Master of Science / Division of Biology / Rollie J. Clem / Caspases are a conserved family of cysteine proteases that play important roles in apoptosis and innate immunity as well as other cellular processes. Eleven caspase genes have been annotated in the mosquito Aedes aegypti. Amongst these, previous studies have demonstrated functional roles for AeDronc, CASPS7 and CASPS8 in the Ae. aegypti apoptosis pathway, while CASPS18 and CASPS19 have also been functionally characterized. A previous study from our research group showed that AeIAP1 has preferential binding for CASPS7 compared to CASPS8. In this study, it was confirmed that AeIAP1 has a higher capacity to inhibit CASPS7 than CASPS8. Furthermore, five of the remaining Ae. aegypti caspases, namely CASPS15, CASPS16, CASPS17, CASPS20 and CASPS21, were characterized. An attempt was made to classify these caspases as initiator or effector caspases, based on factors such as the length of their prodomain, sequence similarity to known Drosophila initiator and effector caspases, and their substrate specificity. The functions of these caspases in apoptosis was examined in the Ae. aegypti cell line Aag2, by using RNA interference to reduce their expression and test the effect on apoptosis. Recombinant CASPS16, 17, 20 and 21 were produced in bacteria and the abilities of these recombinant proteins to cleave different caspase substrates were examined. From the resulting data, it was concluded that CASPS17 and CASPS21 are likely to be effector caspases since they preferred a effector caspase substrate. When considering the prodomain length, CASPS17 has a short prodomain, but CASPS21 has a long prodomain, which is normally associated with initiator caspases. CASPS20 did not show preference for any specific substrate and has a short prodomain. Since it did not have a specific preference of substrate, it is likely to be an effector caspase based on prodomain length. CASPS16 showed a slightly higher preference for the initiator caspase substrate WEHD, and has a long prodomain. Based on these results, CASPS16 is likely an initiator caspase. To examine the potential roles of CASPS15, 16, 17, 20 and 21 in apoptosis, their expression in Aag2 cells was knocked down using RNA interference. Successful knockdown was verified by qRT-PCR. After silencing specific caspases, the cells were exposed to two different apoptotic stimuli, ultraviolet radiation (UV) or the RNA synthesis inhibitor actinomycin D (ActD). Following apoptotic treatment, apoptosis was measured by two methods; caspase activity was measured using an effector caspase substrate, and phosphatidyl serine exposure on the outer leaflet of the plasma membrane, which occurs in apoptotic cells, was measured by Annexin V staining and flow cytometry. In cells where CASPS15, 16, 17, 20 or 21 had been knocked down and the cells were then treated with UV or ActD, it was observed that effector caspase activity and Annexin V staining were both significantly lower than in UV- or ActD-treated cells that had received control double-stranded RNA. Together these results suggest that all of these caspases are involved in apoptosis in Aag2 cells. This study serves as a starting point for further research on Ae. aegypti caspases and their roles in specific cellular processes.

Orientador: Fabíola Freitas de Paula Lopes / Resumo: A função do espermatozoide pode ser comprometida por condições ambientais adversas. Estudos já demonstraram que a exposição in vivo e in vitro de espermatozoides bovinos a temperatura elevada induz a morte celular, reduz a motilidade espermática e o potencial fertilizante do espermatozoide. No entanto, as alterações celulares induzidas pelo choque térmico em espermatozoides bovinos ainda são controversas. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar o efeito do choque térmico em espermatozoides de touros holandeses na motilidade espermática, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), atividade mitocondrial, atividade de caspase, potencial de fertilização, cinética e desenvolvimento embrionário pré-implantacional. As amostras de sêmen foram descongeladas e submetidas ao gradiente de Percoll. Na amostra controle (sem incubação) os espermatozoides foram avaliados imediatamente após o gradiente de Percoll. Posteriormente, as amostras foram incubadas à 35 °C (Controle da temperatura testicular), 38,5 °C (temperatura corporal) e 41 °C (choque térmico) por 4 horas. O choque térmico de 41 °C reduziu a motilidade espermática após 2 h de incubação em comparação com 35 e 38,5 °C. A exposição de espermatozoides a diferentes temperaturas aumentou a produção de EROs, sendo este efeito mais acentuado no grupo 41°C em relação aos demais tratamentos. O aumento das EROs em espermatozoides submetidos ao choque térmico foi seguido da redução na atividade mitocondrial espermática e au... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

No description available.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O trabalho mostra o tratamento e os efeitos do l-deprenil (DEP), no aprendizado, na memÃria e na peroxidaÃÃo lipÃdica em cÃrebros de ratos submetidos à isquemia cerebral transitÃria (ICT). Os animais (ratos Wistar, fÃmeas, 200-250g) foram submetidos à isquemia cerebral transitÃria pela oclusÃo de ambas as artÃrias carÃtidas durante 20 minutos e tratados durante 5 dias com DEP (5 e 10 mg/kg). A temperatura retal foi monitorada e mantida em torno de 37ÂC atravÃs de uma luz incandescente. O mesmo procedimento foi feito no grupo controle + salina, Falso-operado + salina (FO) com exceÃÃo do clampeamento das artÃrias carÃtidas. No 6 dia apÃs a induÃÃo da isquemia, os animais foram submetidos aos testes de atividade locomotora e memÃria (esquiva passiva, labirinto em T elevado e labirinto aquÃtico de Morris), a seguir foram sacrificados e os cÃrebros dissecados sobre gelo (hipocampo e cÃrtex temporal) para as determinaÃÃes de MDA, nitrito/nitrato e atividade da catalase e atividade da protease caspase-3. No protocolo de avaliaÃÃo da Ãrea total do infarto encontramos apÃs 1 hora de ICT uma Ãrea de infarto 38,01  3,44% da Ãrea total do cÃrebro, e apÃs 24 horas de ICT uma Ãrea de infarto 22,00  2,90% da Ãrea total do cÃrebro. Os parÃmetros fisiolÃgicos estudados nÃo mostraram alteraÃÃes entre os grupos ICT e FO. Nenhuma alteraÃÃo na atividade locomotora foi detectada nos grupos FO, ICT, Dep 10 + ICT. PorÃm, um aumento na atividade locomotora foi observado no grupo Dep 5 + ICT (7,37  1, 77, p< 0,02) quando comparado com o grupo FO, tratado com salina, (4,66  1,54). No teste do Labirinto em T elevado (T Maze) a ICT afetou os processos de aquisiÃÃo e retenÃÃo de memÃria quando os animais foram testados no mesmo dia (esquiva 1 e 2) quando comparados com o grupo controle (FO). O teste de Kruskall-Wallis mostrou alteraÃÃo significativa na latÃncia da esquiva inibitÃria (esquiva 1 e 2 quando comparados com o treino) no falso-operado (FO - treino: 20,34  3,43 s; esquiva 1 - 231,6  34,81 s; esquiva 2 â 247,8  27,25 s; KW = 19,62, p< 0,001), e no grupo l-deprenil (5 e 10 mg/kg) + isquemia (Dep 5 â treino: 110,8  56,16 s; esquiva 1 - 299,8  0,16 s; esquiva 2 â 260  40,00 s; KW = 9,16, p< 0,01. Dep 10 â treino: 29,15  8,64 s; esquiva 1 â 299,80  0,25 s; esquiva 2 299,8  0,25 s; KW = 6,98, p< 0,05). Isto indica uma boa aquisiÃÃo de memÃria. Portanto, o resultado do grupo ICT + salina indicou um dÃficit da memÃria (ICT â treino: 37,75  11,52 s; esquiva 1 â 116,30  65,46 s; treino 2 â 195,00  64,10 s; KW = 3,90, p< 0,141). AlÃm disso, existiu uma diferenÃa significativa (Teste Mann-Whitney) entre os grupos na esquiva 3 (retenÃÃo) quando comparados com o grupo ICT (Dep 5, MW (3) = 18,483, p< 0,0003, Dep 10, MW (3) = 18,483, p< 0,003) significando que a retenÃÃo da memÃria foi aumentada pelo tratamento com a droga. No teste da esquiva passiva os animais do grupo controle (FO + salina) apresentaram uma boa retenÃÃo da memÃria, tanto na fase imediata (memÃria recente - MR), quanto na fase de consolidaÃÃo (memÃria tardia - MT), quando comparadas ao treino (ANOVA) (FO + salina (n-7)- treino - 15,94  4,40 s, MR - 138,84  34,60 s, MT - 196,32  34, 71, p< 0,006). Por outro lado, os animais que sofreram ICT nÃo apresentaram diferenÃa no tempo de latÃncia de entrada no lado escuro quando comparado com o treino, significando um dÃficit na aprendizagem e memÃria (ICT (n-7)- treino - 34,37  10,16 s, MR - 105,54  35,21 s, MT - 96,20  33, 44, p< 0,33), e, portanto dano na aquisiÃÃo e retenÃÃo da memÃria. Comparando os tratamentos observamos um aumento significativo, no tempo de latÃncia de entrada no lado escuro do aparelho, nos ratos tratados com l-deprenil 5 mg/kg quando avaliados na MR (FO + salina- 138,84  34,60s; ICT - 105,54  35,21; ICT + Dep 5- 198,88  38,42s; ICT + Dep 10- 188,06  34,60s; Kruskall-Wallis, KW-9,66, p<0,05, Mann-Whitney, Dep 5 vs ICT, p<0,05), enquanto na MT foi observada uma diminuiÃÃo significativa, no tempo de latÃncia de entrada no lado escuro do aparelho, nos ratos tratados com l-deprenil (5 e 10 mg/kg) (FO + salina- 196,32  34,71s; ICT - 96,20  33,44s; ICT + Dep 5- 299,83  0,16s; ICT + Dep 10- 264,70  35,28 s; Kruskall-Wallis, KW-14,57, p<0,05, Mann-Whitney, Dep 5 e Dep 10 vs ICT, p<0,05), significando melhora no aprendizado do animal fazendo-o lembrar o choque recebido durante o treino e indicando uma reversÃo da lesÃo sofrida com a ICT. No teste do Labirinto AquÃtico (Water Maze) a ICT promoveu um dano da retenÃÃo na memÃria dos animais em relaÃÃo ao grupo controle (FO), porÃm o l-deprenil conseguiu reverter o dano na aquisiÃÃo da memÃria induzida pela ICT em ambas as doses (5 e 10 mg/kg), observamos tambÃm que o grupo Dep 5 obteve um melhor desempenho na aquisiÃÃo da memÃria quando comparado com o grupo Dep 10. (FO (n-10): 5,4  0,84s; FO + DEP 10 (n-10): 9,7  2,28s; ICT (n-9): 32,44  2,95s; ICT + DEP 5 (n-8): 12,88  1,4s; ICT + DEP 10 (n-8): 4,5  0,70s; Kruskall-Wallis, KW-29,07, p<0,05, Mann-Whitney, FO + DEP 10, Dep 5 e Dep 10 vs ICT, p<0,05). Os ratos submetidos a ICT mostraram um aumento de 71% nos nÃveis de MDA no hipocampo quando comparados com o grupo controle (FO), e o tratamento com l-deprenil reverteu significativamente este efeito (p<0,05). Os valores dos nÃveis de MDA foram trazidos prÃximos aqueles valores do grupo controle (FO) em relaÃÃo aos grupos (ICT + DEP 5 e ICT + DEP 10, 34 e 38%, respectivamente) com ambas as doses de l-deprenil mais ICT (Hipocampo - FO (n-7): 45,4  4,45; ICT (n-7): 77,6  8,97; ICT + DEP 5 (n-7): 51,2  1,68; ICT + DEP 10 (n-7): 48,5  6,70 nmoles/g; p<0,05, ANOVA e Teste de Tukey). No cÃrtex temporal, a ICT nÃo aumentou os nÃveis de MDA quando comparados com o grupo controle. Portanto, os ratos submetidos a ICT e tratados com altas doses de l-deprenil (10 mg/kg) apresentaram nÃveis de MDA 30% menor que aqueles mostrados por ambos os grupos FO e ICT (CÃrtex temporal - FO (n-7): 46,8  4,36; ICT (n-7): 48,7  1,33; ICT + DEP 5 (n-7): 52,5  3,74; ICT + DEP 10 (n-7): 33,4  2,98 nmoles/g; p<0,05, ANOVA e Teste de Tukey). No hipocampo, os nÃveis de nitrito foram significativamente aumentados apÃs a ICT quando comparados com o grupo controle FO (82% aumento). O DEP 10 reverteu este efeito e os valores foram trazidos para aqueles do controle. Por outro lado, a isquemia nÃo afetou os nÃveis de nitrito no cÃrtex, entretanto o DEP 5 diminui significativamente os nÃveis de nitrito quando comparados com os grupos controle e ICT. A ICT mostrou um aumento em 50 % da atividade da protease caspase-3 no hipocampo; e o tratamento com l-deprenil (10 mg/kg) reverteu este efeito trazendo os valores prÃximos aos do grupo controle (FO), porÃm o tratamento com DEP 5 nÃo mostrou o mesmo (Valor da AbsorbÃncia: FO â 0,083  0,006; ICT - 0,124  0,017; ICT + DEP 10 â 0,080  0,007; ICT + DEP 5 â 0,125  0,007), porÃm nos animais controle que receberam tratamento com DEP 10 (FO + DEP 10) a atividade da caspase â 3 diminui em 99% em relaÃÃo ao grupo ICT. Em conclusÃo mostramos que a administraÃÃo do l-deprenil diariamente por 5 dias melhorou os danos da memÃria observados apÃs a isquemia cerebral transitÃria em ratos. A droga protegeu o cÃrebro contra a hiperperoxidaÃÃo e formaÃÃo de radicais livres observados apÃs o dano isquÃmico, como diminui a atividade da caspase â 3. Pelo menos parte desses efeitos à devido ao efeito antioxidante e conseqÃentemente inibiÃÃo da ativaÃÃo da produÃÃo de radicais livres pelo l-deprenil. / The present work shows the effects of l-deprenyl (DEP, 5 and 10 mg/kg, po) on memory, as well as on rat brain free radical formation after transient cerebral ischemia (TCI). Wistar rats were anesthetized and submitted to TCI by occlusion of both carotid arteries for 20 minutes. In another experiment, animals were submitted to surgery without ischemia (sham-operated). After surgery, ischaemic rats were treated with DEP (DEP, 5 and 10 mg/kg, po) once and daily for 5 days. One group of animals was left untreated (controls). The parameters studied were, memory acquisition and memory retention, locomotor activity and tiobarbituric acid reactive substances, as an index of lipid peroxidation. After treatment all, animals were submitted to passive avoidance test, water maze test and elevated T maze test, and 24 h later sacrificed and their hippocampi and temporal cortex dissected for evaluation of lipid peroxidation and used for catalase activity determinations. The protein concentration was measured according to the method described by Lowry (1951). In another set of experiments the animals were sacrificied forty eight hours after ischemia for caspase activity evaluation. Results show that DEP significantly reversed ischaemia-induced memory deficits. l-Deprenyl treatment significantly improved memory deficits as compared to ischemic group as measured by The elevated T maze and Water maze tests. A similar result was observed on the passive avoidance test where l-deprenyl improved late but not early memory as compared to the ischemic group. Except for an increased locomotor activity observed in the group treated with 5 mg/kg, no other alteration was detected in this behavioral test. Rats submitted to transient cerebral ischemia (and without l-deprenyl) showed an increase im MDA levels in the hippocampus and the treatment with l-deprenyl (5 and 10 mg/kg) significantly reversed this effect bringing values close to those of the sham-operated controls. A similar profile was observed with nitrite levels. Rats submitted to transient cerebral ischemia show an increase in caspase activity in the hippocampus and the treatment with l-deprenil (10 mg/kg) significantly reversed this effect bringing values close to those of the sham-operated controls. Moreover catalase activity in the hippocampi was not altered by ischemia. In conclusion, the work showed a signifant protective effect of l-deprenyl on memory deficits and lipid hyperperoxidation observed after cerebral ischemia. Possibly, the drug is acting at least in part through its antioxidant and antiapoptotic activities.