Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les réseaux périneuronaux (PNN) sont des régulateurs clé de la plasticité et de la régénération des neurones au niveau du système nerveux central chez l’adulte. Le PNN est une matrice extracellulaire hautement organisée, qui entoure des populations spécifiques de neurones, enrichie en protéoglycanes à chondroïtine sulfate (CSPG). La chondroïtine sulfate (CS) est un polysaccharide linéaire, appartenant à la famille des glycosaminoglycanes (GAG), qui peut être sulfaté à différentes positions et donner lieu à plusieurs isoformes. Ces isoformes interagissent de manière spécifique avec de nombreuses molécules de signalisation dont la semaphorine 3A (Sema3A). Sema3A est une protéine secrétée, qui interagit avec les CS et s’accumule ainsi dans les PNN. Elle est impliquée dans la guidance des neurones sur lesquels elle agit par chemorepulsion. Les aspects structuraux et fonctionnels de l’ interaction entre Sema3A et CS sont encore mal connus, mais celle-ci pourrait être requise pour renforcer la liaison de la Sema3A avec ses récepteurs et déclencher une voie de signalisation qui aboutit à l’inhibition de la plasticité synaptique. Le but du projet est donc de caractériser biochimiquement l’interface d’interaction Sema3A-CS. Il a pour perspective d’élaborer des molécules interférant avec cette interaction qui pourraient permettre une amélioration de la plasticité neuronale après une maladie neurodégénérative ou une lésion de la moelle épinière.Pour ce faire, la Sema3A est exprimée dans un système hétérologue de cellules eucaryotes pour être purifiée. Deux formes ont été purifiées: une forme complète de 90 kDa qui reste accrochée à la surface cellulaire et une forme clivée de 65 kDa secrétée dans le milieu de culture. La Sema3A-90 interagit d’une manière sélective et avec une très haute affinité avec la CS-E (chondroitine disulfatée en position 4 et 6) et l’héparane sulfate,alors que, la forme clivée n’interagit avec aucun GAG, comme observé par résonance plasmonique de surface (SPR). Quatre sites, situés dans le domaine C-terminal de la protéine, susceptibles d’interagir avec les GAG ont été identifiés et analysés par mutagenèse. Deux d’entre eux sont impliqués dans la reconnaissance des GAG et sont nécessaires à la Sema3A pour inhiber la croissance de neurites sur des cultures de neurones issus de ganglion de la racine dorsale de rats. En parallèle, nos travaux montrent qu’un tetrasaccharide de CS-E est la taille minimale requise pour l’interaction avec la Sema 3A. Enfin, des analyses réalisées en utilisant une microbalance à cristal de quartz avec dissipation ont montré que la Sema3A pourrait réticuler les chaines de GAGs, participant ainsi à la stabilisation du réseau périneuronal. / Perineuronal nets (PNNs) are the key regulators of neuronal plasticity and regeneration in the mature central nervous system (CNS). They are a unique and highly organised extracellular matrix (ECM) structure, found around sub-population of neurons, composed mainly of chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG). Chondroitin sulfate (CS) is a linear polysaccharide belonging to glycosaminoglycans (GAGs) family. The sulphation pattern defines different types of CS, which interact with different signalling proteins including those regulating axonal outgrowth and guidance such as semaphorin 3A (Sema3A). Sema3A is a secreted chemorepulsive protein found accumulated in the PNNs through its interaction with CS. This process is believed to potentiate Sema3A signalling through plexin A1 (PlxnA1) and Neuropilin 1 (Nrp1) and regulate plasticity and regeneration. The aim of the thesis project is to characterise the interface of Sema3A- CS interaction.For this purpose, Sema3A is expressed in eukaryote cells and purified. Interestingly, two major forms were obtained: a full length Sema3A (90 kDa) which remains attached to the cell surface GAGs and a truncated form without the C-ter part (65 kDa) which is released to the culture medium. With the use of surface plasmon resonance (SPR), we observed that full length Sema3A binds selectively to CS-E (4,6-disulfated chondroitin) and heparan sulfate with a high affinity (KD in the sub pM range), while the truncated Sema3A does not bind to any GAG. Four putative GAG binding sequences were identified in the C-ter of Sema3A and mutated using site directed mutagenesis. SPR analysis then revealed that two out of these four sites are required for the binding to CS-E. The importance of these GAG-binding sequences in inhibition of neurites outgrowth of dorsal root ganglion neurons in culture was also reported, indicating thus the importance of GAG-binding in Sema3A signalling. In parallel, the minimal required sequence of Sema3A-binding of CS-E was determined as being a tetrasaccharide. The Sema3A-CS interface was thus characterized. Furthermore, quartz crystal microbalance with dissipation monitoring analysis suggested that Sema3A could crosslink GAG chains. This suggests Sema3A could be involved in stabilising the PNN network and induces mechanical changes on neuronal surface.The detail characterization of Sema3A-CS interaction may enable the design of new strategies aiming at enhancing plasticity and regeneration for neurodegenerative diseases or spinal cord injury.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les carbohydrates font partie des trois grandes classes de biopolymères présents dans la nature. Ils représentent 75% de la biomasse. Les glycosaminoglycanes font partie des carbohydrates, ils sont présents à la surface des cellules et sont responsables de la signalisation cellulaire. Ils sont importants dans de nombreux processus biologiques. Vu leur importance en biologie et en santé, il est nécessaire de comprendre leur fonctionnement. Dans cette thèse nous avons étudié deux types de tétrasaccharides de glycosaminoglycanes (chondroïtine sulfate et dermatane sulfate) avec une nouvelle méthode qui couple la spectrométrie de masse à la spectroscopie vibrationnelle (MS/IR). Nous avons montré qu’avec cette méthode la signature de l’empreinte OH fonctionne pour les glycosaminoglycanes qui présentent des groupements Coo- et des groupements sulfate contrairement aux oses simples. Cette méthode a également validé la pertinence du séquençage pour l'élucidation de profils de sulfate et la nature de l’hexuronique dans les oligosaccharides de glycosaminoglycanes. L’approche du séquençage améliore considérablement la résolution structurelle par rapport à la simple analyse spectroscopique de l'ion précurseur. Elle permet d’avoir plus d’information sur les oligosaccharides. Et pour finir nous avons proposé un protocole pour l’analyse de mélanges afin de déterminer le ratio des différents éléments présents dans le mélange / Carbohydrates are among the three major classes of biopolymers found in nature. They represent 75% of the biomass. Glycosaminoglycans are carbohydrates, they are present on the surface of cells and are responsible for cell signaling. They are important in many biological processes. Given their importance in biology and health, it is necessary to understand their mechanism. In this thesis we studied two types of glycosaminoglycan tetrasaccharides (chondroitin sulfate and dermatan sulfate) with a new method that combines mass spectrometry with vibrational spectroscopy (MS / IR). We have shown that with this method the signature of the OH-fingerprint works for glycosaminoglycans which have COO- groups and sulfate groups in contrast to simple carbohydrates. This method also validated the relevance of sequencing for the elucidation of sulfate profiles and the nature of hexuronic in oligosaccharides of glycosaminoglycans. The sequencing approach significantly improves the structural resolution compared to the simple spectroscopic analysis of the precursor ion. It provides more information on oligosaccharides. And finally we proposed a protocol for the analysis of mixtures to determine the ratio of the different elements present in the mixture

Ce travail est consacré à l'élaboration de nano-complexes polyélectrolytes (CPEs) ayant une stabilité améliorée en milieux physiologiques et à l'exemplification de leur fort potentiel d'application comme système de délivrance de (macro) molécules bioactives. Le chitosane comme polycation a été compléxé avec quatre polyanions naturels ayant différents densités de charges et groupements fonctionnels(-COO- et SO3-) à savoir l'acide hyaluronique (HYA), le chondroïtine sulfate (ChonS), le sulfate de dextrane (DS) et l'héparine (HEP). Les facteurs qui influent sur la formation et les propriétés physico-chimiques des nano-complexes chitosane-HYA ont été étudiés. Ces nanovecteurs perdent leur caractère colloïdal en milieux physiologiques. Pour améliorer leur stabilité dans ces conditions, une stratégie innovante qui implique l'ajout de zinc a été conçue. Cette stratégie de stabilisation a été démontrée comme étant polyvalente et a été étendue aux complexes polyélectrolytes (CPEs) chitosane-ChonS. Même si de cette manière une stabilité à long terme a été observée, cette stratégie reste uniquement applicable aux CPEs cationiques. Pour cette raison, une approche alternative permettant l'amélioration de la stabilité des colloïdes à charges positives ou négatives a été mise en oeuvre en concevant des nano-complexes de type coeur-couronne ternaires composés de polyacides forts c'est-à-dire de DS ou d'HEP associés au chitosane en coeur et un complexe chitosane-HYA en couronne. Tous les nano-complexes stables obtenus peuvent encapsuler le ténofovir, une molécule antirétrovirale et être fonctionnalisés par des IgAs de ciblage. En in vitro, ces nanovecteurs montrent une inhibition de l'infection des PBMC par le virus VIH-1 supérieure à l'antirétrovirale seule / This work is devoted to the elaboration of nano-polyelectrolyte complexes (PECs) systems with improved stability in physiological media and to the establishment of their high potential of applications as bioactive (macro) molecule delivery systems. Chitosan as polycation were complexed with four natural polyanions of different charged groups and densities (-COO- and SO3 - as negative charges), namely hyaluronan (HYA), chondroitin sulfate (ChonS), dextran sulfate (DS) and heparin (HEP). The factors impacting the formation and physical-chemical properties of chitosan-HYA nanocomplexes were investigated. However, these nanovectors lost their colloidal character in physiological media. To improve their colloidal stability in physiological conditions, an innovative stabilization strategy was designed, involving zinc ion. This stabilization strategy proved versatile and was extended to chitosan-ChonS PECs. Though a long-term stability was achieved, this strategy was only applicable to cationic PECs. Therefore, an alternate approach enabled the improvement of the colloidal stability in physiological media of both positive and negative colloids by designing core-shell ternary polyelectrolyte nanocomplexes composed of strong polyacid (DS or HEP)-chitosan PECs as core and a chitosan-HYA complex as shell. Furthermore, all of the stabilized nanocomplexes allowed the encapsulation of active molecules anti-retroviral drug tenofovir and surface functionalization with targeting IgAs. In vitro, these nanovectors exhibited an inhibition of infection of PBMCs by HIV-1 virus which could be superior to the free drug

La réparation endovasculaire (EVAR) est une technique minimalement invasive permettant de traiter l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) par l’entremise d’un stent- graft (SG). L’utilisation d’EVAR est actuellement limitée par de fréquentes complications liées à une guérison inadéquate autour de l’implant. Ce manque de guérison est principalement dû au type de recouvrement polymérique des SG, au milieu pro-apoptotique des AAA et à l’accès réduit aux nutriments et à l’oxygène après EVAR. L’objectif de cette thèse consistait à concevoir un revêtement bioactif permettant d’inhiber l’apoptose et stimuler la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), pour ainsi favoriser la guérison des tissus vasculaires autour des SG. La chondroïtine-4-sulfate (CS) a d’abord été choisie, car elle a été identifiée comme un médiateur important de la réparation vasculaire. Il a été démontré que la CS en solution influence directement la résistance à l’apoptose des CMLV, en plus de favoriser la différenciation myofibroblastique chez les fibroblastes. Dans le cadre de ce projet, un premier revêtement à base de CS et de collagène a été créé. Bien que le revêtement permettait d’induire une résistance à l’apoptose chez les CMLV, il se désintégrait trop rapidement dans des conditions aqueuses. Une nouvelle méthodologie a donc été adaptée afin de greffer la CS directement sur des surfaces aminées, à l’aide d’un système utilisant un carbodiimide. Dans le but d’accroître la croissance des CMLV à la surface des revêtements, le facteur de croissance de l’épiderme (EGF) a ensuite été sélectionné. En plus de ses propriétés mitogéniques et chimiotactiques, l’EGF stimule la production d’éléments de la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine. De plus, l’activation du récepteur de l’EGF inhibe également l’apoptose des CMLV. L’EGF a donc été greffé sur la CS. Le revêtement de CS+EGF a démontré une bonne uniformité et bioactivité sur des surfaces de verre aminé. iii iv Dans une 3ème étape, afin de permettre de transposer ce revêtement bioactif sur des implants, plusieurs méthodes permettant de créer des groupements d’amines primaires sur les biomatériaux polymériques comme le PET ou le ePTFE ont été étudiées. La polymérisation par plasma a été choisie pour créer le revêtement CS+EGF à la surface de PET. Une fois de plus, celui-ci a permis d’inhiber l’apoptose des CMLV, dans des conditions pro-apoptotiques, et de favoriser la croissance des cellules. Le revêtement de CS et d’EGF, déposé sur des surfaces aminées, possède des caractéristiques biologiques intéressantes et semble donc prometteur pour favoriser une meilleure guérison autour des SG. / Endovascular aneurysm repair (EVAR) is a minimally invasive technique performed to treat abdominal aortic aneurysm (AAA) through the use of a stent-graft (SG). The usage of EVAR is presently limited by postoperative complications related to an incomplete healing of the surrounding tissues. The materials currently used in SG, the pro- apoptotic phathophysiology of AAA and the limited access to nutrients and oxygen, all limit the wound healing process and proper tissue ingrowth around the implant. The main objective of this thesis was to create of a bioactive coating inhibiting cell apoptosis and increasing vascular smooth muscle cells (VSMC) growth, to promote healing of the vascular tissues surrounding SG. Chondroitin sulfate (CS) was chosen since recent findings have shown that this polysaccharide triggers key mechanisms involved in vascular repair. CS in solution was shown to inhibit apoptosis of VSMC, as well as stimulate myofibroblast differentiation. A coating of CS and collagen was first created for the purpose of this work. Although the coating was shown to increase cell resistance to apoptosis with VSMC, it was not stable enough, since it rapidly disintegrated in aqueous solutions. A new methodology was thus proposed, where CS was grafted right on aminated surfaces, through carbodiimide chemistry. Epidermal growth factor (EGF) was then chosen to increase VSMC growth on the coatings. EGF is a known mitogenic and chemotactif growth factor for VSMC. It also stimulates the production of extracellular matrix elements, such as collagen and fibronectin. The activation of EGF receptor (EGFR) also triggers various cell signalling pathways modulating VSMC resistance to apoptosis. EGF was thus grafted on CS. CS+EGF coating on aminated glassed slides was shown to be uniform and bioactive. Finally, several methodologies to produce primary amines on polymeric biomaterials, such as PET and ePTFE, were studied in order to eventually transfer the v vi coating on implants. Plasma polymerization was chosen to create the CS+EGF coating. Once again the coating was shown to decrease VSMC apoptosis, in apoptotic conditions, and favour cell growth. Overall, the CS and EGF coating on aminated surfaces possesses interesting biological features and is a promising avenue to stimulate vascular healing around SG.

La réparation endovasculaire (EVAR) est une technique minimalement invasive permettant de traiter l’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) par l’entremise d’un stent- graft (SG). L’utilisation d’EVAR est actuellement limitée par de fréquentes complications liées à une guérison inadéquate autour de l’implant. Ce manque de guérison est principalement dû au type de recouvrement polymérique des SG, au milieu pro-apoptotique des AAA et à l’accès réduit aux nutriments et à l’oxygène après EVAR. L’objectif de cette thèse consistait à concevoir un revêtement bioactif permettant d’inhiber l’apoptose et stimuler la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV), pour ainsi favoriser la guérison des tissus vasculaires autour des SG. La chondroïtine-4-sulfate (CS) a d’abord été choisie, car elle a été identifiée comme un médiateur important de la réparation vasculaire. Il a été démontré que la CS en solution influence directement la résistance à l’apoptose des CMLV, en plus de favoriser la différenciation myofibroblastique chez les fibroblastes. Dans le cadre de ce projet, un premier revêtement à base de CS et de collagène a été créé. Bien que le revêtement permettait d’induire une résistance à l’apoptose chez les CMLV, il se désintégrait trop rapidement dans des conditions aqueuses. Une nouvelle méthodologie a donc été adaptée afin de greffer la CS directement sur des surfaces aminées, à l’aide d’un système utilisant un carbodiimide. Dans le but d’accroître la croissance des CMLV à la surface des revêtements, le facteur de croissance de l’épiderme (EGF) a ensuite été sélectionné. En plus de ses propriétés mitogéniques et chimiotactiques, l’EGF stimule la production d’éléments de la matrice extracellulaire, comme le collagène et la fibronectine. De plus, l’activation du récepteur de l’EGF inhibe également l’apoptose des CMLV. L’EGF a donc été greffé sur la CS. Le revêtement de CS+EGF a démontré une bonne uniformité et bioactivité sur des surfaces de verre aminé. iii iv Dans une 3ème étape, afin de permettre de transposer ce revêtement bioactif sur des implants, plusieurs méthodes permettant de créer des groupements d’amines primaires sur les biomatériaux polymériques comme le PET ou le ePTFE ont été étudiées. La polymérisation par plasma a été choisie pour créer le revêtement CS+EGF à la surface de PET. Une fois de plus, celui-ci a permis d’inhiber l’apoptose des CMLV, dans des conditions pro-apoptotiques, et de favoriser la croissance des cellules. Le revêtement de CS et d’EGF, déposé sur des surfaces aminées, possède des caractéristiques biologiques intéressantes et semble donc prometteur pour favoriser une meilleure guérison autour des SG. / Endovascular aneurysm repair (EVAR) is a minimally invasive technique performed to treat abdominal aortic aneurysm (AAA) through the use of a stent-graft (SG). The usage of EVAR is presently limited by postoperative complications related to an incomplete healing of the surrounding tissues. The materials currently used in SG, the pro- apoptotic phathophysiology of AAA and the limited access to nutrients and oxygen, all limit the wound healing process and proper tissue ingrowth around the implant. The main objective of this thesis was to create of a bioactive coating inhibiting cell apoptosis and increasing vascular smooth muscle cells (VSMC) growth, to promote healing of the vascular tissues surrounding SG. Chondroitin sulfate (CS) was chosen since recent findings have shown that this polysaccharide triggers key mechanisms involved in vascular repair. CS in solution was shown to inhibit apoptosis of VSMC, as well as stimulate myofibroblast differentiation. A coating of CS and collagen was first created for the purpose of this work. Although the coating was shown to increase cell resistance to apoptosis with VSMC, it was not stable enough, since it rapidly disintegrated in aqueous solutions. A new methodology was thus proposed, where CS was grafted right on aminated surfaces, through carbodiimide chemistry. Epidermal growth factor (EGF) was then chosen to increase VSMC growth on the coatings. EGF is a known mitogenic and chemotactif growth factor for VSMC. It also stimulates the production of extracellular matrix elements, such as collagen and fibronectin. The activation of EGF receptor (EGFR) also triggers various cell signalling pathways modulating VSMC resistance to apoptosis. EGF was thus grafted on CS. CS+EGF coating on aminated glassed slides was shown to be uniform and bioactive. Finally, several methodologies to produce primary amines on polymeric biomaterials, such as PET and ePTFE, were studied in order to eventually transfer the v vi coating on implants. Plasma polymerization was chosen to create the CS+EGF coating. Once again the coating was shown to decrease VSMC apoptosis, in apoptotic conditions, and favour cell growth. Overall, the CS and EGF coating on aminated surfaces possesses interesting biological features and is a promising avenue to stimulate vascular healing around SG.