Der Folsäureantagonist Methotrexat (MTX) wird zur Behandlung onkologischer und rheumatoider Erkrankungen eingesetzt. Die Aufnahme des Methotrexats in die Zielzelle ist dabei Vorraussetzung für die Bindung an seine intrazellulären Zielstrukturen und erfolgt über verschiedene Transportsysteme. In diesem Zusammenhang ist bei entsprechenden Plasma-konzentrationen von MTX der Reduced Folate Carrier (RFC1) von besonderer Bedeutung. 1994 konnte erstmals die cDNA dieses Transporters aus Maus- und Hamstergewebe isoliert werden. Die cDNA für einen mit dem RFC1 identischen hepatozellulären MTX-Transporter der Ratte wurde 2000 kloniert. Vorhergehende Gen-Expressionsstudien zeigten, dass die RFC1-mRNA ubiquitär gebildet wird. Die Proteinexpression wurde jedoch bisher nur in ausgewählten Geweben der Maus untersucht. Systematische Arbeiten, in denen in vergleichender Weise sowohl die RFC1 Gen- als auch die Proteinexpression in allen Geweben mit einer möglichen Relevanz für die Folat- und Antifolataufnahme, Speicherung und Eliminierung untersucht werden, fehlten bisher. Insbesondere die Expression des RFC1-Proteins der Ratte (rRFC1) mittels immunologischer Verfahren ist bisher nicht beschrieben worden. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Gen- und Proteinexpression des rRFC1 in ausgewählten Geweben der Ratte darzustellen. Dieses schließt die Generierung spezifischer Antiseren gegen den rRFC1 als ersten Schritt mit ein. Es wurden geeignete antigene Aminosäuresequenzen des rRFC1 bestimmt und die entsprechenden cDNA Sequenzen wurden amplifiziert und in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert. Rekombinante rRFC1 Fusionsproteine konnten mittels E. coli Zellen hergestellt und anschließend aufgereinigt werden. Nachfolgend wurden entweder die rRFC1 Fusionsproteine oder die rRFC1 spezifischen Peptide, welche von dem Affinitätspeptid separiert worden waren, für die Immunisierung von Kaninchen verwendet Drei Antiseren mit ausreichender Reaktivität und Spezifität konnten gewonnen und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Die erhaltenen Antiseren sind gegen die intrazellulären N- und C-terminalen Regionen (ID1, ID7) bzw. gegen die erste extrazelluläre Schleife (OD1) gerichtet. In Western-Blot Studien konnte mittels dieser Antiseren für den rRFC1, der in transfizierten Nierenepithelzellen (MDCK-rRFC-HA) stabil exprimiert wurde, ein Molekulargewicht von 71 kD für die glykosylierte Form und von 53 kD für die unglykosylierte Form ermittelt werden. Weiter konnte belegt werden, dass das Protein in MDCK-rRFC1-HA Zellen überwiegend in der glycosylierten Form vorliegt. Mittels RT-PCR Analysen wurde die Genexpression des rRFC1 in allen untersuchten Geweben nachgewiesen. Besonders hohe mRNA-Gehalte waren in Thymus, Niere und Milz vorhanden, während in Herz- und Muskelgewebe sowie in Leukozyten nur ein Signal nahe der Nachweisgrenze detektierbar war. Durch immunhistologische Untersuchungen konnten die rRFC1 Proteinexpression und beträchtliche Unterschiede in der Signalintensität bestätigt werden. Zusätzlich konnten neue Informationen über die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation gewonnen werden: so konnte eine starke Expression des Transporters in der apikalen Membran von Dünn- und Dickdarmmukosa dargestellt werden, während die ebenfalls starke Färbung in der Niere auf den Bereich der basolateralen Membran der Tubuli beschränkt war. In der Leber war eine Expression mittlerer Intensität im Bereich der Lebertrias erkennbar. Während in der Milz nur in der roten Pulpa das RFC1-Protein detektiert wurde, konnten im Thymus sowohl in der Rinde als auch im Mark positive Zellen nachgewiesen werden. Im Hoden konnte der Transporter in den Sertoli-Zellen dargestellt werden. Eine starke Expression des Transporters wurde im Gehirn im Bereich der apikalen Membran der Ependymzellen des Plexus choroideus nachgewiesen. In der Skelettmuskulatur und im Herzgewebe beschränkte sich die Expression des rRFC1 auf das Perimysium des Muskelgewebes und auf kleinere Gefäße des Muskel- und Herzgewebes. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass der RFC1 der Ratte ubiquitär exprimiert wird, wobei die Expressionsstärke jedoch stark variiert. Die beobachtete Gewebslokalisation des RFC1 belegt sowohl dessen zentrale Rolle in der Folathomöostase als auch in der MTX vermittelten Organtoxizität und Pharmakokinetik, insbesondere bei der intestinalen Resorption sowie der hepatischen und renalen Exkretion.

The feasibility of most gene therapy strategies depends on the efficient delivery of DNA to target cells and tissues. Current gene delivery carriers can be divided into two classes: viral and non-viral delivery systems. Although the viral carriers are highly efficient due to their invasive nature, safety concerns may restrict their application in clinical settings. Synthetic non-viral carriers attract increasing attention because they are less toxic and allow readily modification. Non-viral carrier mediated gene delivery involves several processes. They must condense DNA into small particles, allow membrane penetration and protect DNA from extracellular and intracellular degradative enzymes. In the present study, a small library of carriers containing various combinations of cell penetrating peptide TAT, SV40 large T protein nuclear localisation signal (NLS) and cationic dendrimer of 7 lysine residues (DEN) was synthesised and tested for their ability to deliver DNA to mammalian cells. We evaluated the contribution of each component as well as the combination of the components on DNA condensation, uptake and gene expression. It was found that all carriers condensed DNA and protected DNA from DNase degradation. We showed that the TAT peptide was essential, but not sufficient, for uptake of exogenous DNA. The addition of either NLS or DEN significantly enhanced uptake. The most efficient carrier contained all three components (DEN-NLS-TAT). The carriers were able to deliver DNA in the presence of serum and were non-toxic to cells at up to 30 μM. However, for those peptides that facilitated DNA uptake, the complexes were targeted to intracellular compartments that required a fusogenic agent, such as chloroquine, before gene expression was observed. Modifications were introduced to the initial carrier library in order to circumvent the chloroquine dependence. The addition of cell penetrating peptide penetratin, virus derived fusogenic peptide or lipoamino acid C12 enhanced either DNA uptake or endosomal release. However, none of the modified carriers were able to produce high level transgene expression in the absence of chloroquine. We also found that the carriers containing lipid components were able to deliver DNA to T-lymphocytes derived cells, which are usually resistant to transfection. However, the toxicity of the lipid-based carriers needs to be reduced before further application. We also evaluated the function of chloroquine as a gene expression enhancer. We demonstrated that chloroquine did not enhance expression solely by promoting endosomal release. This was supported by the fact that fusogenic peptide and endosomal disruptive reagents (bafilomycin A1 and monensin) did not improve gene expression. Other properties of chloroquine, such as DNA protection and transcription enhancement, may also contribute to gene expression. We characterised the uptake mechanism of DEN-NLS-TAT in HeLa cell lines. We found that the uptake of DEN-NLS-TAT/DNA complex in HeLa cell line was mainly via receptor-mediated endocytosis and caveolae endocytosis. Moreover, various intracellular processes, such as intact cytoskeleton and microtubule network, tyrosine and PI 3 kinase activity, and membrane cholesterol were also required for the uptake of the carrier/DNA complex. In conclusion, the results from the present study demonstrated that multi-component peptide-based carriers are versatile carriers for the delivery of plasmid DNA in human cells. The results have improved our understanding of the role of chloroquine as a widely used gene expression enhancer which may be useful in the future improvement of non-viral gene delivery carriers. A strategy to overcome the dependence on chloroquine for gene expression or reduce the toxicity of chloroquine will be necessary for further in vivo applications. The current carrier library may also be used to delivery other cargos such as siRNA or protein to human cells.

Thesis (Ph. D.)--University of Oregon, 2007. / Typescript. Includes vita and abstract. Includes bibliographical references (leaves 81-88). Also available for download via the World Wide Web; free to University of Oregon users.

Thesis (Ph. D. in Neuroscience)--Vanderbilt University, May 2008. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--Virginia Commonwealth University, 2007. / Prepared for: Dept. of Microbiology and Immunology. Bibliography: leaves 127-137. Available online via the Internet.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph. D.)--Ohio University, November, 1999. / Title from PDF t.p.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2007. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2008. / Includes bibliographical references (leaves 229-257). Also available in electronic version.

Thesis (M.S.)--University of Missouri-Columbia, 2008. / The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Title from title screen of research.pdf file (viewed on August 28, 2008) Vita. Includes bibliographical references.