As principais propriedades farmacológicas da Casearia sylvestris, uma espécie de árvore cujas folhas são utilizadas na medicina popular, já foram descritas na literatura. Recentemente foi demonstrada a potente atividade citotóxica in vitro da casearina X (CAS X), o diterpeno clerodânico majoritário isolado das folhas de C. sylvestris, contra linhagens de células tumorais humanas. Apesar dos resultados promissores, sua potente atividade citotóxica in vitro não pode ser extrapolada para uma potente atividade in vivo, a menos que possua boa biodisponibilidade e duração desejável do seu efeito. Tendo em vista que o avanço nas pesquisas de produtos naturais requer a avaliação pré-clínica de propriedades farmacocinéticas, no presente trabalho foi realizada a caracterização in vitro do metabolismo e da absorção intestinal da CAS X, com o objetivo de prever sua biodisponibilidade in vivo. Para os estudos de metabolismo in vitro, foi utilizado o modelo microssomal hepático de ratos e de humanos. Foi desenvolvido um método analítico para a quantificação da CAS X em microssomas, empregando a precipitação de proteínas com acetonitrila no preparo das amostras e a cromatografia líquida de alta eficiência para as análises. O método foi validado de acordo com os guias oficiais da Agência Nacional de Vigilância Sanitária e da European Medicine Agency (EMA). A CAS X demonstrou ser substrato para as reações de hidrólise mediada pelas carboxilesterases (CES) e apresentou um perfil cinético de Michaelis-Menten. Foram estimados os parâmetros de Vmax e KM, demonstrando que o clearance intrínseco em microssomas hepático de humanos foi 1,7 vezes maior que o de ratos. O clearance hepático foi estimado por extrapolação in vitro-in vivo, resultando em mais de 90% do fluxo sanguíneo hepático em ambas as espécies. Um estudo qualitativo para a pesquisa de metabólitos foi feito utilizando espectrometria de massas, pelo qual foi possível sugerir a formação da casearina X dialdeído como produto de metabolismo. Nos estudos de absorção intestinal in vitro foi utilizado o modelo de monocamadas de células Caco-2. Um método analítico por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas foi desenvolvido e validado de acordo com o EMA, para as etapas de quantificação da CAS X no sistema de células. Os parâmetros cinéticos de permeabilidade aparente absortiva e secretória da CAS X foram estimados em um sistema celular, no qual a atividade hidrolítica da CES foi inibida. Assim, a CAS X foi capaz de permear a monocamada de células Caco-2, provavelmente por transporte ativo, sem a ocorrência de efluxo, mas com significativa retenção do composto dentro das células. Em conjunto, os ensaios in vitro realizados demonstraram a susceptibilidade da CAS X ao metabolismo de primeira passagem, como substrato para as CES específicas expressas no fígado e intestino. / Casearia sylvstris leaves are commonly used by folk medicine and its main pharmacological properties were already described in the literature. Casearin X (CAS X) is the major clerodane diterpene isolated from the leaves of C. sylvestris. Recently, the in vitro cytotoxic activity of the CAS X was demonstrated against human tumor cells lineages. Despite promising results, the CAS X in vitro cytotoxic activity cannot be extrapolated to an in vivo activity, unless the compound has good bioavailability and desirable duration of its effect. The advance in natural products research requires a pharmacokinetic preclinical assessment to justify a therapeutic indication. Thereby, this present work aims to predict the CAS X in vivo bioavailability, by the in vitro characterization of the metabolism and intestinal absorption. The rat and human hepatic microsomal model was used for in vitro metabolism studies. An analytical method for quantification of CAS X in microsomes was developed, employing protein precipitation with acetonitrile for sample preparation and High Performance Liquid Chromatography for analysis. This method was validated in according to Agência Nacional de Vigilância Sanitária and European Medicine Agency guidelines (EMA). CAS X demonstrated to be substrate for carboxylesterases (CES) by hydrolysis reaction, with a Michaelis-Menten kinetic profile. The parameters Vmax and KM was estimated and the intrinsic clearance was 1.7-fold higher in humans than rats. The hepatic clearance was estimated by in vitro-in vivo extrapolation, resulting in more than 90% of the hepatic blood flow for both species. A qualitative study was carried out for the metabolite identification, using Mass Spectrometry, suggesting the formation of casearin X dialdehyde as metabolism product. Monolayer of Caco-2 cells was used for the in vitro intestinal absorption studies. An analytical method by Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry was developed and validated, according to EMA, for the quantification of CAS X in cells systems. The apparent permeability was estimated in both, absorptive and secretory directions, using cells monolayers with inhibited CES hydrolysis. CAS X was able to cross the Caco-2 cells monolayer, probably by active transport, with no significant efflux, but with a high retention of the compound inside the cells. These findings demonstrated that CAS X is susceptible to first-pass metabolism, as substrate for specific CES expressed in both, liver and intestine.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) é um dos principais responsáveis por infecções nosocomiais, sendo identificado também em infecções associadas à comunidade. Embora potentes fármacos anti-estafilocócicos estejam disponíveis, as infecções causadas por este patógeno continuam a apresentar significativa morbidade e mortalidade devido ao aparecimento de cepas com resistência a múltiplos fármacos, incluindo vancomicina e teicoplanina. Compostos 5-nitro-heterocíclicos com estrutura análoga à nifuroxazida, antimicrobiano utilizado em infecções gastrintestinais, têm apresentado satisfatória atividade in vitro frente a estas cepas multirresistentes, sendo importante e necessária a avaliação de sua biodisponibilidade oral como próximo estágio no desenvolvimento de um novo fármaco, visando à seleção eficiente e ao aprimoramento da estrutura molecular. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo empregar ensaios in vitro, utilizando células Caco-2, e métodos in silico, utilizando descritores moleculares VolSurf, a fim de analisar a permeabilidade de análogos à nifuroxazida com atividade antimicrobiana apresentando, principalmente, atividade potencial frente a cepas multirresistentes de S. aureus. Empregou-se o método de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para a avaliação da citotoxicidade. Nos estudos de permeabilidade in vitro foram utilizadas membranas de células Caco-2 cultivadas em placas Transwel® por 21 dias. A quantificação das frações permeadas foi realizada por cromatografia a líquido de alta eficiência com detecção UV (CLAE-UV), com métodos validados de acordo com a Resolução 899/03. Os estudos in silico foram realizados por meio de análise exploratória, pelo método de consenso de análise de componentes principais (CPCA, Consensus Principal Component Analysis), e análise de regressão, por quadrados mínimos parciais (PLS, Partial Least Squares). As células Caco-2 apresentaram viabilidade adequada para a realização dos estudos de permeabilidade frente a todos os derivados da nifuroxazida, exceto o derivado MeTIO (5-nitro-2-tiofilideno 4-metilbenzidrazida). Os valores de permeabilidade aparente (Papp) obtidos para os análogos à nifuroxazida indicam que estes possuem alta permeabilidade. Os modelos obtidos por CPCA e PLS foram capazes de separar as moléculas em grupos de compostos de baixa, média e alta permeabilidade, sendo os análogos à nifuroxazida classificados como compostos de alta permeabilidade. Para os compostos em estudo, as propriedades determinantes da permeabilidade através de células Caco-2, de acordo com os modelos, seriam de natureza topológica e estérica, sendo possível a previsão externa qualitativa e quantitativa da permeabilidade através de células Caco-2. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the main pathogens responsible for nosocomial infections, also identified in community-associated infections. Although potent anti-staphylococcal drugs are available, infections caused by this bacteria continues to show significant morbidity and mortality due to the emergence of strains with resistance to multiple drugs, including vancomycin and teicoplanin. The 5-nitro-heterocyclic derivatives of nifuroxazide, which is an antimicrobial used to treat gastrointestinal infections, have shown satisfactory in vitro activity against multidrug-resistant strains of S. aureus. As a next step in the development of a new drug, it is important and necessary the evaluation of the oral bioavailability to achieve an efficient selection and refinement of the molecular structure. In this context, this study aims to develop in vitro assays through Caco-2 cells, and in silico approaches, using VolSurf molecular descriptors, in order to analyze the permeability of 5-nitro-heterocyclic compounds analogues to nifuroxazide with antimicrobial activity, especially showing promising activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus. The MTT (bromide 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) method was employed to perform the cytotoxicity evaluation. Caco-2 cell monolayers cultivated for 21 days in Transwel® plates were used for the in vitro permeability assays. The quantification of the permeated fractions was done by High Performance Liquid Chromatography with UV detection (HPLC-UV), with validated methods according to the Resolution 899/03. In silico studies were performed through exploratory analysis by consensus principal component analysis (CPCA) and regression analysis by partial least squares (PLS). Caco-2 cells showed suitable cell viability for the permeability studies against all nifuroxazide analogues except the MeTIO (5-nitro-2-thiophilydene 4-methylbenzidrazide). The nifuroxazide derivatives apparent permeability values (Papp) obtained indicate these are high permeable compounds. The models obtained by CPCA and PLS were able to separate the molecules into groups of low, medium and high permeabilities, and the nifuroxazide analogues were classified as high permeable substances. The identified properties for the permeability through Caco-2 cells to the studied compounds were topologic and sterical, and it is possible to perform qualitative and quantitative external predictions with these models for the permeability through Caco-2 cells.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) é um dos principais responsáveis por infecções nosocomiais, sendo identificado também em infecções associadas à comunidade. Embora potentes fármacos anti-estafilocócicos estejam disponíveis, as infecções causadas por este patógeno continuam a apresentar significativa morbidade e mortalidade devido ao aparecimento de cepas com resistência a múltiplos fármacos, incluindo vancomicina e teicoplanina. Compostos 5-nitro-heterocíclicos com estrutura análoga à nifuroxazida, antimicrobiano utilizado em infecções gastrintestinais, têm apresentado satisfatória atividade in vitro frente a estas cepas multirresistentes, sendo importante e necessária a avaliação de sua biodisponibilidade oral como próximo estágio no desenvolvimento de um novo fármaco, visando à seleção eficiente e ao aprimoramento da estrutura molecular. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo empregar ensaios in vitro, utilizando células Caco-2, e métodos in silico, utilizando descritores moleculares VolSurf, a fim de analisar a permeabilidade de análogos à nifuroxazida com atividade antimicrobiana apresentando, principalmente, atividade potencial frente a cepas multirresistentes de S. aureus. Empregou-se o método de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) para a avaliação da citotoxicidade. Nos estudos de permeabilidade in vitro foram utilizadas membranas de células Caco-2 cultivadas em placas Transwel® por 21 dias. A quantificação das frações permeadas foi realizada por cromatografia a líquido de alta eficiência com detecção UV (CLAE-UV), com métodos validados de acordo com a Resolução 899/03. Os estudos in silico foram realizados por meio de análise exploratória, pelo método de consenso de análise de componentes principais (CPCA, Consensus Principal Component Analysis), e análise de regressão, por quadrados mínimos parciais (PLS, Partial Least Squares). As células Caco-2 apresentaram viabilidade adequada para a realização dos estudos de permeabilidade frente a todos os derivados da nifuroxazida, exceto o derivado MeTIO (5-nitro-2-tiofilideno 4-metilbenzidrazida). Os valores de permeabilidade aparente (Papp) obtidos para os análogos à nifuroxazida indicam que estes possuem alta permeabilidade. Os modelos obtidos por CPCA e PLS foram capazes de separar as moléculas em grupos de compostos de baixa, média e alta permeabilidade, sendo os análogos à nifuroxazida classificados como compostos de alta permeabilidade. Para os compostos em estudo, as propriedades determinantes da permeabilidade através de células Caco-2, de acordo com os modelos, seriam de natureza topológica e estérica, sendo possível a previsão externa qualitativa e quantitativa da permeabilidade através de células Caco-2. / Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the main pathogens responsible for nosocomial infections, also identified in community-associated infections. Although potent anti-staphylococcal drugs are available, infections caused by this bacteria continues to show significant morbidity and mortality due to the emergence of strains with resistance to multiple drugs, including vancomycin and teicoplanin. The 5-nitro-heterocyclic derivatives of nifuroxazide, which is an antimicrobial used to treat gastrointestinal infections, have shown satisfactory in vitro activity against multidrug-resistant strains of S. aureus. As a next step in the development of a new drug, it is important and necessary the evaluation of the oral bioavailability to achieve an efficient selection and refinement of the molecular structure. In this context, this study aims to develop in vitro assays through Caco-2 cells, and in silico approaches, using VolSurf molecular descriptors, in order to analyze the permeability of 5-nitro-heterocyclic compounds analogues to nifuroxazide with antimicrobial activity, especially showing promising activity against multidrug-resistant Staphylococcus aureus. The MTT (bromide 3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) method was employed to perform the cytotoxicity evaluation. Caco-2 cell monolayers cultivated for 21 days in Transwel® plates were used for the in vitro permeability assays. The quantification of the permeated fractions was done by High Performance Liquid Chromatography with UV detection (HPLC-UV), with validated methods according to the Resolution 899/03. In silico studies were performed through exploratory analysis by consensus principal component analysis (CPCA) and regression analysis by partial least squares (PLS). Caco-2 cells showed suitable cell viability for the permeability studies against all nifuroxazide analogues except the MeTIO (5-nitro-2-thiophilydene 4-methylbenzidrazide). The nifuroxazide derivatives apparent permeability values (Papp) obtained indicate these are high permeable compounds. The models obtained by CPCA and PLS were able to separate the molecules into groups of low, medium and high permeabilities, and the nifuroxazide analogues were classified as high permeable substances. The identified properties for the permeability through Caco-2 cells to the studied compounds were topologic and sterical, and it is possible to perform qualitative and quantitative external predictions with these models for the permeability through Caco-2 cells.