integrados por receptores hormonales, canales iónicos y quinasas. En este trabajo mostramos evidencias de una proteína homóloga a INAD en osteoblastos de rata y su participación en el influjo capacitativo. En síntesis, en la presente Tesis Doctoral se muestran evidencias de influjo capacitativo de calcio en distintos tipos celulares, habiendo caracterizado este influjo y estudiado exhaustivamente la modulación de cationes en el interior celular. Particularmente en osteoblastos, un sistema íntimamente relacionado con el metabolismo del calcio, demostramos la única evidencia existente sobre modulación de canales SOC por un esteroide y más precisamente, la participación de proteínas TRP e INAD asociadas a este mecanismo fisiológico vinculado a la homestasis de cationes intracelulares. / Evidences from our laboratory and others have demonstrated that the hormone 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3) modulates intracellular Ca2+ levels in skeletal muscle cells and bone tissue through a genomic mechanism, typical for steroidal hormones via specific an intracellular receptor (VDR: Vitamin D Receptor). Such molecule exhibits a cytoplasmatic-nuclear localization and the hormone-receptor complex is responsible for gene expression regulation of VDR responsive elements. Nevertheless, 1,25(OH)2D3 also modulates intracellular Ca2+ levels through a non genomic, rapid mechanism, independent of gene transcription and protein synthesis, implying direct steroid actions on the cellular membrane. Rapid or non genomic actions of 1,25(OH)2D3 requires the activation of diverse signal systems (adenylyl cyclase/cAMP/PKA; PLC/DAG/IP3/Ca2+/PKC), forming a complex mechanism that involves G proteins, positive interaction between PKA and PKC and increased protein phosphorylation. Altogether, these events lead to a rapid and transient Ca2+ release from internal stores and activation of Voltage Dependent Ca2+ Channels (VDCC) type L, followed by a sustained Ca2+ influx from the extracellular medium. In the present work by using the fluorescent Fura-2 Ca2+ dye, the effect of 1,25(OH)2D3 hormone on cytosolic Ca2+ levels in rat osteoblast cells were characterized. We have demonstrated that the 1,25(OH)2D3-induced Ca2+ influx phase is mediated by the well known VDCC channels and also that a Ca2+ partial entry contribution may occur by a non voltage dependent channels and operated by the status of internal Ca2+ stores. In this way we introduce a novel concept of SOC channels (Store Operated Channels; Capacitative Ca2+Entry) in rapid response of Ca2+ for the hormone. Accordingly, we have studied and characterized the capacitative cation entry in other cellular system derived from breast epithelium and breast cancer, both from human origen. These channels, activated by depletion and/or Ca2+ mobilization from internal stores, voltage independent and regulated by multiple intracellular signal events, involve proteins encoded by the trp family genes, first described in photoreceptor cells from Drosophila (mutants in trp: Transient Receptor Potential). Trp genes have been cloned and sequenced, their functionality as channels responsible from Ca2+ influx type SOC has been demonstrated through heterologous expression of TRP proteins. In addition, in Drosophila photoreceptor system, TPR is part of a multiproteic signal complex together with RH1 (rhodopsin), NORPA (PLC specific of photoreceptor cells), INAC (PKC specific of photoreceptor cells) and a scaffold protein named INAD (Inactivation No After potential D) responsible for the association of all components into a complex. INAD exhibits PDZ domains, responsible of its adaptor function through protein-protein interaction. Recently several biochemical, molecular and electrophysiologycal studies, suggests that INAD represents a constitutive subunit of TRP channels with an adaptor function in the supramolecular signaling complex assemble. This multiproteic organization of the signaling components provides the structural basis for an efficient and rapid activation and regulation of Ca2+ entry through TRP channels. INAD homologous sequences have been recently described in different vertebrate cells types, whereas it has been observed that plays scaffolding functions allowing the assembly of a complex composed by hormone receptors, ion channels and kinases. We demonstrated the presence of an INAD homologous protein in rat osteoblasts and its relationship to the capacitative Ca2+ influx. In summary, the present Doctoral Thesis describes the capacitative calcium entry in different cell types. We have characterized this influx and exhaustively studied the intracellular cation modulation. In particular, we have focused our efforts on osteoblast cells, a system closely dependant on calcium metabolism, and present the first evidence of SOC channels modulation by a steroid hormone and more precisely, the involvement of TRP and INAD proteins associated to this physiological mechanism in the control of intracellular Ca2+ homeostasis.

Orientador: Gisele Fabrino Machado / Banca: Felipe Augusto Ruiz Sueiro / Banca: Antonio Carlos Alessi / Resumo: A causa dos tumores da glândula perianal é desconhecida, entretanto eles podem ser modulados por influência de hormônios gonadais, basicamente a testosterona, uma vez que há uma alta prevalência (até 95%) de regressão da forma benigna dessa neoplasia após a castração dos machos. A proteína Ki-67 foi descrita pela primeira vez em 1983 é uma proteína nãohistona, que não é expressa em células na fase G0, mas que pode ser detectada nas fases ativas do ciclo celular, G1, S, G2 e mitose Verificou-se que o Ki-67 está associado com a proliferação celular, estando a população de células tumorais positivas ao Ki-67 correlacionada com a evolução clínica da doença. Foram estudados 42 casos de neoplasias da glândula perineal, sendo 15 adenomas, 15 epiteliomas, 12 carcinomas. Foram utilizadas 13 amostras de tecido de glândula perianal normal, como controle. De cada animal foram obtidas informações como: sexo, idade, raça, presença de outras neoplasias, se castrado ou não, se em caso de fêmea havia o uso de anticoncepcional, tempo de evolução, recidiva e tempo de sobrevida. Dos 42 casos de neoplasias de glândulas perianais, 34 (80,95%) foram provenientes de cães machos e 8 (19,05%) de fêmeas. A média de idade dos machos com a neoplasia foi de 9,8 anos, e das fêmeas 7,4 anos, sendo que para os dois sexos a idade variou de 5 a 15 anos. Em relação às raças, 11 (26,19%) eram S.R.D. (sem raça definida), 9 (21,42%) Poodle, 4 (9,52%) Cocker Spaniel e Husky Siberiano. O histórico de diagnóstico de outras neoplasias, foi constatado em 23,80% dos animais deste estudo. Em relação à castração, 32 (94,11%) dos machos não eram castrados e apenas 8 (19,05%) fêmeas eram. O tempo de evolução da neoplasia apresentou média de 1,2 anos. Histórico de recidiva da neoplasia foram relatados em 14 animais, sendo maior... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cause of perianal gland tumors is unknown, though they may be modulated by the influence of gonadal hormones, primarily testosterone, since there is a high prevalence (up to 95%) of regression of the benign tumor after males castration. Protein Ki-67 was first described in 1983, and it is a nonhistone protein, which is not expressed in G0 phase cells, but can be detected in the active phases of the cell cycle, G1, S, G2 and mitosis. It was found that Ki-67 is associated with cell proliferation, and the population of tumor cells positive for Ki-67 correlated with clinical outcome. In this present work we studied 42 cases of perineal gland neoplasms, being 15 adenomas, 15 epitheliomas and 12 carcinomas. We used 13 tissue samples of normal perianal gland as control. From each animal we obtained information such as gender, age, race, presence of other malignancies, neutering status, whether if there were female contraceptive use, duration, recurrence and survival time. Of the 42 cases of perianal gland neoplasms, 34 (80.95%) were from males and eight dogs (19.05%) females. The males average age with cancer was 9.8 years and 7.4 years for females and for both sexes aged between 5 and 15 years. In regard to race, 11 (26.19%) were no breed, 9 (21.42%) were Poodle, and 4 (9.52%) were Siberian Husky and Cocker Spaniels. The history of diagnosis of other cancers, was found in 23.80% of the animals in this study. In relation to castration, 32 (94.11%) of males were not castrated and only 8 (19.05%) were females. The progression of the tumor showed an average of 1.2 years. History of recurrence of cancer were reported in 14 animals, and was higher (66.66%) for carcinomas. Ki-67 staining revealed that the carcinomas showed higher proliferation rate (9.87%) compared to groups of epitheliomas... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-18Bitstream added on 2014-06-13T19:35:13Z : No. of bitstreams: 1 pereira_rs_me_araca.pdf: 790587 bytes, checksum: 194f37c505d12a98d7b75720d14a4e5f (MD5) / A causa dos tumores da glândula perianal é desconhecida, entretanto eles podem ser modulados por influência de hormônios gonadais, basicamente a testosterona, uma vez que há uma alta prevalência (até 95%) de regressão da forma benigna dessa neoplasia após a castração dos machos. A proteína Ki-67 foi descrita pela primeira vez em 1983 é uma proteína nãohistona, que não é expressa em células na fase G0, mas que pode ser detectada nas fases ativas do ciclo celular, G1, S, G2 e mitose Verificou-se que o Ki-67 está associado com a proliferação celular, estando a população de células tumorais positivas ao Ki-67 correlacionada com a evolução clínica da doença. Foram estudados 42 casos de neoplasias da glândula perineal, sendo 15 adenomas, 15 epiteliomas, 12 carcinomas. Foram utilizadas 13 amostras de tecido de glândula perianal normal, como controle. De cada animal foram obtidas informações como: sexo, idade, raça, presença de outras neoplasias, se castrado ou não, se em caso de fêmea havia o uso de anticoncepcional, tempo de evolução, recidiva e tempo de sobrevida. Dos 42 casos de neoplasias de glândulas perianais, 34 (80,95%) foram provenientes de cães machos e 8 (19,05%) de fêmeas. A média de idade dos machos com a neoplasia foi de 9,8 anos, e das fêmeas 7,4 anos, sendo que para os dois sexos a idade variou de 5 a 15 anos. Em relação às raças, 11 (26,19%) eram S.R.D. (sem raça definida), 9 (21,42%) Poodle, 4 (9,52%) Cocker Spaniel e Husky Siberiano. O histórico de diagnóstico de outras neoplasias, foi constatado em 23,80% dos animais deste estudo. Em relação à castração, 32 (94,11%) dos machos não eram castrados e apenas 8 (19,05%) fêmeas eram. O tempo de evolução da neoplasia apresentou média de 1,2 anos. Histórico de recidiva da neoplasia foram relatados em 14 animais, sendo maior... / The cause of perianal gland tumors is unknown, though they may be modulated by the influence of gonadal hormones, primarily testosterone, since there is a high prevalence (up to 95%) of regression of the benign tumor after males castration. Protein Ki-67 was first described in 1983, and it is a nonhistone protein, which is not expressed in G0 phase cells, but can be detected in the active phases of the cell cycle, G1, S, G2 and mitosis. It was found that Ki-67 is associated with cell proliferation, and the population of tumor cells positive for Ki-67 correlated with clinical outcome. In this present work we studied 42 cases of perineal gland neoplasms, being 15 adenomas, 15 epitheliomas and 12 carcinomas. We used 13 tissue samples of normal perianal gland as control. From each animal we obtained information such as gender, age, race, presence of other malignancies, neutering status, whether if there were female contraceptive use, duration, recurrence and survival time. Of the 42 cases of perianal gland neoplasms, 34 (80.95%) were from males and eight dogs (19.05%) females. The males average age with cancer was 9.8 years and 7.4 years for females and for both sexes aged between 5 and 15 years. In regard to race, 11 (26.19%) were no breed, 9 (21.42%) were Poodle, and 4 (9.52%) were Siberian Husky and Cocker Spaniels. The history of diagnosis of other cancers, was found in 23.80% of the animals in this study. In relation to castration, 32 (94.11%) of males were not castrated and only 8 (19.05%) were females. The progression of the tumor showed an average of 1.2 years. History of recurrence of cancer were reported in 14 animals, and was higher (66.66%) for carcinomas. Ki-67 staining revealed that the carcinomas showed higher proliferation rate (9.87%) compared to groups of epitheliomas... (Complete abstract click electronic access below)

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.

Introdução: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) e a via Wnt controlam o desenvolvimento de células progenitoras/tronco adrenais. NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3 estão envolvidos na manutenção de células-tronco e têm papel em vários cânceres de diferentes tecidos. Ainda não está claro se esses fatores de transcrição interagem para promover a tumorigênese adrenocortical. Objetivo: Nos tumores adrenocorticais (TAC): avaliar o ganho de material genômico e a expressão de RNAm e proteica de DAX1 e SF1; avaliar a expressão de RNAm e proteica de marcadores de células-tronco (NANOG, OCT4, SOX2 e STAT3). No desenvolvimento do córtex adrenal: avaliar a expressão proteica desses genes. In vitro: avaliar a interação entre a via Wnt/Beta-catenina e a expressão de NANOG. Pacientes e Métodos: Painel de 30 córtices adrenais fetais humanos (20-38 semanas de gestação) e 14 pós-natais. Pacientes com TAC: 96 crianças/adolescentes (81% do sexo feminino, idade mediana de 1,6 anos [0,4 a 15,6 anos]) e 18 adultos (10 adenomas e 8 carcinomas, 89% do sexo feminino e idade mediana de 42,5 anos [21-66 anos]). Tecidos adrenais normais (controles para qPCR e MLPA): 13 crianças (idade mediana de 3 anos) e 13 adultos (mediana de idade de 48 anos). A expressão proteica de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 foi avaliada por imunohistoquímica nos TAC e nos córtices adrenais fetais e pós-natais. A expressão de RNAm de NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG e POU5F1 (OCT4) foi avaliada por qPCR nos TAC. Ganho ou perda de material genômico de NR0B1 e NR5A1 foi avaliada por MLPA nos TAC. In vitro, a expressão de NANOG (qPCR) foi avaliada em células adrenais H295 antes e após inibição da via Wnt/Beta-catenina com a substância PNU-74654. Resultados: Em adrenais fetais com 20 e 25 semanas de gestação detectou-se marcação intensa de SF1, DAX1, SOX2 e OCT4 na região subcapsular e marcação leve a moderada e difusa de STAT3 e NANOG. Após as 31 semanas e no período pós-natal, a marcação intensa de SF1 persistiu, porém a marcação de DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 diminuiu ou desapareceu. Nos TAC, a marcação nuclear de SF1 foi positiva em 67% das amostras pediátricas e em 19% das amostras de adultos. Ganho de material genômico do NR5A1 foi observado em 71% dos TAC pediátricos e 33% de TAC adultos. Porém observou-se hipoexpressão do RNAm do NR5A1 em 84% dos TAC pediátricos. Nenhum ganho de material genômico ou aumento da expressão do RNAm do NR0B1 foi observado nos TAC pediátricos. Porém em 45% desses tumores detectou-se marcação nuclear. Nos TAC de pacientes adultos, houve aumento da expressão de RNAm de NR0B1 em 89% das amostras. Não se observou marcação de STAT3 nos TAC pediátricos e adultos. Porém nos pacientes adultos, a expressão do RNAm de STAT3 foi significativamente maior nos adenomas do que nos carcinomas. Por sua vez, a marcação nuclear do OCT4 associou-se significativamente com a ocorrência de metástases nos pacientes pediátricos. Nos TAC com a mutação p.S45P no gene da Beta-catenina detectou-se expressão significativamente aumentada do RNAm do NANOG. Além disso, após a inibição in vitro da via Wnt/Beta-catenina nas células tumorais adrenais houve redução significativa na expressão do RNAm de NANOG. Conclusão: Existe um padrão temporal na expressão de SF1, DAX1, STAT3, NANOG e OCT4 durante o desenvolvimento do córtex adrenal fetal, porém apenas a expressão de SF1 permanece no final da gestação e após o nascimento. TAC pediátricos exibem ganho de material gênico, aumento da expressão proteica e aparentemente redução paradoxal do RNAm do SF1 (NR5A1). Marcação nuclear de OCT4 se associa a fenótipo tumoral mais agressivo nos pacientes pediátricos. Parece exisitir interação entre a via Wnt/Beta-catenina e células-tronco, por meio do fator de transcrição NANOG, na tumorigênese adrenocortical. / Background: DAX1 (NR0B1), SF1 (NR5A1) and the Wnt pathway control adrenal stem/progenitor cells development. NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3 are involved in the maintenance of stem cells and have role in various types of cancers in different tissues. It is still unclear whether these transcription factors interact to promote adrenocortical tumorigenesis. Objective: In adrenocortical tumors (ACT): to evaluate the gain of genomic material and the expression of mRNA and protein of DAX1 and SF1; to evaluate the mRNA and protein expression of stem cell markers (NANOG, OCT4, SOX2 and STAT3). In the development of the adrenal cortex: to evaluate the protein expression of these genes. In vitro: to evaluate the interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and NANOG expression. Patients & Methods: Panel of 30 fetal human adrenal cortices (20-38 gestational weeks) and 14 postnatal human adrenal cortices. ACT Patients: 96 children/ teenagers (81% female; median age of 1.6 years; 0.4-15.6 years) and 18 adults (10 adenomas and 8 carcinomas; 89% female; median age of 42.5 years; 21-66 years). Normal adrenal tissues (qPCR and MLPA controls): 13 children (median age of 3 years) and 13 adults (median age of 48 years). Protein expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 was assessed by immunohistochemistry in ACT, fetal and postnatal adrenal cortices. The mRNA expression of NR0B1, NR5A1, STAT3, NANOG and POU5F1 (OCT4) was assessed by qPCR in ACT. Gain or loss of NR0B1 and NR5A1 genomic material was assessed by MLPA in ACT. In vitro, NANOG expression (qPCR) was evaluated in H295 adrenal cells before and after inhibition of the Wnt/Beta-catenin pathway with PNU-74654. Results: In the adrenal glands at 20 and 25 gestational weeks, intense staining of SF1, DAX1, SOX2 and OCT4 was detected in the subcapsular region and a diffuse pattern mild to moderate staining of STAT3 and NANOG. After 31 weeks and in the postnatal period, intense SF1 staining persisted, but the staining of DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 decreased or disappeared. In the ACT, the nuclear staining of SF1 was positive in 67% of pediatric samples and in 19% of adult samples. Gain of NR5A1 genomic material was observed in 71% of pediatric ACT and 33% of adult ACT. However, hypoexpression of NR5A1 mRNA was observed in 84% of pediatric ACT. No gain of genomic material or increase in mRNA expression of NR0B1 was observed in pediatric ACT. However, in 45% of these tumors nuclear staining was detected. In adult ACT, there was an increase in NR0B1 mRNA expression in 89% of the samples. No STAT3 staining was found in pediatric and adult ACT. However, in adult ACT, the STAT3 mRNA expression was significantly higher in adenomas than in carcinomas. In turn, the nuclear marking of OCT4 was significantly associated with the occurrence of metastases in pediatric patients. In the TACs with the p.S45P mutation in the Beta-catenin gene significantly increased NANOG mRNA expression was detected. In addition, after in vitro inhibition of the Wnt / Beta-catenin pathway in adrenal tumor cells there was a significant reduction in NANOG mRNA expression. Conclusion: There is a temporal pattern in the expression of SF1, DAX1, STAT3, NANOG and OCT4 during the development of the fetal adrenal cortex, but only SF1 expression remains at the end of gestation and after birth. Pediatric ACT show gain in NR5A1 gene material, increase in its protein expression but an apparent paradoxical reduction of mRNA. Nuclear staining of OCT4 is associated with more aggressive tumor phenotype in pediatric patients. There appears to be an interaction between the Wnt/Beta-catenin pathway and stem cells via NANOG, in adrenocortical tumorigenesis.