O presente estudo utilizou o modelo fatia-dental/matriz-polimérica para avaliar a influência do tratamento dentinário e das BMPs dentinárias na diferenciação das células-tronco da polpa de dentes decíduos (SHED). Secções transversais (1mm) foram preparadas a partir de terceiros molares humanos extraídos. Matrizes poliméricas a base de ácido poli-L-lático (PLLA) foram criadas no interior da cavidade pulpar das secções dentinárias, tratadas com solução de EDTA a 10%; NaOCl a 5.25%; ou permanecendo sem tratamento. Matrizes poliméricas confeccionadas sem as fatias dentais foram utilizadas como controle. As células (5x104) foram semeadas nas matrizes e, após 7, 14, 21 e 28 dias de cultura in vitro, a expressão de marcadores de diferenciação odontoblástica (DSPP, DMP1 e MEPE) e a proliferação celular (WST-1) foram avaliadas. Células (5x105) semeadas nas matrizes foram transplantadas em camundongos imunodeficientes e cultivadas in vivo por um período de 14 e 28 dias. Para avaliar a atividade das BMPs dentinárias, 5x104 células foram semeadas em matrizes poliméricas com fatia dental e cultivadas na presença de anticorpos anti-BMP- 2, -4, ou -7 (2 μg/ml) durante 14 dias. Adicionalmente, 5x105 células foram tratadas com rhBMP-2, -4, ou -7 (100ng/mL) por 24hs. As células cultivadas in vitro e in vivo alteraram sua expressão genética durante o curso do tempo. DSPP, DMP-1 e MEPE foram expressos por células cultivadas in vitro após 14 dias (tratamento com EDTA e dentina sem tratamento) e in vivo após 28 dias (EDTA), não sendo detectados nos grupos NaOCl e nas células cultivadas nas matrizes sem fatia dental. A proliferação foi reduzida com a diferenciação celular (p<0.05). A utilização de BMP-2/4Ab no meio de cultura exerceu um efeito inibitório na expressão dos marcadores de diferenciação celular, não ocorrendo quando do cultivo das SHED na presença de BMP-7Ab. DSPP, DMP-1 e MEPE foram expressos por células tratadas com rhBMP-2, e DSPP e DMP-1 por células tratadas com rhBMP-4 e -7. Células sem tratamento não expressaram os marcadores. O modelo fatia-dental/matriz-polimérica demonstrou ser adequado para o estudo da diferenciação de células-tronco pulpares, sugerindo que a dentina possa fornecer um microambiente favorável para a diferenciação de celular. As proteínas ósseas morfogenéticas dentinárias BMP-2 e BMP-4 parecem exercer um papel relevante nesse processo. / The effect of dentin pre-treatments and dentin-derived BMPs on SHED differentiation was tested using the Tooth-Slice Scaffold model (TSS). Dentin slices (1mm thickness) were prepared from extracted human third molars. Biodegradable PLLA scaffolds were prepared inside the pulp chamber of the tooth-slices, treated alternatively with a 5.25% NaOCl or 10% EDTA solution, or remaining untreated (WO-T). PLLA sponge scaffolds with no tooth-slice (PSS) were used as control. SHED (5x104) were seeded in TSS and PSS and after 7, 14, 21 and 28 days in culture, RT-PCR (DSPP, DMP1 and MEPE) and WST-1 proliferation assay were performed. Additionally, cells (5x105) were seeded in TSS and PSS and transplanted into SCID mice (14 and 28 days). To verify the dentinderived BMPs bioactivity, SHED (5x104) were cultured in TSS in the presence of antihuman BMP-2, -4, and -7 antibodies for 14 days. Besides, cells in culture were treated with rhBMP-2; -4; or -7 for 24 hours. After in vitro and in vivo time course, SHED altered their genetic expression. The cells cultured in vitro in the TSS (EDTA or WO-T) expressed the differentiation markers after 14 days and maintained expression thereafter. Cell proliferation rate was reduced following the differentiation (p<0.05). Cells transplanted in vivo expressed DSPP, DMP-1 and MEPE after 28 days (EDTA). No transcripts were found in tooth-slices treated with NaOCl or in PSS groups. BMP-2/4Ab prevented the differentiation process and no inhibitory effect was detected for BMP-7Ab. After 24 hours, expression of DSPP, DMP-1 and MEPE was found for rhBMP-2, and DSPP and DMP-1 for rhBMP-4 and rhBMP-7 treated SHED, but not for untreated cells. The tooth slice scaffold model suggests that dentin can provide the environment for SHED differentiation and dentin-derived morphogenic signals BMP-2 and BMP-4 play an important role in this process.

O presente estudo utilizou o modelo fatia-dental/matriz-polimérica para avaliar a influência do tratamento dentinário e das BMPs dentinárias na diferenciação das células-tronco da polpa de dentes decíduos (SHED). Secções transversais (1mm) foram preparadas a partir de terceiros molares humanos extraídos. Matrizes poliméricas a base de ácido poli-L-lático (PLLA) foram criadas no interior da cavidade pulpar das secções dentinárias, tratadas com solução de EDTA a 10%; NaOCl a 5.25%; ou permanecendo sem tratamento. Matrizes poliméricas confeccionadas sem as fatias dentais foram utilizadas como controle. As células (5x104) foram semeadas nas matrizes e, após 7, 14, 21 e 28 dias de cultura in vitro, a expressão de marcadores de diferenciação odontoblástica (DSPP, DMP1 e MEPE) e a proliferação celular (WST-1) foram avaliadas. Células (5x105) semeadas nas matrizes foram transplantadas em camundongos imunodeficientes e cultivadas in vivo por um período de 14 e 28 dias. Para avaliar a atividade das BMPs dentinárias, 5x104 células foram semeadas em matrizes poliméricas com fatia dental e cultivadas na presença de anticorpos anti-BMP- 2, -4, ou -7 (2 μg/ml) durante 14 dias. Adicionalmente, 5x105 células foram tratadas com rhBMP-2, -4, ou -7 (100ng/mL) por 24hs. As células cultivadas in vitro e in vivo alteraram sua expressão genética durante o curso do tempo. DSPP, DMP-1 e MEPE foram expressos por células cultivadas in vitro após 14 dias (tratamento com EDTA e dentina sem tratamento) e in vivo após 28 dias (EDTA), não sendo detectados nos grupos NaOCl e nas células cultivadas nas matrizes sem fatia dental. A proliferação foi reduzida com a diferenciação celular (p<0.05). A utilização de BMP-2/4Ab no meio de cultura exerceu um efeito inibitório na expressão dos marcadores de diferenciação celular, não ocorrendo quando do cultivo das SHED na presença de BMP-7Ab. DSPP, DMP-1 e MEPE foram expressos por células tratadas com rhBMP-2, e DSPP e DMP-1 por células tratadas com rhBMP-4 e -7. Células sem tratamento não expressaram os marcadores. O modelo fatia-dental/matriz-polimérica demonstrou ser adequado para o estudo da diferenciação de células-tronco pulpares, sugerindo que a dentina possa fornecer um microambiente favorável para a diferenciação de celular. As proteínas ósseas morfogenéticas dentinárias BMP-2 e BMP-4 parecem exercer um papel relevante nesse processo. / The effect of dentin pre-treatments and dentin-derived BMPs on SHED differentiation was tested using the Tooth-Slice Scaffold model (TSS). Dentin slices (1mm thickness) were prepared from extracted human third molars. Biodegradable PLLA scaffolds were prepared inside the pulp chamber of the tooth-slices, treated alternatively with a 5.25% NaOCl or 10% EDTA solution, or remaining untreated (WO-T). PLLA sponge scaffolds with no tooth-slice (PSS) were used as control. SHED (5x104) were seeded in TSS and PSS and after 7, 14, 21 and 28 days in culture, RT-PCR (DSPP, DMP1 and MEPE) and WST-1 proliferation assay were performed. Additionally, cells (5x105) were seeded in TSS and PSS and transplanted into SCID mice (14 and 28 days). To verify the dentinderived BMPs bioactivity, SHED (5x104) were cultured in TSS in the presence of antihuman BMP-2, -4, and -7 antibodies for 14 days. Besides, cells in culture were treated with rhBMP-2; -4; or -7 for 24 hours. After in vitro and in vivo time course, SHED altered their genetic expression. The cells cultured in vitro in the TSS (EDTA or WO-T) expressed the differentiation markers after 14 days and maintained expression thereafter. Cell proliferation rate was reduced following the differentiation (p<0.05). Cells transplanted in vivo expressed DSPP, DMP-1 and MEPE after 28 days (EDTA). No transcripts were found in tooth-slices treated with NaOCl or in PSS groups. BMP-2/4Ab prevented the differentiation process and no inhibitory effect was detected for BMP-7Ab. After 24 hours, expression of DSPP, DMP-1 and MEPE was found for rhBMP-2, and DSPP and DMP-1 for rhBMP-4 and rhBMP-7 treated SHED, but not for untreated cells. The tooth slice scaffold model suggests that dentin can provide the environment for SHED differentiation and dentin-derived morphogenic signals BMP-2 and BMP-4 play an important role in this process.

O presente estudo utilizou o modelo fatia-dental/matriz-polimérica para avaliar a influência do tratamento dentinário e das BMPs dentinárias na diferenciação das células-tronco da polpa de dentes decíduos (SHED). Secções transversais (1mm) foram preparadas a partir de terceiros molares humanos extraídos. Matrizes poliméricas a base de ácido poli-L-lático (PLLA) foram criadas no interior da cavidade pulpar das secções dentinárias, tratadas com solução de EDTA a 10%; NaOCl a 5.25%; ou permanecendo sem tratamento. Matrizes poliméricas confeccionadas sem as fatias dentais foram utilizadas como controle. As células (5x104) foram semeadas nas matrizes e, após 7, 14, 21 e 28 dias de cultura in vitro, a expressão de marcadores de diferenciação odontoblástica (DSPP, DMP1 e MEPE) e a proliferação celular (WST-1) foram avaliadas. Células (5x105) semeadas nas matrizes foram transplantadas em camundongos imunodeficientes e cultivadas in vivo por um período de 14 e 28 dias. Para avaliar a atividade das BMPs dentinárias, 5x104 células foram semeadas em matrizes poliméricas com fatia dental e cultivadas na presença de anticorpos anti-BMP- 2, -4, ou -7 (2 μg/ml) durante 14 dias. Adicionalmente, 5x105 células foram tratadas com rhBMP-2, -4, ou -7 (100ng/mL) por 24hs. As células cultivadas in vitro e in vivo alteraram sua expressão genética durante o curso do tempo. DSPP, DMP-1 e MEPE foram expressos por células cultivadas in vitro após 14 dias (tratamento com EDTA e dentina sem tratamento) e in vivo após 28 dias (EDTA), não sendo detectados nos grupos NaOCl e nas células cultivadas nas matrizes sem fatia dental. A proliferação foi reduzida com a diferenciação celular (p<0.05). A utilização de BMP-2/4Ab no meio de cultura exerceu um efeito inibitório na expressão dos marcadores de diferenciação celular, não ocorrendo quando do cultivo das SHED na presença de BMP-7Ab. DSPP, DMP-1 e MEPE foram expressos por células tratadas com rhBMP-2, e DSPP e DMP-1 por células tratadas com rhBMP-4 e -7. Células sem tratamento não expressaram os marcadores. O modelo fatia-dental/matriz-polimérica demonstrou ser adequado para o estudo da diferenciação de células-tronco pulpares, sugerindo que a dentina possa fornecer um microambiente favorável para a diferenciação de celular. As proteínas ósseas morfogenéticas dentinárias BMP-2 e BMP-4 parecem exercer um papel relevante nesse processo. / The effect of dentin pre-treatments and dentin-derived BMPs on SHED differentiation was tested using the Tooth-Slice Scaffold model (TSS). Dentin slices (1mm thickness) were prepared from extracted human third molars. Biodegradable PLLA scaffolds were prepared inside the pulp chamber of the tooth-slices, treated alternatively with a 5.25% NaOCl or 10% EDTA solution, or remaining untreated (WO-T). PLLA sponge scaffolds with no tooth-slice (PSS) were used as control. SHED (5x104) were seeded in TSS and PSS and after 7, 14, 21 and 28 days in culture, RT-PCR (DSPP, DMP1 and MEPE) and WST-1 proliferation assay were performed. Additionally, cells (5x105) were seeded in TSS and PSS and transplanted into SCID mice (14 and 28 days). To verify the dentinderived BMPs bioactivity, SHED (5x104) were cultured in TSS in the presence of antihuman BMP-2, -4, and -7 antibodies for 14 days. Besides, cells in culture were treated with rhBMP-2; -4; or -7 for 24 hours. After in vitro and in vivo time course, SHED altered their genetic expression. The cells cultured in vitro in the TSS (EDTA or WO-T) expressed the differentiation markers after 14 days and maintained expression thereafter. Cell proliferation rate was reduced following the differentiation (p<0.05). Cells transplanted in vivo expressed DSPP, DMP-1 and MEPE after 28 days (EDTA). No transcripts were found in tooth-slices treated with NaOCl or in PSS groups. BMP-2/4Ab prevented the differentiation process and no inhibitory effect was detected for BMP-7Ab. After 24 hours, expression of DSPP, DMP-1 and MEPE was found for rhBMP-2, and DSPP and DMP-1 for rhBMP-4 and rhBMP-7 treated SHED, but not for untreated cells. The tooth slice scaffold model suggests that dentin can provide the environment for SHED differentiation and dentin-derived morphogenic signals BMP-2 and BMP-4 play an important role in this process.