This thesis concerns the investigation of novel immunotherapies for cancer eradication. CpG therapy was used in order to target antigen-presenting cells (APCs), facilitating antigen presentation and activation of T cells. Blockade of the two major immune checkpoint regulators (CTLA-4 and PD-1) was also studied to ensure proper and sustained T cell activation. The therapies were investigated alone and compared to BCG, the standard immunotherapy in the clinic today for bladder cancer. In addition, CpG as well as BCG was combined with CTLA-4 or PD-1 blockade to examine if the combination could improve therapy. Single and combination strategies were assessed in an experimental bladder cancer model. In addition, one of the therapies (local aCTLA-4 administration) was evaluated in an experimental pancreatic cancer model. To be able to study the effects of CpG in humans, a human whole blood loop system has been used. This allowed us to dissect the potential interplay between CpG and complement. CpG was found to be superior to the conventional therapy, BCG, in our experimental model and T cells were required in order for effective therapy to occur. Used as a monotherapy, CTLA-4 blockade but not PD-1 blockade, prolonged survival of mice. When CTLA-4 or PD-1 blockade was combined with CpG, survival was enhanced and elevated levels of activated T cells were found in treated mice. In addition, Treg levels were decreased in the tumor area compared to tumors in control treated mice. CTLA-4 blockade was also effective when administrated locally, in proximity to the tumor. Compared to systemic CTLA-4 blockade, local administration gave less adverse events and sustained therapeutic success. When CpG was investigated in a human whole blood loop system it was found to tightly interact with complement proteins. This is an interesting finding which warrants further investigation into the role of TLRs in complement biology. Tumor therapy could be affected either negatively or positively by this interaction. The results presented herein are a foundation for incorporating these combination therapies into the clinic, specifically for bladder cancer but in a broader perspective, also for other solid tumors such as pancreatic cancer.

L'activation de TLR9 par injection directe de nucléotides CpG non méthylés dans une tumeur peut induire une réponse immunitaire thérapeutique, mais les lymphocytes T régulateurs (Tregs) inhibent ensuite la réponse immunitaire antitumorale et limitent ainsi le pouvoir des stratégies d'immunothérapies contre le cancer.Chez des souris porteuses de tumeurs, nous avons constaté que les Tregs dans la tumeur expriment préférentiellement les marqueurs cellulaires de surface CTLA-4 et OX40. Nous montrons que la co-injection intratumorale d'anti-CTLA-4 et anti-OX40 avec du CpG en intra-tumoral aboutit à l’élimination des Tregs infiltrant la tumeur. Cette immunomodulation in situ, réalisée avec de faibles doses d'anticorps dans une tumeur unique, génère une réponse immunitaire antitumorale systémique capable d’éradiquer la maladie disséminée chez la souris. De plus, cette modalité de traitement est efficace contre des lésions de lymphome du SNC avec métastases leptoméningées, des sites qui sont généralement considérés comme des sanctuaires de cellules tumorales pour les traitements systémiques conventionnels.Ces résultats démontrent que les effecteurs immunitaires anti-tumoraux activés par immunomodulation locale peuventt éradiquer des cellules tumorales siègeant dans des sites éloignés. Nous proposons que, plutôt que d'utiliser des anticorps monoclonaux pour cibler les cellules cancéreuses par voie systémique, des anticorps monoclonaux pourraient être utilisés pour cibler les cellules immunitaires infiltrant la tumeur localement, provoquant ainsi une réponse immunitaire systémique. / Activation of TLR9 by direct injection of unmethylated CpG nucleotides into a tumor can induce a therapeutic immune response; however, regulatory T-cells (Tregs) eventually inhibit the antitumor immune response and thereby limit the power of cancer immunotherapies. In tumor-bearing mice, we found that Tregs within the tumor preferentially express the cell surface markers CTLA-4 and OX40. We show that intratumoral coinjection of anti–CTLA-4 and anti-OX40 together with CpG depleted tumor-infiltrating Tregs. This in situ immunomodulation, which was performed with low doses of antibodies in a single tumor, generated a systemic antitumor immune response that eradicated disseminated disease in mice. Further, this treatment modality was effective against established CNS lymphoma with leptomeningeal metastases, sites that are usually considered to be tumor cell sanctuaries in the context of conventional systemic therapy. These results demonstrate that antitumor immune effectors elicited by local immunomodulation can eradicate tumor cells at distant sites. We propose that, rather than using mAbs to target cancer cells systemically, mAbs could be used to target the tumor infiltrative immune cells locally, thereby eliciting a systemic immune response.

PD-1 (Programmed Cell death protein -1) est un récepteur co-inhibiteur exprimé à la surface de lymphocytes T (LT) activés. Ce récepteur joue un rôle important dans le maintien de la tolérance périphérique tout en protégeant contre les maladies auto-immunes et inflammatoires. Cependant, une expression élevée et permanente de PD-1 et ses ligands PD-L1 et PD-L2 (PD-Ls) perturbe la réponse immunitaire contre les pathogènes et les cellules tumorales. Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ciblant l'axe PD-1/PD-Ls représentent aujourd’hui une avancé majeure dans le traitement de différents types de cancer, tant sur le plan de l’efficacité que de la tolérance. Le nivolumab (nivo) et le pembrolizumab (pembro) sont deux anticorps monoclonaux (AcM) anti-PD-1 qui bloquent l’interaction de PD-1 avec ses ligands. Ces AcM ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de multiples types de cancers comme le mélanome, le cancer bronchique non à petites cellules, le carcinome à cellules rénales, etc. Malgré l’importance thérapeutique de nivo et de pembro dans le cancer, aucune étude n’a défini le devenir de PD-1 après la liaison à ces deux AcM. L’objectif de cette étude a été donc d’évaluer l’endocytose de PD-1 suite au liaison à des AcM anti-PD-1 (clone J110, nivo, pembro) et de déterminer s’il y a différence entre nivo et pembro vis à vis leur capacités à induire l'internalisation de PD-1. L’étude de l’endocytose de PD-1 a été réalisé sur des LT humains obtenus à partir du sang périphérique de donneurs sains et activés avec des Ac anti-CD3/anti-CD28 ou concanavaline A afin d’exprimer le récepteur PD-1. L’analyse des données par cytométrie en flux a montré que l’engagement de PD-1 avec l’Ac anti-PD-1 (clone J110) induit son endocytose dans les LT humains et que 50% de la totalité de PD-1 de surface est internalisé dans les premiers 30 minutes suivant l’incubation de cellules à 37°C, suivi d’un taux d’endocytose plus lent (56% en 60min). Notre étude a montré également que la liaison de nivo et de pembro au PD-1 induit son endocytose et que la plupart de récepteur est internalisée dans les 30 min suivant l’incubation de cellules à 37°C. Toutefois, 32 à 50% des récepteurs sont résistants à l’endocytose. L’analyse comparative de nivo et de pembro a révélé une différence statistiquement significative (p=0.03) entre le taux d’internalisation du complexe PD-1/nivo et celui du PD-1/pembro (46% versus 25% en 30min, respectivement). Même à des concentrations élevées de pembro, la liaison de nivo induit une meilleure internalisation de PD-1, ce qui suggère que nivo pourrait être plus efficace. Bien que les ICI comme nivo et pembro sont connus de bloquer l’interaction de PD-1 avec ses ligands, PD-L1 et PD-L2, notre étude a montré pour la première fois que ce deux AcM induisent aussi l’endocytose du récepteur PD-1 dans les LT humains avec des taux différents, et que 32% à 50% de récepteurs PD-1 sont résistants à l’endocytose. Ces résultats pourraient être exploités pour améliorer l’internalisation de PD-1 dans les LT humains et par la suite augmenter les potentiels thérapeutiques de nivolumab et de pembrolizumab dans le traitement du cancer. Mots clés : Récepteur PD-1, Ligands de PD-1, Lymphocytes T, Inhibiteurs de point de contrôle immunitaires, Anticorps anti-PD-1, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytose, Cancer / PD-1 (Programmed Cell death protein -1) is a co-inhibitory receptor expressed on the surface of activated T cells. It plays an important role in maintaining peripheral tolerance and protecting against autoimmune and inflammatory diseases. However, permanent expression of PD-1 and its ligands PD-L1/ PD-L2 (PD-Ls) disrupts the immune response against pathogens and tumor cells. Immune checkpoint blockade (ICB) targeting the PD-1/PD-Ls axis has revolutionized the treatment of many cancers. Nivolumab (nivo) and pembrolizumab (pembro) are two anti-PD-1 monoclonal antibodies (mAb) that block the interaction between PD-1 and its ligands. They have shown promising results in the treatment of multiple types of cancers such as melanoma, non-small cell lung cancer, renal cell carcinoma, etc. Surprisingly, despite the success of anti-PD-1 in cancer immunotherapy, no-one has defined the destiny of surface PD-1 following antibody binding. Therefore, the objective of my master thesis was to define the fate of surface PD-1 following antibody binding and whether different anti-PD-1 Abs in the clinic differ in their ability to induce PD-1 endocytosis. The study of PD-1 endocytosis was performed on human T lymphocytes obtained from peripheral blood of healthy donors and activated with anti-CD3/anti-CD28 Ab or concanavalin A to express PD-1 receptor. Data analysis by flow cytometry showed that following anti-PD-1 Ab binding, 50% of PD-1 becomes endocytosed by 30min. In addition, we found that the PD-1 receptor is internalised upon its engagement with nivo and pembro and that most of the receptor is endocytosed within 30 min. However, 32 to 50% of the receptors are resistant to endocytosis. The comparative analysis of nivo and pembro has revealed a statistically significant difference (p=0.03) between the internalisation rate of the PD-1/nivo complex versus PD-1/pembro (46% versus 25% by 30min, respectively). Even at high concentrations of pembro, nivo induces better internalization of PD-1, suggesting that nivo could be more effective than pembro. Our study showed for the first time that ICB involves not only in the blockade of PD-1/PD-Ls interaction, but also in the endocytosis of PD-1 receptors from the surface of human T-cells, which differs between nivolumab and pembrolizumab. These results could be exploited to increase the therapeutic potential of nivolumab and pembrolizumab in cancer treatment. Keywords: PD-1 receptor, PD-1 ligands, T lymphocytes, Immune checkpoint blockade, Anti-PD1 antibodies, Nivolumab, Pembrolizumab, Endocytosis, Cancer