Orientador: Juliana Campos Junqueira / Resumo: A terapia fotodinâmica (TFD) é uma técnica que combina um fotossensibilizador (FS) com luz visível e oxigênio molecular, podendo ser utilizada como agente antimicrobiano no controle de diversas doenças infecciosas, como a cárie dentária. A quitosana vem demonstrando atividade promissora quando associada à alguns fotossensibilizadores. Portanto, o objetivo desse trabalho foi investigar a associação da quitosana com o fotossensibilizador Photodithazine® (PDZ) na TFD sobre culturas planctônicas e biofilmes de S. mutans, bem como avaliar sua eficácia sobre biofilmes microcosmos orais. Inicialmente, foi preparada uma suspensão de S. mutans UA 159 padronizada em 106 células/mL. Para o estudo em culturas planctônicas, foi adicionada a suspensão de S. mutans em placas de 96 poços. Para o estudo em biofilmes, foram confeccionadas amostras de esmalte de dentes bovinos como substrato para a formação do biofilme em placas de 24 poços. As culturas planctônicas e os biofilmes foram tratados de acordo com os grupos experimentais, recebendo adição de PDZ, quitosana ou PBS, seguido pela irradiação ou pela manutenção em ambiente escuro (controle). Os efeitos dos tratamentos foram analisados por meio da contagem de UFC/mL de S. mutans em ágar Infusão Cérebro Coração (BHI) incubadas por 48h a 37°C (5% de CO2) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Além disso, para confirmar a penetração do FS e da quitosana nas células de S. mutans foi realizado teste de absorbância. A seguir, foram estuda... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des cancers prometteuse, mettant en jeu une action combinée de l’oxygène moléculaire, de la lumière et d’un photosensibilisateur (PS). Néanmoins, les PSs utilisés souffrent d’une faible solubilité dans les milieux aqueux ainsi que d’un tumorotropisme limité qui sont des barrières à la réussite du traitement. Ainsi, actuellement, une attention particulière est portée au développement de nanoparticules (NPs) capables de pallier les défauts des PSs. Notre travail a consisté à étudier des dendrimères poly(amidoamine) (PAMAM), macromolécules polymériques tridimensionnelles, conjugués via une liaison covalente au PS, la Chlorine e6 (Ce6). Cette construction nous a permis de vectoriser 32 molécules de Ce6 par dendrimère. La production d’oxygène singulet et l’émission de fluorescence ont été modérément affectées par le greffage covalent de la Ce6 aux NPs. In vitro, les dendrimères PAMAM ont permis d’accroitre l’efficacité PDT de la Ce6 en potentialisant son internalisation cellulaire via un mécanisme actif d’endocytose. Néanmoins, l’efficacité PDT des NPs est limitée par la concentration locale élevée en Ce6 en périphérie des dendrimères qui réduit son rendement quantique en oxygène singulet moléculaire, espèce cytotoxique. Une libération de la Ce6 permettrait ainsi de potentialiser l’efficacité PDT des NPs en restaurant notamment les propriétés photophysiques de la Ce6. La suite de ce travail a été de concevoir une NP capable de libérer la Ce6 sous l’action d’estérases retrouvées dans les cellules. Leur caractérisation a permis de démontrer en solution que les propriétés photophysiques de la Ce6 étaient rétablies à la suite de son relargage des NPs. Cette dernière construction clivable est prometteuse pour de futures applications en PDT / Photodynamic therapy (PDT) is a modality of cancer treatment, involving a combined action of molecular oxygen, light and photosensitizers (PS). However, the PSs suffer from a low solubility in aqueous media and limited tumor accumulation, diminishing the treatment success. Presently, particular attention is paied to the development of dendrimer-based nanoparticles (NP) that are able to overcome the shortcomings of the PSs. The present study investigates the poly(amidoamine) dendrimer (PAMAM), a tridimensional polymeric macromolecule, covalently functionalized with the PS Chlorin e6 (Ce6). The singlet oxygen generation efficiency and fluorescence emission were moderately affected by the covalent binding of the Ce6 to the dendrimer. This construction allows the vectorization of 32 Ce6 molecules per dendrimer. In vitro, PAMAM dendrimers improve the PDT efficiency of Ce6 by promoting their cellular internalization via an active endocytosis mechanism. However, the PDT efficiency of NPs is limited by the high local concentration of Ce6 at the periphery of dendrimers decreasing production of singlet oxygen. Ce6 release could restore Ce6 photophysical properties and as such improve the PDT efficiency of NP. Thus, the next step of this work was to design a cleavable NP able to release the Ce6 under esterase activity. In solution the NP characterization demonstrated that the photophysical properties of Ce6 were recovered after their release from the NP. This cleavable construction displays promising perspectives for future PDT applications

A clorofilina cúprica de sódio (CuChl) é um corante semissintético derivado da clorofila. Quimicamente é constituído de diversas clorinas, em especial a clorina cúprica e4 (CuCe4), a clorina cúprica e6 (CuCe6), e possíveis clorinas e porfirinas não cúpricas em proporções variáveis. Além do seu uso como corante alimentar, são atribuídas atividades biológicas à CuChl, tais como, antimutagênica, anticarcinogênica e antioxidante. Em decorrência destes potenciais efeitos benéficos, sua comercialização sob a forma de suplementos é crescente. Todavia, curiosamente, informações sobre a absorção e biodisponibilidade da CuChl são escassas. Além disso, até o momento nenhum estudo avaliou o impacto da composição da CuChl em sua bioatividade e eficácia. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar e caracterizar quimicamente duas amostras de CuChl (Sigma® e Chr. Hansen®) e o padrão de CuCe6 (Frontier Scientific®). Para tanto, empregou-se técnicas cromatográficas e espectrofotométricas, determinou-se a lipofilicidade em modelos miméticos de membrana, cinética de degradação e avaliou-se a interação CuCe6/BSA. A análise elementar da CuChl resultou em teores de cobre total inferiores aos recomendados pela United States Pharmacopeia (U.S.P.). Os elementos (CHN) e a razão Cu/N não foram coerentes com os valores teóricos da molécula de CuChl. Apenas uma amostra de CuChl apresentou razão Soret/Q dentro dos valores preconizados pela U.S.P. A titulação base-ácido da CuCe6 revelou dois valores de pkas (10,62 e 6,41) que foram similares para as amostras de CuChl. A determinação de log P da CuCe6 mostrou que a hidrofobicidade é máxima em pH 3 (log P = 1,49±0,09) e sua hidrofilicidade ocorre em pHs > 7. Esse comportamento foi confirmado nos ensaios de incorporação em lipossomas em função do pH. A degradação térmica da CuChl (25 a 95 °C) avaliada por HPLC foi drástica a partir de 75 °C. A energia necessária para que ocorra a degradação da CuChl e CuCe6 é Ea = 16,1 e 9,3kcal/mol, respectivamente. A meia-vida a 35 °C é de 6 horas para a CuChl e 2 horas e meia para a CuCe6. A separação mais eficiente dos componentes da CuChl por HPLC foi conseguida utilizando coluna C30 e a identificação dos principais constituintes CuCe6, CuCe4 e a clorina cúprica p6 (CuCp6), ocorreu por HPLC/MSMS. No estudo da ligação entre CuCe6 e proteína BSA foram obtidos os valores de KD = 0,38 ± 0,07 µM, KA = 3,3 ± 0,28 x 106 M-1 e número de sítios de ligação ~1 (N = 0,75 ± 0,09), indicativo de alta afinidade entre a clorina e a proteína. Assim, o comportamento químico dos principais componentes da CuChl e sua interação com os componentes do soro tornaram inviáveis a identificação e quantificação destas moléculas em ensaios in vivo. Os resultados aqui apresentados servem de subsídio para o desenvolvimento de outras pesquisas que visem o estudo específico da associação e dissociação da CuChl em material biológico. / Sodium copper chlorophyllin (CuChl) is a semisynthetic derivative of chlorophyll dye. It is composed chemically by several chlorins, especially copper chlorin e4 (CuCe4), copper chlorin e6 (CuCe6), and possible others no copper porphyrins and chlorins in different proportions. In addition to its use as a food coloring, CuChl may have interesting biological effects as antimutagenic, anticarcinogenic and antioxidant. Because of these potential benefits, its use as a dietary supplement is increasing. However, information on the absorption and bioavailability of CuChl is scarce. Furthermore, no studies have evaluated the impact of CuChl composition in its bioactivity and efficacy. Thus, the present study aimed to identify and chemically characterize two samples of CuChl (Sigma® and Hansen®) and the standard of CuCe6 (Frontier Scientific®). Chromatographic and spectrometric techniques as well as mimetics models membrane were used. The CuCe6/BSA interaction was also evaluated. The elemental analysis of CuChl showed that the total copper content of it was smaller that the one recommended by United States Pharmacopeia (USP). The elements (CHN) and the ratio Cu / N were not consistent with the theoretical values of the molecule CuChl. Only one CuChl sample showed Soret / Q ratio within the range recommended by USP. The acid-base titration of CuCe6 revealed two pKas values (10.62 and 6.41), which were similar for CuChl samples. The log P determination of CuCe6 showed that its hydrophobicity is maximal at pH 3 (log P = 1.49 ± 0.09) and its hydrophilicity occurs at pH> 7. These results were confirmed using the incorporation into liposomes assay in function of pH. Using HPLC, it was observed that thermal degradation of CuChl (25 to 95 °C) hardly occurred from 75 °C. The energy necessary for CuChl and CuCe6 degradation is Ea = 16.1 and 9.3 kcal/mol, respectively. The half-life at 35°C for CuChl and CuCe6 is 6 hours and 2 ½ hours, respectively. A more efficient separation of the CuChl components by HPLC was achieved using a C30 column while its major constituents CuCe6, CuCe4 and copper chlorin p6 (CuCp6) were identified by HPLC / MS-MS. In binding analysis of CuCe6 and BSA, it was observed KD = 0.38 ± 0.07 mM, KA = 3.3 ± 0.28 x 106 M-1, and number of binding sites ~ 1 (N = 0.75 ± .09), indicating high affinity between BSA and chlorine. Thus, due to the chemical characteristics of the main components of CuChl and their interaction with serum components the identification and quantification of these molecules in vivo is unviable. Future studies should investigate the association and dissociation of CuChl in biological samples.

Submitted by Laura Marise de Freitas (lfmarise@gmail.com) on 2018-09-10T15:39:23Z No. of bitstreams: 1 Tese_Laura Marise de Freitas_versão final.pdf: 4709989 bytes, checksum: 2a6883e17e7a9640be4de2033a6a9cc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Irani Coito null (irani@fcfar.unesp.br) on 2018-09-14T14:54:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 freitas_lm_dr_arafcf_par.pdf: 5388332 bytes, checksum: fe6fd07679b403b891b076d6d97abd54 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T14:54:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 freitas_lm_dr_arafcf_par.pdf: 5388332 bytes, checksum: fe6fd07679b403b891b076d6d97abd54 (MD5) Previous issue date: 2018-08-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nos últimos anos, a Organização Mundial da Saúde vem alertando que a era pós-antibióticos é uma ameaça cada vez mais real. Além da resistência individual das células bacterianas, essas podem se tornar ainda mais tolerantes aos agentes antimicrobianos ao crescerem em biofilmes. A maior tolerância aos antibióticos observada nos biofilmes baseia-se principalmente na proteção das bactérias pela matriz polimérica extracelular autoproduzida, e nos diversos fenótipos de crescimento encontrados na estrutura, que podem ser refratários à ação os fármacos convencionais. Nesse cenário de crescente e disseminada resistência a antimicrobianos, a busca por novos fármacos e terapias alternativas se tornou crucial, especialmente aqueles que sejam capazes de eliminar os microrganismos resistentes, impedir o desenvolvimento de novas formas de resistência, e serem ativos contra biofilmes. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT, do inglês antimicrobial photodynamic therapy) e os peptídeos antimicrobianos (PAM) ganham destaque nesse contexto, em especial para o tratamento de infecções localizadas. Entretanto, ambas as abordagens apresentam limitações terapêuticas quando empregadas individualmente. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo estudar os efeitos e mecanismos da combinação dos PAMs aureína 1.2 (AU) e seu dímero (AU)2K com a aPDT mediada pelos fotossensibilizadores (FS) azul de metileno (AM), clorina-e6 (Ce6) ou curcumina (CUR), usando como modelo a bactéria Enterococcus faecalis, em fase planctônica e biofilme. O dímero (AU)2K não apresentou atividade antibacteriana em fase planctônica, sendo a parte inicial do estudo conduzida, então, apenas com o monômero. Os resultados mostram que a combinação da aPDT com AU se provou capaz de eliminar E. faecalis, in vitro, com baixas concentrações de FS e peptídeo e menores doses de luz, em comparação às monoterapias. O efeito sinérgico foi observado apenas quando a AU foi associada à aPDT mediada por AM ou Ce6, não sendo encontrada vantagem na terapia combinada quando o FS era CUR, revelando um mecanismo dependente do FS. O efeito sinérgico entre AU e AM-PDT foi resultado de uma maior penetração do FS na bactéria em presença do peptídeo, ao passo que o efeito sinérgico entre AU e Ce6-PDT se deu por uma interação entre as moléculas que levou a uma maior instabilidade da membrana plasmática. O tratamento combinado também foi eficaz contra diferentes cepas, incluindo a eliminação completa de uma cepa de Enterococcus faecium resistente à vancomicina, um resultado sem precedentes. O protocolo de terapia combinada foi testado quanto à sua capacidade de inibir a formação de biofilme de E. faecalis. Embora não apresente atividade contra bactérias em fase planctônica, o dímero (AU)2K foi incluído nos estudos com biofilmes, mostrando alta capacidade de impedir a fase inicial do desenvolvimento dos biofilmes, tanto sozinho quanto combinado à aPDT. O monômero (AU) também apresentou atividade significativa para impedir que E. faecalis forme biofilme, particularmente quando combinado à Ce6-PDT. Outras espécies bacterianas também foram avaliadas, sendo os protocolos de combinação capazes de impedir a formação de biofilme por todas elas de forma significativa. Tomados em conjunto, os resultados obtidos neste estudo revelam que a combinação de aPDT com um PAM pode provocar a morte bacteriana com concentrações mínimas de FS e PAM e baixas doses de luz, o que, por sua vez, minimizaria os efeitos adversos no tecido do hospedeiro. Além disso, a capacidade de inibir a formação de biofilme por parte dessa abordagem demonstra seu potencial para impedir o estabelecimento de infecções crônicas, fortemente relacionadas a biofilmes microbianos. Essa abordagem sinérgica tem o potencial de eliminar infecções localizadas e, ao mesmo tempo, minimizar o uso de antimicrobianos sistêmicos e impedir o desenvolvimento de novos perfis de resistência. / In the past few years, the World Health Organization has been warning that the post-antibiotic era is an increasingly real threat. In addition to the individual resistance of bacterial cells, they may be even more tolerant to antimicrobial agents by growing in biofilms. The higher tolerance to antibiotics observed in biofilms is mainly based on the protection of bacteria by the self-produced extracellular polymeric matrix, and in the various growth phenotypes found in the structure, which may be refractory to the action of conventional drugs. In this scenario of increasing and widespread antimicrobial resistance, the search for new drugs and alternative therapies has become crucial, especially for those that are capable of eliminating resistant microorganisms, preventing the development of new forms of resistance, and are active against biofilms. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) and antimicrobial peptides (AMP) are highlighted in this context, especially for the treatment of localized infections. However, both approaches have therapeutic limitations when used individually. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effects and mechanisms of the combination of the AMPs aurein 1.2 (AU) and its dimer (AU)2K with aPDT mediated by the photosensitizers (PS) methylene blue (MB), chlorine-e6 (Ce6) or curcumin CUR), using the bacteria Enterococcus faecalis as a model, in planktonic phase and biofilm. The dimer (AU)2K did not present antibacterial activity in planktonic phase, so the initial part of the study was conducted only with the monomer. The results show that the combination of aPDT with AU proved to be able to eliminate E. faecalis, in vitro, with low concentrations of PS and peptide and lower light doses, compared to the monotherapies. The synergistic effect was observed only when AU was associated with MB or Ce6-mediated aPDT, and no advantage was found in the combination therapy when the PS was CUR, revealing a PS-dependent mechanism. The synergistic effect between AU and MB-PDT was a result of a greater penetration of the PS in the bacterium in the presence of the peptide, whereas the synergistic effect between AU and Ce6-PDT was due to an interaction between the molecules that led to greater instability of the plasmatic membrane. The combination treatment was also effective against different strains, including a complete elimination of a strain of vancomycin-resistant Enterococcus faecium, an unprecedented result. The combination therapy protocol was tested for its ability to inhibit E. faecalis biofilm formation. Although it did not present activity against planktonic bacteria, the (AU)2K dimer was included in the biofilm studies, showing high capacity to prevent the initial phase of biofilm development, both alone and combined with aPDT. The monomer AU also showed significant activity to prevent E. faecalis from forming biofilm, particularly when combined with Ce6-PDT. Other bacterial species were also evaluated, and the combination protocols were able to prevent biofilm formation by all of them in a significant way. Taken together, the results obtained in this study reveal that the combination of aPDT with an AMP can lead to bacterial death with minimal concentrations of PS and AMP and low light doses, which in turn would minimize adverse effects on host tissue. In addition, the ability of this approach in inhibiting the formation of biofilms reveals its potential to prevent the establishment of chronic infections, strongly related to microbial biofilms. This synergistic approach has the potential to resolve localized infections while minimizing the use of systemic antimicrobials and preventing the development of new resistance profiles. / 2014/24581-5 / 2016/18378-8

A clorofilina cúprica de sódio (CuChl) é um corante semissintético derivado da clorofila. Quimicamente é constituído de diversas clorinas, em especial a clorina cúprica e4 (CuCe4), a clorina cúprica e6 (CuCe6), e possíveis clorinas e porfirinas não cúpricas em proporções variáveis. Além do seu uso como corante alimentar, são atribuídas atividades biológicas à CuChl, tais como, antimutagênica, anticarcinogênica e antioxidante. Em decorrência destes potenciais efeitos benéficos, sua comercialização sob a forma de suplementos é crescente. Todavia, curiosamente, informações sobre a absorção e biodisponibilidade da CuChl são escassas. Além disso, até o momento nenhum estudo avaliou o impacto da composição da CuChl em sua bioatividade e eficácia. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar e caracterizar quimicamente duas amostras de CuChl (Sigma® e Chr. Hansen®) e o padrão de CuCe6 (Frontier Scientific®). Para tanto, empregou-se técnicas cromatográficas e espectrofotométricas, determinou-se a lipofilicidade em modelos miméticos de membrana, cinética de degradação e avaliou-se a interação CuCe6/BSA. A análise elementar da CuChl resultou em teores de cobre total inferiores aos recomendados pela United States Pharmacopeia (U.S.P.). Os elementos (CHN) e a razão Cu/N não foram coerentes com os valores teóricos da molécula de CuChl. Apenas uma amostra de CuChl apresentou razão Soret/Q dentro dos valores preconizados pela U.S.P. A titulação base-ácido da CuCe6 revelou dois valores de pkas (10,62 e 6,41) que foram similares para as amostras de CuChl. A determinação de log P da CuCe6 mostrou que a hidrofobicidade é máxima em pH 3 (log P = 1,49±0,09) e sua hidrofilicidade ocorre em pHs > 7. Esse comportamento foi confirmado nos ensaios de incorporação em lipossomas em função do pH. A degradação térmica da CuChl (25 a 95 °C) avaliada por HPLC foi drástica a partir de 75 °C. A energia necessária para que ocorra a degradação da CuChl e CuCe6 é Ea = 16,1 e 9,3kcal/mol, respectivamente. A meia-vida a 35 °C é de 6 horas para a CuChl e 2 horas e meia para a CuCe6. A separação mais eficiente dos componentes da CuChl por HPLC foi conseguida utilizando coluna C30 e a identificação dos principais constituintes CuCe6, CuCe4 e a clorina cúprica p6 (CuCp6), ocorreu por HPLC/MSMS. No estudo da ligação entre CuCe6 e proteína BSA foram obtidos os valores de KD = 0,38 ± 0,07 µM, KA = 3,3 ± 0,28 x 106 M-1 e número de sítios de ligação ~1 (N = 0,75 ± 0,09), indicativo de alta afinidade entre a clorina e a proteína. Assim, o comportamento químico dos principais componentes da CuChl e sua interação com os componentes do soro tornaram inviáveis a identificação e quantificação destas moléculas em ensaios in vivo. Os resultados aqui apresentados servem de subsídio para o desenvolvimento de outras pesquisas que visem o estudo específico da associação e dissociação da CuChl em material biológico. / Sodium copper chlorophyllin (CuChl) is a semisynthetic derivative of chlorophyll dye. It is composed chemically by several chlorins, especially copper chlorin e4 (CuCe4), copper chlorin e6 (CuCe6), and possible others no copper porphyrins and chlorins in different proportions. In addition to its use as a food coloring, CuChl may have interesting biological effects as antimutagenic, anticarcinogenic and antioxidant. Because of these potential benefits, its use as a dietary supplement is increasing. However, information on the absorption and bioavailability of CuChl is scarce. Furthermore, no studies have evaluated the impact of CuChl composition in its bioactivity and efficacy. Thus, the present study aimed to identify and chemically characterize two samples of CuChl (Sigma® and Hansen®) and the standard of CuCe6 (Frontier Scientific®). Chromatographic and spectrometric techniques as well as mimetics models membrane were used. The CuCe6/BSA interaction was also evaluated. The elemental analysis of CuChl showed that the total copper content of it was smaller that the one recommended by United States Pharmacopeia (USP). The elements (CHN) and the ratio Cu / N were not consistent with the theoretical values of the molecule CuChl. Only one CuChl sample showed Soret / Q ratio within the range recommended by USP. The acid-base titration of CuCe6 revealed two pKas values (10.62 and 6.41), which were similar for CuChl samples. The log P determination of CuCe6 showed that its hydrophobicity is maximal at pH 3 (log P = 1.49 ± 0.09) and its hydrophilicity occurs at pH> 7. These results were confirmed using the incorporation into liposomes assay in function of pH. Using HPLC, it was observed that thermal degradation of CuChl (25 to 95 °C) hardly occurred from 75 °C. The energy necessary for CuChl and CuCe6 degradation is Ea = 16.1 and 9.3 kcal/mol, respectively. The half-life at 35°C for CuChl and CuCe6 is 6 hours and 2 ½ hours, respectively. A more efficient separation of the CuChl components by HPLC was achieved using a C30 column while its major constituents CuCe6, CuCe4 and copper chlorin p6 (CuCp6) were identified by HPLC / MS-MS. In binding analysis of CuCe6 and BSA, it was observed KD = 0.38 ± 0.07 mM, KA = 3.3 ± 0.28 x 106 M-1, and number of binding sites ~ 1 (N = 0.75 ± .09), indicating high affinity between BSA and chlorine. Thus, due to the chemical characteristics of the main components of CuChl and their interaction with serum components the identification and quantification of these molecules in vivo is unviable. Future studies should investigate the association and dissociation of CuChl in biological samples.