Submitted by Laura Marise de Freitas (lfmarise@gmail.com) on 2018-09-10T15:39:23Z No. of bitstreams: 1 Tese_Laura Marise de Freitas_versão final.pdf: 4709989 bytes, checksum: 2a6883e17e7a9640be4de2033a6a9cc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Irani Coito null (irani@fcfar.unesp.br) on 2018-09-14T14:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 freitas_lm_dr_arafcf_par.pdf: 5388332 bytes, checksum: fe6fd07679b403b891b076d6d97abd54 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T14:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 freitas_lm_dr_arafcf_par.pdf: 5388332 bytes, checksum: fe6fd07679b403b891b076d6d97abd54 (MD5) Previous issue date: 2018-08-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nos últimos anos, a Organização Mundial da Saúde vem alertando que a era pós-antibióticos é uma ameaça cada vez mais real. Além da resistência individual das células bacterianas, essas podem se tornar ainda mais tolerantes aos agentes antimicrobianos ao crescerem em biofilmes. A maior tolerância aos antibióticos observada nos biofilmes baseia-se principalmente na proteção das bactérias pela matriz polimérica extracelular autoproduzida, e nos diversos fenótipos de crescimento encontrados na estrutura, que podem ser refratários à ação os fármacos convencionais. Nesse cenário de crescente e disseminada resistência a antimicrobianos, a busca por novos fármacos e terapias alternativas se tornou crucial, especialmente aqueles que sejam capazes de eliminar os microrganismos resistentes, impedir o desenvolvimento de novas formas de resistência, e serem ativos contra biofilmes. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) e os peptídeos antimicrobianos (PAM) ganham destaque nesse contexto, em especial para o tratamento de infecções localizadas. Entretanto, ambas as abordagens apresentam limitações terapêuticas quando empregadas individualmente. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo estudar os efeitos e mecanismos da combinação dos PAMs aureína 1.2 (AU) e seu dímero (AU)2K com a aPDT mediada pelos fotossensibilizadores (FS) azul de metileno (AM), clorina-e6 (Ce6) ou curcumina (CUR), usando como modelo a bactéria Enterococcus faecalis, em fase planctônica e biofilme. O dímero (AU)2K não apresentou atividade antibacteriana em fase planctônica, sendo a parte inicial do estudo conduzida, então, apenas com o monômero. Os resultados mostram que a combinação da aPDT com AU se provou capaz de eliminar E. faecalis, in vitro, com baixas concentrações de FS e peptídeo e menores doses de luz, em comparação às monoterapias. O efeito sinérgico foi observado apenas quando a AU foi associada à aPDT mediada por AM ou Ce6, não sendo encontrada vantagem na terapia combinada quando o FS era CUR, revelando um mecanismo dependente do FS. O efeito sinérgico entre AU e AM-PDT foi resultado de uma maior penetração do FS na bactéria em presença do peptídeo, ao passo que o efeito sinérgico entre AU e Ce6-PDT se deu por uma interação entre as moléculas que levou a uma maior instabilidade da membrana plasmática. O tratamento combinado também foi eficaz contra diferentes cepas, incluindo a eliminação completa de uma cepa de Enterococcus faecium resistente à vancomicina, um resultado sem precedentes. O protocolo de terapia combinada foi testado quanto à sua capacidade de inibir a formação de biofilme de E. faecalis. Embora não apresente atividade contra bactérias em fase planctônica, o dímero (AU)2K foi incluído nos estudos com biofilmes, mostrando alta capacidade de impedir a fase inicial do desenvolvimento dos biofilmes, tanto sozinho quanto combinado à aPDT. O monômero (AU) também apresentou atividade significativa para impedir que E. faecalis forme biofilme, particularmente quando combinado à Ce6-PDT. Outras espécies bacterianas também foram avaliadas, sendo os protocolos de combinação capazes de impedir a formação de biofilme por todas elas de forma significativa. Tomados em conjunto, os resultados obtidos neste estudo revelam que a combinação de aPDT com um PAM pode provocar a morte bacteriana com concentrações mínimas de FS e PAM e baixas doses de luz, o que, por sua vez, minimizaria os efeitos adversos no tecido do hospedeiro. Além disso, a capacidade de inibir a formação de biofilme por parte dessa abordagem demonstra seu potencial para impedir o estabelecimento de infecções crônicas, fortemente relacionadas a biofilmes microbianos. Essa abordagem sinérgica tem o potencial de eliminar infecções localizadas e, ao mesmo tempo, minimizar o uso de antimicrobianos sistêmicos e impedir o desenvolvimento de novos perfis de resistência. / In the past few years, the World Health Organization has been warning that the post-antibiotic era is an increasingly real threat. In addition to the individual resistance of bacterial cells, they may be even more tolerant to antimicrobial agents by growing in biofilms. The higher tolerance to antibiotics observed in biofilms is mainly based on the protection of bacteria by the self-produced extracellular polymeric matrix, and in the various growth phenotypes found in the structure, which may be refractory to the action of conventional drugs. In this scenario of increasing and widespread antimicrobial resistance, the search for new drugs and alternative therapies has become crucial, especially for those that are capable of eliminating resistant microorganisms, preventing the development of new forms of resistance, and are active against biofilms. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) and antimicrobial peptides (AMP) are highlighted in this context, especially for the treatment of localized infections. However, both approaches have therapeutic limitations when used individually. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effects and mechanisms of the combination of the AMPs aurein 1.2 (AU) and its dimer (AU)2K with aPDT mediated by the photosensitizers (PS) methylene blue (MB), chlorine-e6 (Ce6) or curcumin CUR), using the bacteria Enterococcus faecalis as a model, in planktonic phase and biofilm. The dimer (AU)2K did not present antibacterial activity in planktonic phase, so the initial part of the study was conducted only with the monomer. The results show that the combination of aPDT with AU proved to be able to eliminate E. faecalis, in vitro, with low concentrations of PS and peptide and lower light doses, compared to the monotherapies. The synergistic effect was observed only when AU was associated with MB or Ce6-mediated aPDT, and no advantage was found in the combination therapy when the PS was CUR, revealing a PS-dependent mechanism. The synergistic effect between AU and MB-PDT was a result of a greater penetration of the PS in the bacterium in the presence of the peptide, whereas the synergistic effect between AU and Ce6-PDT was due to an interaction between the molecules that led to greater instability of the plasmatic membrane. The combination treatment was also effective against different strains, including a complete elimination of a strain of vancomycin-resistant Enterococcus faecium, an unprecedented result. The combination therapy protocol was tested for its ability to inhibit E. faecalis biofilm formation. Although it did not present activity against planktonic bacteria, the (AU)2K dimer was included in the biofilm studies, showing high capacity to prevent the initial phase of biofilm development, both alone and combined with aPDT. The monomer AU also showed significant activity to prevent E. faecalis from forming biofilm, particularly when combined with Ce6-PDT. Other bacterial species were also evaluated, and the combination protocols were able to prevent biofilm formation by all of them in a significant way. Taken together, the results obtained in this study reveal that the combination of aPDT with an AMP can lead to bacterial death with minimal concentrations of PS and AMP and low light doses, which in turn would minimize adverse effects on host tissue. In addition, the ability of this approach in inhibiting the formation of biofilms reveals its potential to prevent the establishment of chronic infections, strongly related to microbial biofilms. This synergistic approach has the potential to resolve localized infections while minimizing the use of systemic antimicrobials and preventing the development of new resistance profiles. / 2014/24581-5 / 2016/18378-8

A clorofilina cúprica de sódio (CuChl) é um corante semissintético derivado da clorofila. Quimicamente é constituído de diversas clorinas, em especial a clorina cúprica e4 (CuCe4), a clorina cúprica e6 (CuCe6), e possíveis clorinas e porfirinas não cúpricas em proporções variáveis. Além do seu uso como corante alimentar, são atribuídas atividades biológicas à CuChl, tais como, antimutagênica, anticarcinogênica e antioxidante. Em decorrência destes potenciais efeitos benéficos, sua comercialização sob a forma de suplementos é crescente. Todavia, curiosamente, informações sobre a absorção e biodisponibilidade da CuChl são escassas. Além disso, até o momento nenhum estudo avaliou o impacto da composição da CuChl em sua bioatividade e eficácia. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar e caracterizar quimicamente duas amostras de CuChl (Sigma® e Chr. Hansen®) e o padrão de CuCe6 (Frontier Scientific®). Para tanto, empregou-se técnicas cromatográficas e espectrofotométricas, determinou-se a lipofilicidade em modelos miméticos de membrana, cinética de degradação e avaliou-se a interação CuCe6/BSA. A análise elementar da CuChl resultou em teores de cobre total inferiores aos recomendados pela United States Pharmacopeia (U.S.P.). Os elementos (CHN) e a razão Cu/N não foram coerentes com os valores teóricos da molécula de CuChl. Apenas uma amostra de CuChl apresentou razão Soret/Q dentro dos valores preconizados pela U.S.P. A titulação base-ácido da CuCe6 revelou dois valores de pkas (10,62 e 6,41) que foram similares para as amostras de CuChl. A determinação de log P da CuCe6 mostrou que a hidrofobicidade é máxima em pH 3 (log P = 1,49±0,09) e sua hidrofilicidade ocorre em pHs > 7. Esse comportamento foi confirmado nos ensaios de incorporação em lipossomas em função do pH. A degradação térmica da CuChl (25 a 95 °C) avaliada por HPLC foi drástica a partir de 75 °C. A energia necessária para que ocorra a degradação da CuChl e CuCe6 é Ea = 16,1 e 9,3kcal/mol, respectivamente. A meia-vida a 35 °C é de 6 horas para a CuChl e 2 horas e meia para a CuCe6. A separação mais eficiente dos componentes da CuChl por HPLC foi conseguida utilizando coluna C30 e a identificação dos principais constituintes CuCe6, CuCe4 e a clorina cúprica p6 (CuCp6), ocorreu por HPLC/MSMS. No estudo da ligação entre CuCe6 e proteína BSA foram obtidos os valores de KD = 0,38 ± 0,07 µM, KA = 3,3 ± 0,28 x 106 M-1 e número de sítios de ligação ~1 (N = 0,75 ± 0,09), indicativo de alta afinidade entre a clorina e a proteína. Assim, o comportamento químico dos principais componentes da CuChl e sua interação com os componentes do soro tornaram inviáveis a identificação e quantificação destas moléculas em ensaios in vivo. Os resultados aqui apresentados servem de subsídio para o desenvolvimento de outras pesquisas que visem o estudo específico da associação e dissociação da CuChl em material biológico. / Sodium copper chlorophyllin (CuChl) is a semisynthetic derivative of chlorophyll dye. It is composed chemically by several chlorins, especially copper chlorin e4 (CuCe4), copper chlorin e6 (CuCe6), and possible others no copper porphyrins and chlorins in different proportions. In addition to its use as a food coloring, CuChl may have interesting biological effects as antimutagenic, anticarcinogenic and antioxidant. Because of these potential benefits, its use as a dietary supplement is increasing. However, information on the absorption and bioavailability of CuChl is scarce. Furthermore, no studies have evaluated the impact of CuChl composition in its bioactivity and efficacy. Thus, the present study aimed to identify and chemically characterize two samples of CuChl (Sigma® and Hansen®) and the standard of CuCe6 (Frontier Scientific®). Chromatographic and spectrometric techniques as well as mimetics models membrane were used. The CuCe6/BSA interaction was also evaluated. The elemental analysis of CuChl showed that the total copper content of it was smaller that the one recommended by United States Pharmacopeia (USP). The elements (CHN) and the ratio Cu / N were not consistent with the theoretical values of the molecule CuChl. Only one CuChl sample showed Soret / Q ratio within the range recommended by USP. The acid-base titration of CuCe6 revealed two pKas values (10.62 and 6.41), which were similar for CuChl samples. The log P determination of CuCe6 showed that its hydrophobicity is maximal at pH 3 (log P = 1.49 ± 0.09) and its hydrophilicity occurs at pH> 7. These results were confirmed using the incorporation into liposomes assay in function of pH. Using HPLC, it was observed that thermal degradation of CuChl (25 to 95 °C) hardly occurred from 75 °C. The energy necessary for CuChl and CuCe6 degradation is Ea = 16.1 and 9.3 kcal/mol, respectively. The half-life at 35°C for CuChl and CuCe6 is 6 hours and 2 ½ hours, respectively. A more efficient separation of the CuChl components by HPLC was achieved using a C30 column while its major constituents CuCe6, CuCe4 and copper chlorin p6 (CuCp6) were identified by HPLC / MS-MS. In binding analysis of CuCe6 and BSA, it was observed KD = 0.38 ± 0.07 mM, KA = 3.3 ± 0.28 x 106 M-1, and number of binding sites ~ 1 (N = 0.75 ± .09), indicating high affinity between BSA and chlorine. Thus, due to the chemical characteristics of the main components of CuChl and their interaction with serum components the identification and quantification of these molecules in vivo is unviable. Future studies should investigate the association and dissociation of CuChl in biological samples.

L’émergence de nouvelles souches bactériennes résistantes a signé la fin de l’« âge d’or » des antibiotiques. L’organisation mondiale de la santé a reconnu l’imminence des problèmes associés à ces nouvelles bactéries, qui engendrent de nouveau une mortalité en augmentation. Afin de palier à ce problème, de nouvelles alternatives aux antibiotiques sont envisagées par les chercheurs à travers le monde. La thérapie photodynamique antimicrobienne est l’une de ces alternatives. Elle a su se démarquer grâce à son incapacité à induire la résistance bactérienne. Alors que les résultats furent initialement très prometteurs contre les bactéries Gram positif, une moins bonne sensibilité fut rapidement observée de la part des bactéries Gram négatif. Afin d’augmenter le potentiel antibactérien de cette technique, diverses stratégies furent élaborées comme l’utilisation de photosensibilisateurs cationiques, l’ajout d’un agent de ciblage, ou la présence d’un agent de perméabilisation membranaire. L’un de ces agents est la polymyxine B, un peptide antimicrobien qui arbore une très bonne affinité avec les bactéries Gram négatif. Dans cette étude, nous avons voulu associer chimiquement différents photosensibilisateurs avec des dérivés de polymyxines B de façon covalente, par l’intermédiaire d’un bras « spacer » ou d’une plateforme. L’association de ces deux familles de molécules a permis d’élaborer de nouveaux composés qui ont démontré une activité photobactéricide accrue contre un large spectre de bactérie. De plus, ces composés ont montré une affinité augmentée pour les bactéries, ce qui permettra de réduire les effets secondaires sur les cellules humaines. Cette étude confirme l’importance d’utiliser des peptides antimicrobiens afin d’améliorer la thérapie photodynamique. Ces travaux seront approfondis afin de permettre la création de nouveaux traitements dermatologiques basées sur cette nouvelle thérapie et efficaces contre un large spectre de souche bactérienne / Despite advances achieved over the last decade, infections caused by multi-drug resistant bacterial strains are increasingly important societal issues that need to be addressed. New approaches have already been developed in order to overcome this problem. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) could provide an alternative to fight infectious bacteria. Interesting results have been obtained against Gram-positive bacteria, but it also appeared that Gram-negative strains were less sensitive to PACT. Enhanced efficacy against Gram-negative bacteria had been previously obtained following three differents strategies, which are respectively the use of cationic photosensitizers, photosensitizers bound to antimicrobial peptides, or a membrane disrupting agent. Polymyxin B is an antimicrobial peptide, known as the “last-line” treatment against Gram-negative resistant strains, which has already been used as a disrupting agent in order to improve PACT. In addition of this enhancement, this peptide is known for its strong interaction for Gram-negative bacteria. Thus, in this work, we designed differents coumpounds, consisting of a photosensitizer covalently attached to derivatives of polymyxin B, through a spacer or a chemical platform. These combinations have led to the creation of novel compounds which have shown highly photobactericidal activities against a wide spectrum of bacteria. Moreover, these compounds present enhanced affinity for bacteria, which should significantly reduce side effects on mammalian cells. This study confirmed the importance of using antimicrobial in order to target bacterial strains. Thus, such results may allow the creation of novels PACT-based dermatological treatments efficient against a wide spectrum of bacterial strains.