As principais propriedades farmacológicas da Casearia sylvestris, uma espécie de árvore cujas folhas são utilizadas na medicina popular, já foram descritas na literatura. Recentemente foi demonstrada a potente atividade citotóxica in vitro da casearina X (CAS X), o diterpeno clerodânico majoritário isolado das folhas de C. sylvestris, contra linhagens de células tumorais humanas. Apesar dos resultados promissores, sua potente atividade citotóxica in vitro não pode ser extrapolada para uma potente atividade in vivo, a menos que possua boa biodisponibilidade e duração desejável do seu efeito. Tendo em vista que o avanço nas pesquisas de produtos naturais requer a avaliação pré-clínica de propriedades farmacocinéticas, no presente trabalho foi realizada a caracterização in vitro do metabolismo e da absorção intestinal da CAS X, com o objetivo de prever sua biodisponibilidade in vivo. Para os estudos de metabolismo in vitro, foi utilizado o modelo microssomal hepático de ratos e de humanos. Foi desenvolvido um método analítico para a quantificação da CAS X em microssomas, empregando a precipitação de proteínas com acetonitrila no preparo das amostras e a cromatografia líquida de alta eficiência para as análises. O método foi validado de acordo com os guias oficiais da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e da European Medicine Agency (EMA). A CAS X demonstrou ser substrato para as reações de hidrólise mediada pelas carboxilesterases (CES) e apresentou um perfil cinético de Michaelis-Menten. Foram estimados os parâmetros de Vmax e KM, demonstrando que o clearance intrínseco em microssomas hepático de humanos foi 1,7 vezes maior que o de ratos. O clearance hepático foi estimado por extrapolação in vitro-in vivo, resultando em mais de 90% do fluxo sanguíneo hepático em ambas as espécies. Um estudo qualitativo para a pesquisa de metabólitos foi feito utilizando espectrometria de massas, pelo qual foi possível sugerir a formação da casearina X dialdeído como produto de metabolismo. Nos estudos de absorção intestinal in vitro foi utilizado o modelo de monocamadas de células Caco-2. Um método analítico por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas foi desenvolvido e validado de acordo com o EMA, para as etapas de quantificação da CAS X no sistema de células. Os parâmetros cinéticos de permeabilidade aparente absortiva e secretória da CAS X foram estimados em um sistema celular, no qual a atividade hidrolítica da CES foi inibida. Assim, a CAS X foi capaz de permear a monocamada de células Caco-2, provavelmente por transporte ativo, sem a ocorrência de efluxo, mas com significativa retenção do composto dentro das células. Em conjunto, os ensaios in vitro realizados demonstraram a susceptibilidade da CAS X ao metabolismo de primeira passagem, como substrato para as CES específicas expressas no fígado e intestino. / Casearia sylvstris leaves are commonly used by folk medicine and its main pharmacological properties were already described in the literature. Casearin X (CAS X) is the major clerodane diterpene isolated from the leaves of C. sylvestris. Recently, the in vitro cytotoxic activity of the CAS X was demonstrated against human tumor cells lineages. Despite promising results, the CAS X in vitro cytotoxic activity cannot be extrapolated to an in vivo activity, unless the compound has good bioavailability and desirable duration of its effect. The advance in natural products research requires a pharmacokinetic preclinical assessment to justify a therapeutic indication. Thereby, this present work aims to predict the CAS X in vivo bioavailability, by the in vitro characterization of the metabolism and intestinal absorption. The rat and human hepatic microsomal model was used for in vitro metabolism studies. An analytical method for quantification of CAS X in microsomes was developed, employing protein precipitation with acetonitrile for sample preparation and High Performance Liquid Chromatography for analysis. This method was validated in according to Agência Nacional de Vigilância Sanitária and European Medicine Agency guidelines (EMA). CAS X demonstrated to be substrate for carboxylesterases (CES) by hydrolysis reaction, with a Michaelis-Menten kinetic profile. The parameters Vmax and KM was estimated and the intrinsic clearance was 1.7-fold higher in humans than rats. The hepatic clearance was estimated by in vitro-in vivo extrapolation, resulting in more than 90% of the hepatic blood flow for both species. A qualitative study was carried out for the metabolite identification, using Mass Spectrometry, suggesting the formation of casearin X dialdehyde as metabolism product. Monolayer of Caco-2 cells was used for the in vitro intestinal absorption studies. An analytical method by Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry was developed and validated, according to EMA, for the quantification of CAS X in cells systems. The apparent permeability was estimated in both, absorptive and secretory directions, using cells monolayers with inhibited CES hydrolysis. CAS X was able to cross the Caco-2 cells monolayer, probably by active transport, with no significant efflux, but with a high retention of the compound inside the cells. These findings demonstrated that CAS X is susceptible to first-pass metabolism, as substrate for specific CES expressed in both, liver and intestine.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Sabendo da importÃncia de cÃlulas de mamÃferos em cultura para avaliar a citotoxicidade de novas substÃncias com aÃÃo terapÃutica, o presente trabalho determinou, inicialmente, a atividade citotÃxica por MTT e hemolÃtica de 7 diterpenos clerodanos (Ãcido hardiwickiico, casearinas L, O, U e sua forma degradada, e casearinas X e Y) isolados a partir das folhas de Casearia sylvestris frente a um painel de 9 linhagens de cÃlulas tumorais e a eritrÃcitos de camundongos. Na ausÃncia de hemÃlise de todos os diterpenos, a Casearina U (Cas U) mostrou ser o mais ativo contra cÃlulas tumorais. A atividade citotÃxica da Cas U parece depender do anel formado pelos carbonos C-18 e C-19, uma vez que a hidrÃlise Ãcida e sua abertura levam à diminuiÃÃo ou perda total da bioatividade. Posteriormente, os estudos de mecanismo de aÃÃo com a Cas U (0,4; 0,8 e 1,6 Âg/mL) revelaram reduÃÃo concentraÃÃo-dependente na viabilidade celular por azul de tripan e na sÃntese de DNA por incorporaÃÃo de BrdU, sendo o mecanismo antiproliferativo da Cas U independente de aÃÃo inibitÃria sobre a topoisomerase I. As anÃlises morfolÃgicas feitas por hematoxilina/eosina e por incorporaÃÃo de brometo de etÃdio/laranja de acridina mostraram alteraÃÃo no padrÃo de morte em favorecimento da necrose proporcional à concentraÃÃo, como desintegraÃÃo membranar e picnose nuclear (1,6 Âg/mL), embora tenha ocorrido tambÃm retraÃÃo celular, condensaÃÃo e fragmentaÃÃo da cromatina nucleares (0,4 e 0,8 Âg/mL), sinais condizentes com apoptose. Nos ensaios de fragmentaÃÃo do DNA por citometria de fluxo e de genotoxicidade por cometa, a atividade da Cas U foi concentraÃÃo-dependente e sem diferenciaÃÃo entre cÃlulas normais (linfÃcitos perifÃricos humanos) e cancerosas (HL-60). A avaliaÃÃo antitumoral (10 e 25 mg/kg/dia, intraperitoneal; 25 mg/kg/dia, oral) em camundongos transplantados com Sarcoma 180 revelou atividade apenas na maior dose via intraperitoneal, causando reduÃÃo de 90 % do crescimento tumoral e alteraÃÃes renais incipientes e reversÃveis, enfatizando a potencialidade da Cas U como molÃcula modelo para a sÃntese de novos compostos com propriedades anti-cÃncer. / Knowing the importance of mammalian cell culture in evaluating the cytotoxicity of new substances with therapeutic action, this work initially examined the cytotoxicity (by MTT assay) and hemolytic activity of 7 clerodane diterpenoids (acid hardiwickiico, casearins L, O and U and its degradation product, and casearins X and Y) isolated from leaves of Casearia sylvestris against a panel of 9 tumor cell lines and on mouse erythrocytes. All diterpenes studied showed no hemolytic effect, while casearin U (Cas U) was found to be the most active against tumor cells. Cytotoxic activity of Cas U seems to depend on the ring structure formed by carbons C-18 and C-19, since acid hydrolysis and ring opening led to a decrease or total loss of bioactivity. Subsequently, studies on the mechanism of action of Cas U (0.4, 0.8 and 1.6 Âg/mL) revealed a concentration-dependent decrease in cell viability as determined by trypan blue dye exclusion and in DNA synthesis assayed by BrdU incorporation, where this antiproliferative mechanism of Cas U was not found to be dependent on an inhibitory action on topoisomerase I. Morphological analysis assessed by hematoxylin/eosin and ethidium bromide/acridine orange staining showed alterations in the pattern of cell death toward necrosis according to concentration, as seen by membrane disintegration and pyknotic nuclei (1.6 Âg/mL). However, there also were cell volume reduction, and condensation and fragmentation of nuclear chromatin, consistent signs with apoptosis. DNA fragmentation was examined by flow cytometry and genotoxicity determined with the comet assay, and Cas U activity was found to be dependent on concentration but did not differ between normal (human peripheral lymphocytes) and malignant (HL-60) cells. Antitumor activity of Cas U was tested in mice transplanted with sarcoma 180 (10 and 25 mg/kg/day, intraperitoneally; 25 mg/kg/day, orally), and only the highest intraperitoneal dose was found to effective, leading to 90 % inhibition of tumor growth, with reversible changes in the kidneys. These findings point to the potential of Cas U as a model molecule to synthesize new compounds with anticancer properties.