El cerebelo es el órgano encargado de integrar las vías sensitivas y las motoras del sistema nervioso controlando, por ejemplo, los movimientos involuntarios del cuerpo. Su desarrollo comienza en la etapa embrionaria, en la que tiene lugar la formación del órgano y de sus principales capas. Conforme avanza el desarrollo, tiene lugar un crecimiento del órgano debido a una elevada proliferación de los precursores de las células granulares (PNGCs), localizados en su capa más externa. Su desarrollo finaliza en la etapa postnatal, en la que el cerebelo aumenta aun más su tamaño debido al mantenimiento de esta elevada actividad mitogénica. Alcanza su madurez cuando los PNGCs se diferencian y migran hacia la capa más interna. El morfógeno Sonic Hedgehog (Shh) es el responsable de la proliferación de los PNGCs. Esta proteína activa al complejo de receptores constituído por Patched (Ptch) y Smoothened (Smo), que desencadenaran una cascada de señalización dando lugar a la división celular. La actividad de Shh puede ser regulada negativamente por la proteína quinasa A dependiente de AMP cíclico (PKA). En su estado basal, la subunidad catalítica de PKA (PKA-C) se encuentra inhibida por su asociación con la subunidad reguladora (R-PKA). En la presente tesis se demuestra que en presencia de Shh la subunidad PKA-C inactiva se localiza en la base del cilio de PNGCs, estructura celular necesaria para que la señalización de Shh tenga lugar y donde se acumulan varias moléculas de la vía como Smo y Ptch. Cuando los PNGCs son deprivados de Shh tiene lugar una activación y una parcial dispersión de PKA-C de la base del cilio. Mostramos que la subunidad reguladora RII (PKA-RII) de PKA es la responsable del anclaje de la holoenzima a través de su unión a las proteínas de anclaje de PKA (AKAPs). La disrupción de la interacción entre PKA y AKAPs inhibe la actividad de Shh bloqueando la proliferación de los PNGCs. Estos resultados, por lo tanto, demuestran que el pool de PKA localizado en la base del cilio juega un papel esencial en la integración de la transducción de la señal de Shh. En la segunda parte de la presente tesis estudiamos la activación de proteínas G heterotriméricas mediante Smo. Aunque en su secuencia Smo sugiere que pertenece a la familia de los receptores acoplados a proteína G (GPCR), únicamente en Drosophila melanogaster se demostró que la proteína Gαi es necesaria para la actividad de Hedgehog (Hh), mientras que las evidencias de la implicación de las proteínas G como efectoras de la vía de Shh de los vertebrados no son muy claras. En este trabajo demostramos que la inducción de la proliferación de PNGCs se potencia por la expresión de formas activas de proteínas de la clase Gαi/o (Gαi1, Gαi2, Gαi3 y Gαo) pero no por las de la clase Gα12 de proteínas G. Además, observamos que los miembros de la familia de Gαi poseen un patrón de expresión específico en el cerebelo en desarrollo: únicamente Gαi2 y Gαi3 se encuentran altamente expresados en la parte más externa de la capa granular externa, donde tiene lugar la proliferación de los PNGCs. En concordancia con este resultado observamos que la proliferación de los PNGCs se reduce de manera significativa mediante la eliminación de Gαi2 y Gαi3 pero no cuando silenciamos a otros miembros de la familia de Gαi/o. Finalmente, los resultados de la presente tesis demuestran que las subunidades Gαi2 y Gαi3 se localizan en el cilio primario cuando son sobre-expresados en cultivos de PCGCs. Por lo tanto, los efectos proliferativos de Shh en estas células están mediados por la activación combinada de las proteínas Gαi2 y Gαi3 de proteínas G. / During cerebellum development, clonal expansion of cerebellar granular neuronal precursors (CGNPs) takes place in response to Sonic Hedgehog (Shh) signalling pathway. Shh transduces its signals through the Patched (Ptc) and Smoothened (Smo) receptor complex, delivering activated forms of Gli (Ci) transcription factors to the nucleus. PKA is a known negative regulator of the CGNPs mitogenic activity by inducing Gli2/3 phosphorylation and their subsequent degradation by the proteasome generating potent transcriptional repressors of the pathway. In mammals, Shh pathway requires and takes place at a specific cellular structure: the primary cilum, where many of the proteins of the pathway localize. In this thesis we demonstrated that PKA-C subunit accumulates at the base of the primary cilium through PKA-RII subunit that joins to an unknown AKAP. In the absence of Shh, PKA activates and spreads from the primary cilium base and phosphorylates its target proteins. PKA needs to be accumulated at this specific location, since the inhibition of PKA localization to the cilium base reduces CGNPs mitosis. In the second part of the present thesis we demonstrate that any active member of the Gai/o but not of the Ga12/13 family of heterotrimeric G proteins can induce CGNPs proliferation at low but non active doses of Shh. We also show that Gai2 and Gai3 are the only expressed proteins of this family in the external granular layer of the developing cerebellum (EGL), where proliferation takes place. These proteins are the specific members responsible for Shh activity as their ablation by RNAi has a synergic effect in reducing CGNPs mitogenic activity. Moreover, these subunits can exclusively accumulate at the cilium shaft. All together these results indicate that Gai2 and Gai3 are the two specific members that mediate Shh pathway in this cells.

DE LA TESI:L´apoptosi és un dels principals tipus de mort cel.lular programada i es caracteritza per ser un procés actiu encaminat a produir la mort cel.lular de manera controlada. Aquest procés juga un paper important en el correcte desenvolupament del sistema nerviós central, ja que permet l'eliminació de les cèl.lules innecessàries. En canvi, l´activació anòmala d´aquest mecanisme en el cervell adult contribueix de manera significativa en el desencadenament de moltes malalties neurodegeneratives, com són la malaltia d´Alzheimer o la de Parkinson entre d´altres. Així doncs, la determinació i comprensió de les diferents rutes senyalitzadores pro-apoptòtiques involucrades en aquestes malalties permetrà identificar noves dianes terapèutiques.L´objectiu d´aquesta tesi doctoral ha estat estudiar el paper anti-apoptòtic en neurones granulars de cerebel (CGNs) dels inhibidors de dos proteïnes cinases: la Glycogen Sinthase Kinase-3beta (GSK-3beta) i la c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK), i determinar per quines rutes senyalitzadores protegeixen a les neurones de la mort apoptòtica provocada per la deprivació de sèrum i potassi (DV S/K). El model escollit per realitzar aquests estudis ha estat la DV S/K en cultius primaris de CGNs, ja que permet reproduir in vitro la mort neuronal programada provocada per la deprivació de factors tròfics.En quant a la GSK-3beta s´ha demostrat que la seva inhibició protegeix de la mort induïda per la DV S/K i que aquesta protecció ve donada, com a mínim, per dos mecanismes no descrits prèviament. En primer lloc s´ha determinat que la GSK-3beta intervé en l'activació anòmala del cicle cel.lular, fet que en CGNs condueix a l'activació de l'apoptosi, i en segon lloc que la GSK-3beta intervé en l'alliberament desde els mitocondris de la proteína pro-apoptòtica AIF. En quant a la JNK també s'ha detectat que la seva inhibició protegeix d'aquest estímul apoptòtic i que una de les raons subjacents a aquest fet, és que la inhibició de la JNK manté activa la via de supervivència de l'AKT.La conclusió final d'aquesta tesi doctoral és que tant la GSK-3beta com la JNK tenen un paper clau en l'activació de l'apoptosi en neurones i que per aquest motiu podrien ser considerades potencials dianes farmacològiques per tractar malalties neurodegeneratives.