LORVR ou obstruction récurrente des voies respiratoires (ORVR) est la cause la plus fréquente de maladie pulmonaire chronique chez le cheval adulte. La maladie se caractérise par une hyperréactivité bronchique, une production excessive de mucus et une inflammation neutrophilique pulmonaire qui ont pour effet de réduire la compliance dynamique du poumon et daugmenter la résistance des voies respiratoires au débit aérien. Alors que la maladie est une entité documentée dans la littérature depuis plus de 200 ans, les mécanismes moléculaires qui la sous-tendent restent incomplètement élucidés à ce jour. De précédentes études ont montré l'implication de variations d'expression génique, pour la plupart grâce à l'utilisation combinée de la transcription inverse et de la réaction en chaîne par polymérase (RT-PCR). Cette technique bien connue ne permet l'étude que d'un nombre limité de gènes en simultané. Les microdamiers apparaissent comme la technique de choix pour l'étude de l'expression génique à large échelle. A lheure où cette étude a débuté, il nexistait pas de microdamier dexpression spécifiquement dédié au cheval sur le marché. Un microdamier hétérologue humain (Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip, Affymetrix®) a donc été utilisé pour tenter didentifier de nouveaux gènes dintérêt pour comprendre la pathogénie de lORVR chez le cheval. L'utilisation du microdamier a permis de détecter 46 gènes dont lexpression variait d'un facteur supérieur à 4 entre chevaux sains et atteints. Parmi les gènes mis en avant par le microdamier, trois gènes (CYBB, MARCKS et PTX3) présentaient un intérêt particulier au regard de la littérature et leur variation dexpression a été confirmée par RT-PCR quantitative (RT-qPCR). La pentraxine 3 (PTX3) notamment appartient à la composante humorale de la réponse immune innée. Elle agit comme un ancêtre fonctionnel des anticorps. En effet, elle reconnaît les microbes, active le complément et facilite la reconnaissance de certains pathogènes spécifiques, dont Aspergillus fumigatus (A. fumigatus), par les phagocytes. La suite du travail sest donc focalisée sur PTX3. LADN complémentaire (ADNc) codant pour PTX3 et lADN codant pour le second exon de PTX3 ont été clonés et séquencés. LADN codant pour le second exon de PTX3 équin présentait une délétion de 120 paires de bases par rapport à la séquence humaine. Par ailleurs, un épissage alternatif du second exon de PTX3 a été mis en évidence, résultant en deux formes de la protéine, "épissée" (32 kilodaltons) et "complète" (42 kilodaltons). Afin d'étudier les effets de lexposition à des poussières de foin sur l'expression de PTX3 dans les voies respiratoires, six chevaux sains et six chevaux atteints dORVR ont été soumis pendant dix jours à un challenge environnemental aux poussières de foin. Les chevaux ont été étudiés via des tests cliniques, fonctionnels et biochimiques. Les lavages broncho-alvéolaires (LBA) ont été récoltés lors de l'initiation du protocole et après les dix jours d'exposition aux poussières de foin. Par ailleurs, des sections bronchiques ont été réalisées chez deux chevaux atteints d'ORVR en crise et euthanasiés pour raisons éthiques et deux chevaux indemnes d'affections respiratoires provenant de l'abattoir. PTX3 était détectée dans les macrophages du LBA après exposition aux poussières de foin et dans les cellules épithéliales bronchiques. PTX3 était surexprimée dans les macrophages du LBA chez tous les chevaux après dix jours d'exposition aux poussières de foin. Cependant, le niveau de PTX3 était plus élevé dans le surnageant des cellules provenant des chevaux atteints d'ORVR que dans celui provenant des cellules des chevaux sains. Par ailleurs, il semble que PTX3 soit surexprimée dans les cellules épithéliales bronchiques chez le cheval atteint d'ORVR. Cette piste est intéressante sur le plan thérapeutique puisque l'activation de l'expression de PTX3 dans les cellules épithéliales bronchiques est sous le contrôle du facteur c-Jun N-terminal kinase (JNK), un facteur différent de celui qui contrôle l'expression de PTX3 dans les leucocytes, à savoir le facteur nucléaire kappa B (NF-κB). L'effet de différents stimuli sur la production et lexcrétion de PTX3 par les cellules du LBA a été étudié ex-vivo après mise en culture et stimulation à la poussière de foin, au lipopolysaccharide (LPS), à A. fumigatus et avec une solution saline tamponnée pour le phosphate (PBS), utilisée comme contrôle. La présence de PTX3 a été mesurée par Western Blot six heures et vingt-quatre heures après les différentes stimulations dans les cellules et dans les surnageants respectivement. PTX3 était détectée dans les cellules et dans les surnageants mais aucune différence significative d'expression na pu être mise en évidence que ce soit entre les différents stimuli, entre les différents temps ou avec le contrôle. Ces résultats suggèrent que la poussière de foin est un inducteur indirect de PTX3./ Recurrent airway obstruction (RAO) is the first respiratory disease in adult horses. Environmental causes of RAO are well described, but the molecular mechanisms of the disease remain unclear. Previous studies have highlighted the implications of variations in gene expression in the disease, most using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). This well-known technique limits the number of genes that can be studied in a single assay. The microarray appears to be the platform of choice for massively parallel gene expression profiling and provides a good tool for exploratory research. However, at the time of the experiment, there was no equine-specific microarray available on the market. Because they are commercially available, highly specific and well annotated, human and mouse large-scale microarrays are an exploratory alternative to equine-specific microarrays. The first part of the present study was performed to highlight new targets not previously related to the disease and able to improve our understanding of the molecular mechanisms of the disease. A human microarray (Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip, Affymetrix®) was used to study gene expression in nucleated cells originating from peripheral blood and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) in RAO-affected horses. A total of 46 candidates were identified with differentially regulated genes between RAO-affected horses and controls. Based on their documented function, five of these genes were selected for the real-time quantitative RT-PCR (RT-qPCR) validation procedure: CYBB, MARCKS and PTX3. The RT-qPCR results confirmed those obtained with the microarray, pointing out these genes as new directions for future experiments. In particular, the long pentraxin 3 (PTX3) plays an important role in the host defence and over-expression of PTX3 may contribute to airways injury. Therefore, it was hypothesised that PTX3 may have relevance in the understanding of the pathogenesis of RAO. In the second part of the study, PTX3 and its implication in RAO in horses were characterized in more details. Six healthy horses and six RAO-affected horses were submitted to a dusty environment challenge. PTX3 DNA and cDNA were cloned and sequenced. A 120bp deletion was found in the DNA of the second exon of equine PTX3 in comparison to human PTX3. In addition, an alternative splicing of the second exon of PTX3 occurred, resulting in two forms of the protein: "spliced" (32 kilodaltons) and "full length" (42 kilodaltons). The pentraxin domain was very well conserved in the two forms with 94% of amino-acids conserved between equines and humans. The effects of dust exposure and subsequent RAO crisis on PTX3 expression in the BALF and the bronchial epithelial cells were studied. Dust exposure induced PTX3 in vivo in BALF macrophages both in healthy horses and in RAO-affected horses. However, PTX3 was over-expressed in the BALF supernatant and, interestingly, in the bronchial epithelial cells from RAO-affected horses in crisis. Considering epithelial cells as one of the major cell types in the airways, PTX3 produced at this level may play an important role in the disease process. The effects of different components (ie lipopolysaccharide and A. fumigatus) and different concentrations of hay dust suspension upon PTX3 expression and excretion in BALF cells have been tested ex-vivo and compared to control (ie. Phosphate-Buffered Saline). PTX3 was detected in cells and cell culture supernatant under all conditions but there was no difference between conditions including the control. These results suggest that dust is an indirect inducer of PTX3.

Au moins 4 herpèsvirus majeurs peuvent infecter le cheval au niveau de ses voies respiratoires ; 2 alpha-herpèsvirus (les herpèsvirus équins 1 et 4) et 2 gamma-herpèsvirus (les herpèsvirus équins 2 et 5). Les deux gamma-herpèsvirus ont été identifiés partout dans le monde depuis très longtemps mais leur pouvoir pathogène demeure moins bien connu. Parallèlement, de nombreux travaux portant sur les maladies respiratoires sub-cliniques du cheval athlète ont pu mettre en évidence lintérêt de recherches approfondies sur le rôle des virus dans le déclenchement ou lentretien de ces pathologies souvent inflammatoires. . La prévalence de ces 4 virus a étéévaluée lors dune première étude portant sur plus de 700 liquides de lavages respiratoires à laide doutils de biologie moléculaire. Lherpèsvirus équin 2 sest avéré comme le plus présent dans un groupe de chevaux contre performants dans les liquides trachéaux. Une infection expérimentale conduite sur 6 chevaux a permis de reproduire la maladie, de détecter le virus dans divers compartiments biologiques dont la trachée pendant plus de 14 jours post infection. La présence du virus était contemporaine de ciliocytophtorie des cellules épithéliales et dune neutrophilie dans le liquide. Lherpèsvirus équin 2 peut donc induire une inflammation de la trachée et des anomalies morphologiques des cellules épithéliales ce qui en fait un co-facteur potentiel du syndrome dinflammation trachéale, préoccupant pour léconomie du cheval athlète / Equine gamma-herpesvirus 2 and 5 have been identified worldwide since many years. Their real pathogenic role has still to be determined. On the other hand, many important studies have been performed in order to better understand subclinical diseases of the athletic horse. Several publications pointed out the potential incidence of viruses in lower airway inflammation. Within the first step of this work, over 700 respiratory fluids were tested in order to detect and to evaluate the presence of equid herpesviruses in these biological samples. Using molecular tools, Equid herpesvirus 2 was found to significantly be the most important among the four herpesviruses detected in tracheal washes of a group of poorly-performing horses. An experimental infection with equid herpesvirus 2 was then conducted on 6 horses and succeeded in reproducing clinical and cytological signs of disease and virus shedding in most biological samples including tracheal washes. The virus shedding was concomitant with ciliocytophthoria of the exfoliated epithelial cells and liquid neutrophilia. Equid herpesvirus 2 can induce a tracheal inflammation and ciliocytophthoria. This virus could play a role in the new syndrome of tracheal inflammation, and could be an important feature for equine industry

Le tiludronate (Tildren, CEVA Santé Animale, Libourne, France) est un bisphosphonate récemment introduit sur le marché dans plusieurs pays européens pour le traitement du syndrome podotrochléaire (syndrome naviculaire) et de lostéoarthrose des articulations intertarsienne distale et tarso-métatarsienne (éparvin) chez le cheval. Il est le premier bisphosphonate disponible en médecine vétérinaire en général, et en médecine équine en particulier. La posologie de tiludronate qui a fait lobjet dun enregistrement dans différents pays dEurope est de 10 administrations quotidiennes consécutives de 0.1 mg/kg sous forme de bolus intraveineux (IV). Or, il ressort de la pratique courante que ladministration de la dose totale de 1 mg/kg en une perfusion lente unique est préférée par les utilisateurs pour des raisons pratiques et financières. Il ressort aussi de différentes études que cette forme dadministration est bien tolérée (Varela et al., 2002) et efficace dans certaines pathologies (Coudry et al., 2007). La première étude de ce travail a consisté en la comparaison pharmacologique de ces deux schémas posologiques. Il en est ressorti quils produisaient une même exposition plasmatique totale et des effets similaires sur le marqueur plasmatique de résorption osseuse carboxy-télopeptide du collagène de type I (CTX-1). Il en a été conclu que les dix administrations quotidiennes consécutives de 0.1 mg/kg pouvaient être remplacées par la perfusion IV lente unique de 1 mg/kg. Les bisphosphonates sont caractérisés par des propriétés pharmacologiques très spécifiques et inhabituelles, de par leur forte affinité pour los et leur stockage à long terme dans ce compartiment profond. De ce fait, les modèles PK-PD classiques qui mettent en relation mathématique les concentrations plasmatiques avec les effets du médicament sont inadaptés pour décrire le comportement pharmacologique des bisphosphonates, et il est suggéré que les concentrations osseuses doivent être davantage prises en compte pour le développement de tels modèles (Cremers et al., 2005). Dans le but final de développer un modèle PK-PD du tiludronate chez le cheval, une méthode de biopsie osseuse permettant la répétition de dosages de tiludronate osseux a été validée dans la seconde étude de cette thèse. Dans celle-ci, huit chevaux ont subi des biopsies osseuses bilatéralement en quatre sites (le tuber coxae, le métacarpien principal, la 13ème côte et los cuboïde) à différentes échéances sétalant de 1 jour à 1 an après 1 (n=4) ou 2 (n=4, à 4 semaines dintervalle) traitement(s) au tiludronate à raison de 1 mg/kg par voie IV. En chaque site, les biopsies osseuses ont été effectuées à la fois à laide dune fraise électrique de 5 mm de diamètre interne (Implanteo, Anthogyr) pour léchantillon test et dun ostéotome ou dune scie oscillante pour léchantillon de référence. Le tuber coxae sest avéré être le meilleur site de biopsie, à la fois accessible, facile à biopsier, et sur lequel les dosages de tiludronate ne présentaient pas de difficultés techniques et étaient fiables. Malheureusement, ces biopsies noffraient pas un matériel qualitativement et quantitativement suffisant que pour permettre des analyses histologiques et histomorphométriques. Dans une troisième étude, a donc été testée sur quatre chevaux la validité pour ce type danalyses dune autre technique de biopsies, utilisant un plus grand trocart que dans létude 2 (15 versus 5 mm de diamètre interne), et de type manuel. Les biopsies ont été réalisées sur cheval debout au niveau du tuber coxae immédiatement avant (côté gauche) et 48 h après (côté droit) ladministration dune perfusion IV lente de 1 mg/kg de tiludronate. Les biopsies ainsi réalisées ont permis deffectuer les analyses escomptées. Cependant, aucun effet précoce du traitement au tiludronate na pu être mis en évidence sur les paramètres histologiques et histomorphométriques étudiés. Aucun modèle expérimental équin relatif aux pathologies pour lesquelles le tiludronate a été enregistré nexiste. Or il est indispensable, pour mieux en cerner les propriétés pharmacologiques et les applications cliniques potentielles, de tester son efficacité en conditions standardisées. Limmobilisation dun membre sous plâtre est connue pour induire de lostéopénie de non usage chez le cheval (Buckingham et Jeffcott, 1991; van Harreveld et al., 2002). Dans la quatrième étude de ce travail, lefficacité clinique du tiludronate versus placebo a été testée dans les conditions standardisées dun modèle équin dostéopénie induite par immobilisation sous plâtre dun membre antérieur pendant huit semaines. Seize chevaux ont ainsi été immobilisés, dont huit ont reçu un placebo, et huit ont été traités au tiludronate à raison de 1 mg/kg en perfusion IV lente deux fois à quatre semaines dintervalle, soit en début et à mi-immobilisation. Après la période dimmobilisation, les chevaux ont été progressivement remobilisés pendant 4 semaines puis ont subi un entraînement standardisé pendant 8 semaines. Le traitement au tiludronate a permis de prévenir la chute significative de densité minérale osseuse (DMO) mesurée par absorptiométrie biphotonique à rayons X (DEXA) observée à long terme au niveau du membre immobilisé des chevaux du groupe placebo. Cet effet préventif ne sest pas marqué sur le membre controlatéral. Le tiludronate a également induit chez les chevaux traités une chute rapide et significative du taux de CTX-1 sérique, contrairement aux chevaux du groupe placebo chez qui ce taux est resté élevé pendant la quasi-totalité de limmobilisation. Aucun effet du tiludronate na été constaté sur lactivité des iso-enzymes osseuses des phosphatases alcalines (bone ALP), marqueur de formation osseuse, ni sur les caractéristiques du cortex superficiel du canon du membre immobilisé évaluées par ultrasonographie quantitative (QUS). De lensemble de ces travaux, il a été conclu que (1) le CTX-1 sanguin est un marqueur de résorption osseuse sensible et adéquat pour le suivi dun traitement au tiludronate chez le cheval ; (2) le tuber coxae est un site de biopsie osseuse adéquat pour effectuer les analyses nécessaires à lélaboration dun modèle PK-PD du tiludronate chez le cheval ; (3) le tiludronate administré deux fois à quatre semaines dintervalle à la dose de 1 mg/kg IV est capable dinhiber la résorption osseuse dans un modèle dimmobilisation chez le cheval, et la DEXA est une méthode suffisamment sensible pour lobjectiver en quelques mois ; (4) de nouvelles études pharmacologiques devraient être menées afin de documenter laccumulation osseuse et les effets du tiludronate sur différents paramètres pharmacodynamiques en cas dadministrations répétées de perfusions de 1 mg/kg chez le cheval. Pour ce faire, des techniques plus sensibles de dosage du tiludronate devraient idéalement être utilisées dans un souci dexactitude des données. Dautre part, de nouvelles études cliniques defficacité sur des chevaux souffrant de pathologies osseuses devraient être menées en incluant des mesures de CTX-1 sanguin, et si possible des mesures de DMO à différents sites dintérêt.