Development of the yolk sac of squamate reptiles (lizards and snakes) differs from other amniote lineages in the pattern of growth of extraembryonic mesoderm, which produces a cavity, the yolk cleft, within the yolk. The structure of the yolk cleft and the accompanying isolated yolk mass influence development of the allantois and chorioallantoic membrane. The yolk cleft of viviparous species of the Eugongylus group of scincid lizards is the foundation for an elaborate yolk sac placenta; development of the yolk cleft of oviparous species has not been studied. We used light microscopy to describe the yolk sac and chorioallantoic membrane in a developmental series of an oviparous member of this species group, Oligosoma lichenigerum. Topology of the extraembryonic membranes of late stage embryos differs from viviparous species as a result of differences in development of the yolk sac. The chorioallantoic membrane encircles the egg of O. lichenigerum but is confined to the embryonic hemisphere of the egg in viviparous species. Early development of the yolk cleft is similar for both modes of parity, but in contrast to viviparous species, the yolk cleft of O. lichenigerum is transformed into a tube-like structure, which fills with cells. The yolk cleft originates as extraembryonic mesoderm is diverted from the periphery of the egg into the yolk sac cavity. As a result, a bilaminar omphalopleure persists over the abembryonic surface of the yolk. The bilaminar omphalopleure is ultimately displaced by intrusion of allantoic mesoderm between ectodermal and endodermal layers. The resulting chorioallantoic membrane has a similar structure but different developmental history to the chorioallantoic membrane of the embryonic hemisphere of the egg.

Nitric oxide (NO) is an important mediator of angiogenesis and is primarily produced endogenously through the action of nitric oxide synthase (NOS). An alternate pathway for NO production is the conversion of nitrite to NO, which depends on the presence of hemoglobin (Hb) and hypoxic conditions. The angiogenic effects of topically applied sodium nitrite on two vascular beds in the ex ovo chicken embryonic model of angiogenesis were assessed. Gas barrier films were used to modulate local oxygen levels in the chorioallantoic membrane (CAM), a respiratory vascular network, and the area vasculosa (AV) on the yolk sac, a typical peripheral vascular network. The low-permeable film polyvinylidene chloride (PVDC) and highly permeable regenerated cellulose (RC) were applied to the surface of the vasculature to alter oxygen diffusion and transport and produce a local environment of low or high oxygen, respectively. Phosphorescence Quenching Microscopy (PQM) was used to verify the oxygen levels in the vascular membranes underneath the films. Following 48 hours of continuous application of sodium nitrite (330 μg/kg/day), saline, or sodium nitrite + cPTIO (a NO scavenger) (1mg/kg/day), the angiogenic response was quantified by measuring vascular density and network complexity. The PVDC film reduced CAM PO2 to 17.9±5.5 mmHg and AV PO2 to 29.5±3.6 while the RC film maintained a PO2 of 115 mmHg. At the edge of PVDC film, there was found to be a small area of transition between the nearby low and high PO2 regions. After nitrite application, significant increases in vascularity were observed in the AV under hypoxic conditions, but not normoxic conditions (p<0.03). cPTIO inhibited nitrite-induced angiogenesis and returned vascularity to levels observed with saline application. No significant changes were observed in the CAM, but a trend of reduced angiogenesis after nitrite application was observed compared to saline and saline+cPTIO. These results indicate that two highly diffusible gases, NO and O2, play important roles in the growth of new blood vessels, but in a way that appears to depend on the gas exchange function of the vascular network.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um tratamento alternativo de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos e consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, levando à transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM, do inglês Chorioallantoic Membrane) fornece acesso direto aos vasos sanguíneos, possibilitando o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia. O desenvolvimento de um tumor nesse ambiente previamente vascularizado permite o estudo e o entendimento dos mecanismos que envolvem o crescimento e destruição do tumor, levando ao aperfeiçoamento de diferentes modalidades terapêuticas. As células tumorais empregadas para o desenvolvimento do tumor podem ser de diversas linhagens e formas de aplicação, desde culturas celulares a biópsias tumorais. O objetivo principal foi investigar a terapia fotodinâmica nos vasos e nas células neoplásicas em um modelo de tumor em CAM. Com esse modelo estudado para células tumorais de melanoma e Ehrlich, foi escolhido trabalhar com tumor de Erlich pela facilidade de manuseio laboratorial. Por meio da microscopia confocal de fluorescência, foi observada a interação entre os vasos sanguíneos e as células tumorais. Com imagens por fluorescência, foi possível entender e quantificar o efeito individualizado dos fotossensibilizadores, incluindo a farmacodinâmica do Photogem&reg; e da formação da protoporfirina IX a partir do ALA, tanto com aplicação tópica como intravenosa. A partir disso, o tumor foi irradiado e os efeitos da terapia fotodinâmica foram analisados tanto no tumor quanto nos vasos sanguíneos que o alimentam. Usando ainda a curcumina, um fotossensibilizador derivado do açafrão, que sozinho possui um efeito vascular, foi aplicada a Terapia Fotodinâmica para análise na membrana corioalantóica e efeito nos vasos sanguíneos. O entendimento desse efeito da curcumina permite a ampliação de seu uso como fotossensibilizador no tratamento de câncer e doenças vasculares. Portanto, com o modelo estabelecido foi possível acompanhar os fotossensibilizadores estudados tanto nos vasos sanguíneos e sua ação, como a diferente atuação no ambiente tumoral, causando dano às células do tumor e aos vasos sanguíneos do mesmo ambiente. / Photodynamic Therapy (PDT) is a cancer treatment that has had great advances over the years and consists in the interaction between light and a photosensitizer compound, transforming the molecular oxygen in singlet oxygen, highly reactive and toxic to the cell. In this context, the use of Chorioallantoic Membrane (CAM) enables direct access to blood vessels, making possible to study the vascular effects involved in this therapy. The development of a tumor in this environment previously vascularized allows the study and the understanding of mechanisms that involves the growing and the destruction of tumor, improving different therapeutic modalities. The tumor cells used to develop the tumor in this model can be from several lines and ways of application, since cell culture to biopsy of some tumor. The main objective was investigating PDT in blood vessels and neoplasic cells in the tumor model in CAM. With this model studied for melanoma cells and Ehrlich, it was chosen to work with Ehrlich tumor because its facility of laboratory manipulation. After the observation the interaction between blood vessels and tumor cells, with confocal microscopy analysis, it was possible to understand and quantify the individualized effect of photosensitizers, including the pharmacodynamic of Photogem&reg; and the Protoporphyrin IX from Aminolevulinic acid, both topic and intravenous application. From this, the tumor was illuminated and the Photdynamic Therapy effects was analyzed both tumor and blood vessels that feeds it. Still using the curcumin, photosensitizer derivated of saffron which has alone a vascular effect, was applied PDT to analysis on the Chorioallantoic Membrane and the blood vessels effect. The understanding of this effect of curcumin enables the extension of its useful as photosensitizer in the cancer treatment and vascular diseases. Therefore, with the model established, it was possible to follow all PS studying both their action in blood vessels and in the tumor region, causing damage.

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No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Raulene_Lobo.pdf: 1126014 bytes, checksum: 21add1be01d589b0f84ebea48c02f60d (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Os ovos embrionados de codorna podem ser utilizados para inoculação de diversos tipos de vírus, por diferentes vias, assim como técnicas já conhecidas e aplicadas em ovos embrionados de galinha (Gallus domesticus) com algumas adequações. Podem ser atribuídas vantagens a esse processo, tais como: custo menor de produção, redução do tempo de incubação, necessidade de menor espaço físico e, talvez a mais importante, ser de uma espécie diferente do Gallus domesticus e desta forma não ser portadora de antígenos e anticorpos de interesse na avicultura comercial moderna, não interferindo no diagnóstico e na replicação viral. Para avaliar o potencial de replicação viral, foram utilizados 351 ovos embrionados de codorna de casca branca (Coturnix coturnix japonica) da linhagem NISSEI e amostras dos vírus que acometem aves (vírus da doença de Newcastle, vírus da varíola aviária e vírus da bronquite infecciosa das galinhas) e também em outras espécies como vírus da influenza equina. Nos ovos inoculados com o vírus de Newcastle foi coletado o liquido alantoíde para a realização do teste de HA, que apresentou melhor resultado no tempo de 72 horas com o volume de 100μl. Na inoculação do vírus da varíola aviária foram coletadas as membranas corioalantoídes para analisar as les es po e an lise histopatol gica, sendo que todos os volumes utilizados (20, 40, 80 e 100μl) apresentaram lesões características desta enfermidade. Nos vírus da bronquite infecciosa das galinhas, de todos os volumes utilizados, somente o de 40μl produziu lesões no embrião, como nanismo e enrolamento. A replicação do vírus influenza equina, assim como aconteceu com o VDN, foi dependente da concentração e o tempo de incubação, sendo o melhor tempo o intervalo de 48 horas, utilizando o volume de 40μl. Os ovos embrionados de codornas de casca branca também foram utilizados para testar a viabilidade de uso em cultivo primário de fibroblastos, sendo que os mesmos permaneceram viáveis após quatro passagens in vitro. Este modelo biológico foi eficiente para replicação do vírus da doença de Newcastle, vírus da varíola aviária, vírus da bronquite infecciosa das galinhas e vírus da influenza equina. Estes embriões se mostraram aptos também para serem utilizados em cultivo primário de fibroblastos. / Quail embryonated eggs may be used for inoculation of several viruses by different ways, like the well-known techniques used in embryonated chicken (Gallus domesticus) eggs with some light adjustments. Some advantages may be assigned to this process like: lower production costs, reduction in incubation time, no need for large spaces and, maybe the most important one, for being a different species of Gallus domesticus and so, not carrying antigens and antibodies of interest for modern commercial poultry, it does not interfere in the diagnose or in the viral replication. To assess the viral replication potential, we used a total of 351 embryonated quail eggs of white eggshell type (Coturnix coturnix japonica) NISSEI lineage and samples of virus that affect birds (Newcastle disease virus, avipoxvirus and infectious bronchitis chickens and also, some other species like the equine influenza virus.From the eggs inoculated with Newcastle virus it was collected the allantois fluid to perform HA test which presented the better result for 72 hours period and a volume of 100μl. From the inoculation with Fowl pox we collected the chorioallantoic membrane o analyze both pox lesions and for histopathological analysis, all considered volumes (20, 40, 80 e 100μl) presented the disease characteristic lesions. For the Chicken Infectious Bronchitis Virus, from all considered volumes used only the 40μl volume produced embryo lesion like dwarfism and winding. The Equine Influenza Virus replication similar to what was observed with NDV was concentration and incubation time dependent, being the best result achieved for a 48 hours interval using a 40μl volume. White Shell quail embryonated eggs were also used to test its viability for primary cultures of fibroblasts and it was verified that they remain viable after four passages in vitro. This biological model demonstrated efficient for virus replication of Newcastle Disease, Fowl Pox, infectious bronchitis chickens and for equine influenza virus. These embryos also proved suitable for use in primary fibroblasts culture.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um tratamento alternativo de câncer que vem tendo grandes avanços ao longo dos anos e consiste na interação entre luz e uma substância fotossensibilizadora, levando à transformação do oxigênio molecular em oxigênio singleto, altamente reativo e tóxico para a célula. Nesse contexto, o uso do modelo de Membrana Corioalantóica (CAM, do inglês Chorioallantoic Membrane) fornece acesso direto aos vasos sanguíneos, possibilitando o estudo dos efeitos vasculares envolvidos nessa terapia. O desenvolvimento de um tumor nesse ambiente previamente vascularizado permite o estudo e o entendimento dos mecanismos que envolvem o crescimento e destruição do tumor, levando ao aperfeiçoamento de diferentes modalidades terapêuticas. As células tumorais empregadas para o desenvolvimento do tumor podem ser de diversas linhagens e formas de aplicação, desde culturas celulares a biópsias tumorais. O objetivo principal foi investigar a terapia fotodinâmica nos vasos e nas células neoplásicas em um modelo de tumor em CAM. Com esse modelo estudado para células tumorais de melanoma e Ehrlich, foi escolhido trabalhar com tumor de Erlich pela facilidade de manuseio laboratorial. Por meio da microscopia confocal de fluorescência, foi observada a interação entre os vasos sanguíneos e as células tumorais. Com imagens por fluorescência, foi possível entender e quantificar o efeito individualizado dos fotossensibilizadores, incluindo a farmacodinâmica do Photogem&reg; e da formação da protoporfirina IX a partir do ALA, tanto com aplicação tópica como intravenosa. A partir disso, o tumor foi irradiado e os efeitos da terapia fotodinâmica foram analisados tanto no tumor quanto nos vasos sanguíneos que o alimentam. Usando ainda a curcumina, um fotossensibilizador derivado do açafrão, que sozinho possui um efeito vascular, foi aplicada a Terapia Fotodinâmica para análise na membrana corioalantóica e efeito nos vasos sanguíneos. O entendimento desse efeito da curcumina permite a ampliação de seu uso como fotossensibilizador no tratamento de câncer e doenças vasculares. Portanto, com o modelo estabelecido foi possível acompanhar os fotossensibilizadores estudados tanto nos vasos sanguíneos e sua ação, como a diferente atuação no ambiente tumoral, causando dano às células do tumor e aos vasos sanguíneos do mesmo ambiente. / Photodynamic Therapy (PDT) is a cancer treatment that has had great advances over the years and consists in the interaction between light and a photosensitizer compound, transforming the molecular oxygen in singlet oxygen, highly reactive and toxic to the cell. In this context, the use of Chorioallantoic Membrane (CAM) enables direct access to blood vessels, making possible to study the vascular effects involved in this therapy. The development of a tumor in this environment previously vascularized allows the study and the understanding of mechanisms that involves the growing and the destruction of tumor, improving different therapeutic modalities. The tumor cells used to develop the tumor in this model can be from several lines and ways of application, since cell culture to biopsy of some tumor. The main objective was investigating PDT in blood vessels and neoplasic cells in the tumor model in CAM. With this model studied for melanoma cells and Ehrlich, it was chosen to work with Ehrlich tumor because its facility of laboratory manipulation. After the observation the interaction between blood vessels and tumor cells, with confocal microscopy analysis, it was possible to understand and quantify the individualized effect of photosensitizers, including the pharmacodynamic of Photogem&reg; and the Protoporphyrin IX from Aminolevulinic acid, both topic and intravenous application. From this, the tumor was illuminated and the Photdynamic Therapy effects was analyzed both tumor and blood vessels that feeds it. Still using the curcumin, photosensitizer derivated of saffron which has alone a vascular effect, was applied PDT to analysis on the Chorioallantoic Membrane and the blood vessels effect. The understanding of this effect of curcumin enables the extension of its useful as photosensitizer in the cancer treatment and vascular diseases. Therefore, with the model established, it was possible to follow all PS studying both their action in blood vessels and in the tumor region, causing damage.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_juliana_garcia_da_silva.pdf: 2172936 bytes, checksum: 81d9a807046ac44112c2ab77f306b7bf (MD5) Previous issue date: 2012-04-26 / Neorickettsia risticii is an obligatory leukocytes intracellular parasite, the etiologic agent of Equine Monocytic Ehrlichiosis (EME), known as "Potomac Horse Fever". It was first described in 1979 in the State of Maryland, in the vicinity of the Potomac River, United States. It is a disease of great importance in the creation of horses in the southern Brazil, especially the creole s breed, presenting the diarrhea as the main symptom, which can deteriorate and lead to death or complications such as laminitis. Contamination of animals possibly occurs by the oral route, being related to digenetic trematodes of aquatic environments, which in turn require more than one host to complete its life cycle. The location of the horses in overflowed regions provides an increase in the ingestion of aquatic vectors, making higher the chances of contracting the infection, especially in the months of higher temperatures, when the EME presents its characteristic seasonal peaks of occurrence. The objectives of this study were to investigate the species of Heleobia, the first intermediate host of N. risitcii in an endemic area for EME (rural property in Arroio Grande), in order to estimate its rate of parasite contamination. We evaluated the effect of salinity on the survival of mollusk of Heleobia piscium specie, as well as its reproduction and emission frequency of cercariae. Through the cultivation of trematodes in membrane chorioallantoic of chicken eggs, we sought the adult form of the parasite housed in gastropods. The snails found during the collections were classified as Heleobia piscium, noting that 6,24%, among 962 dissected gastropods presented themselves parasitized. Cercarial output occurred in an environment with variable salinity to 12 , which indicates partially the adaptability of the species in estuarine regions. There was no satisfactory results regarding the cultivation of trematodes in chorioallantoic membrane, possibly due to the high specificity of the technique required. Several parameters have been analyzed and the outcomes represent a starting point for the establishment of a specific methodology for obtaining the adult trematode. The results presented are important for the elucidation of the biological cycle of the parasite analysed in this study, contributing to highlight the epidemiology of EME, serving as the basis for future researches that aim to minimize its impact on the creation of horses in Rio Grande do Sul. / A Neorickettsia risticii é um parasito intracelular obrigatório de leucócitos e agente etiológico da Ehrlichiose Monocítica Equina (EME), conhecida como a Febre do Cavalo de Potomac ( Potomac Horse Fever ). Foi descrita pela primeira vez em 1979 no Estado de Maryland, nos arredores do rio Potomac (EUA). É uma enfermidade de grande importância na criação de cavalos no sul do Brasil, especialmente da raça crioula, apresentando a diarréia como principal sintoma, podendo agravar-se, ocasionando a morte. A contaminação dos animais ocorre possivelmente por via oral, havendo relação com trematódeos digenéticos de ambientes aquáticos que, por sua vez, necessitam de mais de um hospedeiro para completar seu ciclo de vida. Os cavalos presentes em regiões alagadiças podem ingerir vetores aquáticos, o que aumenta as chances de infecção, principalmente nos meses de temperaturas mais elevadas, quando a EME apresenta seus característicos picos sazonais de ocorrência. Os objetivos deste estudo foram investigar as espécies de gastrópodes do gênero Heleobia, primeiro hospedeiro intermediário da N. risitcii, em área endêmica à EME (Propriedade Rural em Arroio Grande), estimar a taxa de contaminação parasitária e o efeito da salinidade na sobrevivência dos moluscos da espécie Heleobia piscium, bem como, sua reprodução e frequência de emissão de cercárias. Através do cultivo de trematódeos em membrana corioalantóide de ovos de galinha, buscou-se a forma adulta do parasita albergado nos gastrópodes. Os moluscos encontrados durante as coletas foram classificados como Heleobia piscium, constatando-se que 6,24%, dentre os 962 gastrópodes dissecados apresentaram-se parasitados. Ocorreu emissão de cercárias em local com salinidade variável até 12 , o que indica parcialmente a adaptabilidade da espécie a ambientes estuarinos. Não houve resultados satisfatórios quanto ao cultivo de trematódeos em Membrana corioalantóide, possivelmente devido à alta especificidade da técnica requerida. O conhecimento resultante representa um ponto de partida para o estabelecimento de uma metodologia específica quanto à obtenção do trematódeo adulto. Os resultados apresentados são importantes para a elucidação do ciclo biológico do parasita em estudo, contribuindo com maiores esclarecimentos sobre a epidemiologia da EME, servindo como base para futuras pesquisas que visem minimizar seu impacto na criação de cavalos no Rio Grande do Sul.

The chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos belongs to the in vivo model systems frequently used for the study of angiogenesis and cell invasiveness. Using CAM assay we have tested selected chicken sarcoma cell lines characterized by different angiogenic properties and different ability to form metastasis. In addition to CAM assay, several other methods have been used to characterize the phenotype of these cell lines. We have selected a few proteins which could significantly influence the angiogenic and metastatic properties of investigated cell lines. We have established cell lines stably overexpressing these genes and compared their phenotypes with parental cell lines. We have shown that genes encoding ISL1, ARNT2, PROM1, HOXA11 proteins participate, in our experimental model, in activation of programes controlling angiogenesis and cell invasion.

Angiogênese é a formação de novos capilares a partir de vasos pré-existentes, mediada por eventos de sinalização bioquímica que determinam proliferação, migração, diferenciação e morte celular e controlam crescimento e remodelação tecidual. A beta2-glicoproteína I (beta2GPI) é uma proteína plasmática com ação sobre a função vascular e a aterogênese. Monomêros de beta2GPI apresentam efeito anti-inflamatório e anticoagulante; a clivagem enzimática favorece sua dimerização e induz o aparecimento de efeitos opostos. Resultados anteriores mostraram que monômeros e dímeros de beta2GPI têm efeitos diferentes sobre a proliferação e a diferenciação de células endoteliais em culturas bidimensionais utilizadas como modelo de angiogênese. Os monômeros e dímeros de beta2GPI foram obtidos por purificação fracionada e caracterizada por SDS-PAGE e ELISA, como descrito. Neste trabalho, foram utilizadas culturas tridimensionais de células humanas vasculares de cordão umbilical (HUVEC) sobre Matrigel foram utilizadas para identificar efeitos de monômeros e dímeros da beta2GPI sobre a proliferação, migração e formação de estruturas de interação celular in vitro. O monômero de ?2GPI atuou como um fator de diferenciação endotelial dependente da densidade de plaqueamento, induzindo nas culturas tridimensionais de HUVECs a formação de fenótipos alongados, prolongamentos e estruturas de interação célula-célula. A fração dimérica modulou negativamente a proliferação de HUVECs. A membrana corioalantóide (CAM) de embriões de galinha foi empregada para estudar efeitos da beta2GPI sobre a angiogênese. In ovo, o dímero de beta2GPI impediu a angiogênese e induziu a morte embrionária 48h após a exposição, enquanto o monômero permitiu o desenvolvimento do embrião até o 10º dia, apesar de induzir mudanças precoces no desenvolvimento dos vasos da membrana corioalantóide. As estruturas da microvasculatura foram analisadas através de uma abordagem morfológica quantitativa, baseada na classificação de padrões binários locais (LBP). Alvos moleculares de beta2GPI relatados anteriormente foram considerados como fonte dos efeitos observados in vitro e in ovo. Os resultados obtidos suportam dados anteriores sobre a inibição da via de sinalização de anexina-2/Akt pela beta2GPI. Adicionalmente, sugere-se a via de sinalização Notch como um alvo do efeito antiangiogênico de da beta2GPI / Angiogenesis is the formation of new capillaries from pre-existing vessels, mediated by biochemical signaling events that determine proliferation, migration, differentiation and cell death, and control of tissue growth and remodeling. beta2-glycoprotein I (beta2GPI) is a plasma protein active on vascular function and atherogenesis. ?2GPI monomers present anti-inflammatory and anticoagulant effects. Enzymatic cleavage favors beta2GPI dimerization and induces the appearance of opposing effects. Previous results have shown that beta2GPI monomers and dimers induce different effects upon the proliferation and differentiation of endothelial cells in two-dimensional cultures used as an angiogenesis model. beta2GPI monomers and dimers were obtained by fractioned purification and characterized by SDS-PAGE and ELISA, as described. In this work, three-dimensional Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) cultures on Matrigel were used to investigate the effects of beta2GPI monomers and dimers upon proliferation, migration and in vitro formation of cellular interaction structures. The beta2GPI monomer performed as a density-dependent endothelial differentiation factor, inducing the formation of elongated phenotypes, membrane extensions and cell-cell interaction structures in three-dimensional HUVEC cultures; the dimeric fraction negatively modulated the proliferation and differentiation of HUVECs. The chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos was employed to study the effects of beta2GPI upon angiogenesis. In ovo, the beta2GPI dimer prevented angiogenesis and induced embryonic death after 48h exposure, while the monomer allowed embryo development up to the 10th day, despite it induced early changes in the development of chorioallantoic membrane vessels. Microvasculature structures were evaluated through a quantitative morphology approach, based on local binary pattern classification. Previously reported molecular beta2GPI targets were then considered as the source of the observed effects in vitro and in ovo. The obtained results support previous data on the inhibition of the annexin-2/Akt signaling pathway by beta2GPI. Additionally, the Notch signaling pathway is suggested as a target of the antiangiogenic effect of beta2GPI

Angiogênese é a formação de novos capilares a partir de vasos pré-existentes, mediada por eventos de sinalização bioquímica que determinam proliferação, migração, diferenciação e morte celular e controlam crescimento e remodelação tecidual. A beta2-glicoproteína I (beta2GPI) é uma proteína plasmática com ação sobre a função vascular e a aterogênese. Monomêros de beta2GPI apresentam efeito anti-inflamatório e anticoagulante; a clivagem enzimática favorece sua dimerização e induz o aparecimento de efeitos opostos. Resultados anteriores mostraram que monômeros e dímeros de beta2GPI têm efeitos diferentes sobre a proliferação e a diferenciação de células endoteliais em culturas bidimensionais utilizadas como modelo de angiogênese. Os monômeros e dímeros de beta2GPI foram obtidos por purificação fracionada e caracterizada por SDS-PAGE e ELISA, como descrito. Neste trabalho, foram utilizadas culturas tridimensionais de células humanas vasculares de cordão umbilical (HUVEC) sobre Matrigel foram utilizadas para identificar efeitos de monômeros e dímeros da beta2GPI sobre a proliferação, migração e formação de estruturas de interação celular in vitro. O monômero de ?2GPI atuou como um fator de diferenciação endotelial dependente da densidade de plaqueamento, induzindo nas culturas tridimensionais de HUVECs a formação de fenótipos alongados, prolongamentos e estruturas de interação célula-célula. A fração dimérica modulou negativamente a proliferação de HUVECs. A membrana corioalantóide (CAM) de embriões de galinha foi empregada para estudar efeitos da beta2GPI sobre a angiogênese. In ovo, o dímero de beta2GPI impediu a angiogênese e induziu a morte embrionária 48h após a exposição, enquanto o monômero permitiu o desenvolvimento do embrião até o 10º dia, apesar de induzir mudanças precoces no desenvolvimento dos vasos da membrana corioalantóide. As estruturas da microvasculatura foram analisadas através de uma abordagem morfológica quantitativa, baseada na classificação de padrões binários locais (LBP). Alvos moleculares de beta2GPI relatados anteriormente foram considerados como fonte dos efeitos observados in vitro e in ovo. Os resultados obtidos suportam dados anteriores sobre a inibição da via de sinalização de anexina-2/Akt pela beta2GPI. Adicionalmente, sugere-se a via de sinalização Notch como um alvo do efeito antiangiogênico de da beta2GPI / Angiogenesis is the formation of new capillaries from pre-existing vessels, mediated by biochemical signaling events that determine proliferation, migration, differentiation and cell death, and control of tissue growth and remodeling. beta2-glycoprotein I (beta2GPI) is a plasma protein active on vascular function and atherogenesis. ?2GPI monomers present anti-inflammatory and anticoagulant effects. Enzymatic cleavage favors beta2GPI dimerization and induces the appearance of opposing effects. Previous results have shown that beta2GPI monomers and dimers induce different effects upon the proliferation and differentiation of endothelial cells in two-dimensional cultures used as an angiogenesis model. beta2GPI monomers and dimers were obtained by fractioned purification and characterized by SDS-PAGE and ELISA, as described. In this work, three-dimensional Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) cultures on Matrigel were used to investigate the effects of beta2GPI monomers and dimers upon proliferation, migration and in vitro formation of cellular interaction structures. The beta2GPI monomer performed as a density-dependent endothelial differentiation factor, inducing the formation of elongated phenotypes, membrane extensions and cell-cell interaction structures in three-dimensional HUVEC cultures; the dimeric fraction negatively modulated the proliferation and differentiation of HUVECs. The chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos was employed to study the effects of beta2GPI upon angiogenesis. In ovo, the beta2GPI dimer prevented angiogenesis and induced embryonic death after 48h exposure, while the monomer allowed embryo development up to the 10th day, despite it induced early changes in the development of chorioallantoic membrane vessels. Microvasculature structures were evaluated through a quantitative morphology approach, based on local binary pattern classification. Previously reported molecular beta2GPI targets were then considered as the source of the observed effects in vitro and in ovo. The obtained results support previous data on the inhibition of the annexin-2/Akt signaling pathway by beta2GPI. Additionally, the Notch signaling pathway is suggested as a target of the antiangiogenic effect of beta2GPI