Cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) peptide-immunoreactivity was detected in neurons of the rostral ventrolateral medulla (RVLM), but few in the caudal ventrolateral medulla (CVLM). Double-labeling the medullary sections with sheep polyclonal phenylethanolamine N-methyltransferase-antiserum (PNMT) or monoclonal tyrosine hydroxylase-antibody and rabbit polyclonal CART peptide-antiserum revealed that nearly all adrenergic cells in the C1 area were CART peptide-positive and vice versa; tyrosine hydroxylase-positive cells in the A1 area were not. In the thoracolumbar spinal cord, neurons in the intermediolateral cell column (IML) and other sympathetic autonomic nuclei were CART peptide-positive; some of these were contacted by immunoreactive fibers arising from the lateral funiculus. By immuno-electron microscopy, axon terminals containing closely packed agranular CART peptide-immunoreactive vesicles appeared to make synaptic contacts with immunoreactive dendrites and soma in the IML, albeit the incidence of such contacts was low. Microinjection of the retrograde tracer Fluorogold into the lateral horn area of the T1-T3 spinal segments labeled a population of neurons in the C1 area, many of which were also CART peptide-positive. The results indicate that CART peptide-immunoreactivity is expressed in C1 adrenergic neurons, some of which project to the thoracolumbar spinal cord. The presence of this novel peptide in C1 adrenergic neurons underscores the multiplicity of putative transmitters that may be involved in signaling between putative cardiovascular neurons in the medulla oblongata and sympathetic preganglionic neurons (SPNs) in the spinal cord.

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However, the role of the above structures in cardiovascular recovery and autonomic changes induced by HS solution administration in animals submitted to HH has not yet been evaluated. Thus, the present study evaluated the A1, A2 neuronal clusters and MnPO nucleus involvement in the cardiovascular and autonomic responses promoted by HS solution infusion in hypovolemic animals. For this, wistar rats (280-320 g) were separated into four protocols: I. A2 neuronal cluster lesion (A2 Sham: n = 6; A2 Experimental: n = 6); II. A1 neuronal cluster lesion (A1 Sham: n = 6; A1 Experimental: n = 6); III. A1 and A2 neural clusters concomitant lesions (A1 + A2 Sham: n = 6; A1 + A2 Experimental: n = 6) and IV. Pharmacological inhibition of MnPO (MnPO Sham: n = 6; MnPO Experimental: n = 6). The animals of the first three protocols were anesthetized and subjected to saporin-anti-DβH nanoinjections for neuronal lesion (100 nL, 0.105 ng/nl) in experimental groups and Saporin nanoinjections (100 nL, 0.022 ng/nL) in sham groups for fictitious neuronal lesion, respectively, in the NTS, CVLM or simultaneously in the NTS and CVLM regions. After 20 days of recovery, the animals were anesthetized and instrumented to mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and renal sympathetic nervous activity (RSNA) recordings. Then, HH was performed by blood withdrawal until MAP reached approximately 60 mmHg. After 20 min of HH, sodium overload (3M NaCl, 1.8 mL/g, 90 seconds of infusion, i.v) was conducted. In another series of experiments, MnPO Sham and MnPO Experimental groups were anesthetized and instrumented for MAP, HR and RSNA recordings. Then, the animals were submitted to HH and HS infusion at the end of the hemorrhage. GABAergic agonist Muscimol (4 mM, 100 nL, MnPO Experimental group) or saline nanoinjections (0.15 M, 100 nL, MnPO Sham group) were performed in the MnPO after 10 min from the start of HH. HH-induced hypotension, bradycardia and renal sympathoinhibition in the animals of the A2 Sham, A1 Sham, A1 + A2 Sham and MnPO Sham groups. In the sham groups, HS infusion after HH reestablished MAP, HR, and did not alter the renal sympathoinhibition generated during hypovolemia. In the A2 Experimental and A1 Experimental groups, the specific lesion of A1 or A2 neurons did not alter the hypotension, bradycardia and renal sympathoinhibition caused during HH. In addition, the A1 or A2 neurons specific lesion did not alter the reestablishment of MAP, HR and the RSNA reduction after HS solution infusion. However, in the animals of the A1 + A2 experimental group, the simultaneous A1 and A2 neurons lesion did not alter the decrease in MAP and HR observed during HH, but abolished renal sympathoinhibition. In addition, simultaneous A1 and A2 neurons lesion abolished MAP restoration and ANSR reduction after HS infusion, while HR restoration was not modified. In the MnPO experimental animals, MnPO nucleus inhibition did not alter the decrease in MAP and HR observed during HH, but abolished renal sympathoinhibition. However, MnPO inhibition abolished the MAP restoration and promoted strong sympathetic activation in the renal bed after HS infusion, while HR restoration was not modified. These results suggest that the A1, A2 neuronal clusters and MnPO nucleus are part of the integration and transmission information circuits about changes in plasma osmolarity, participating in cardiovascular and autonomic recovery induced by sodium chloride overload in animals submitted to HH. / Os benefícios hemodinâmicos e cardiovasculares provenientes do uso de solução salina hipertônica (SH) no tratamento da hemorragia hipotensiva (HH) são relatados há vários anos. Recentes investigações mostraram a participação de regiões do sistema nervoso central (SNC), como os grupamentos neuronais A1 (localizado na região caudoventrolateral do bulbo; CVLM), A2 (localizado no núcleo do tracto solitário; NTS) e do núcleo Pré-óptico mediano (MnPO) nas respostas hemodinâmicas induzidas pela sobrecarga de cloreto de sódio em animais normovolêmicos. Entretanto, o papel das estruturas acima relacionadas na recuperação cardiovascular e nas alterações autonômicas induzidas pela administração de solução SH em animais submetidos à HH ainda não foi avaliado. Assim, o presente estudo buscou avaliar o envolvimento dos grupamentos neuronais A1, A2 e do núcleo MnPO nas respostas cardiovasculares e autonômicas promovidas pela infusão de solução SH em animais hipovolêmicos. Para isto, ratos Wistar (280-320 g) foram separados em quatro protocolos: I. Lesão do grupamento neuronal A2 (Controle A2: n=6; Experimental A2: n=6); II. Lesão do grupamento neuronal A1 (Controle A1: n=6; Experimental A1: n=6); III. Lesões concomitantes dos grupamentos neuronais A1 e A2 (Controle A1 + A2: n=6; Experimental A1 + A2: n=6) e IV. Inibição farmacológica do núcleo MnPO (Controle MnPO: n=6; Experimental MnPO: n=6). Os animais dos três primeiros protocolos foram anestesiados e submetidos a nanoinjeções de saporina-anti-DβH para lesão neuronal (100 nL, 0,105 ng/nL) nos grupos experimentais e Saporina (100 nL, 0,022 ng/nL) nos grupos controles para lesão neuronal fictícia, respectivamente, no NTS, na região CVLM ou conjuntamente no NTS e CVLM. Após 20 dias de recuperação, os animais foram novamente anestesiados e instrumentalizados para registro da pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e atividade nervosa simpática renal (ANSR). Em seguida, a HH foi realizada através da retirada de sangue até que a PAM atingisse aproximadamente 60 mmHg. Após 20 min de HH foi conduzida a sobrecarga de sódio (NaCl 3M, 1,8 mL/kg, 90 segundos de infusão, i.v). Em outra série de experimentos, os animais dos grupos controle MnPO e Experimental MnPO foram anestesiados e instrumentalizados para registro da PAM, FC, ANSR. Em seguida, foram submetidos à HH e a infusão de solução SH ao final da hemorragia. Nanoinjeções do agonista GABAérgico, muscimol (4 mM, 100 nL, grupo experimental MnPO) ou salina (0,15 M; 100 nL; grupo controle MnPO) foram realizadas no MnPO após 10 min do início da HH. A HH promoveu hipotensão, bradicardia e simpatoinibição no território renal nos animais dos grupos controle A2, controle A1, controle A1 + A2 e controle MnPO. Nos grupos controle, a infusão de solução SH após a HH reestabeleceu a PAM, FC e não alterou a simpatoinibição renal gerada durante a hipovolemia. Nos animais dos grupos experimental A2 e experimental A1, a lesão especifica dos neurônios A1 ou A2 não alterou a hipotensão, bradicardia e simpatoinibição provocados durante a HH. Em adição, a lesão especifica dos neurônios A1 ou A2 não alterou o reestabelecimento da PAM, FC e a queda da ANSR gerada após a infusão de solução SH. Entretanto, nos animais do grupo experimental A1 + A2, a lesão simultânea dos neurônios A1 e A2 não alterou a queda da PAM, da FC observada durante a HH, mas aboliu a simpatoinibição renal. Ademais, a lesão simultânea dos neurônios A1 e A2 aboliu a restauração da PAM e a redução da ANSR após a infusão de solução SH, enquanto a restauração da FC não foi modificada. Nos animais do grupo experimental MnPO, a inibição do MnPO não alterou a queda da PAM e da FC observadas durante a HH, entretanto aboliu a simpatoinibição renal. Porém, a inibição do núcleo MnPO aboliu a restauração da PAM e promoveu forte simpatoexcitação no leito renal após a infusão de solução SH, enquanto a restauração da FC não foi modificada. Esses resultados sugerem que os neurônios dos grupamentos A1, A2 e o núcleo MnPO fazem parte dos circuitos de integração e transmissão de informações a respeito de mudanças na osmolaridade plasmática, participando da recuperação cardiovascular e autonômica induzida pela sobrecarga de cloreto de sódio em animais submetidos à HH.