Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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De nouvelles méthodes de détection et de quantification du VX (O-éthyl S–(2(diisopropylamino)éthyl) (méthylphosphonothioate)) dans le plasma par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS) ont été développées. Après avoir été mise en œuvre en milieu HBSS (rendement > 99%), la méthode d'extraction liquide-liquide de notre composé d'intérêt nous permet d'obtenir en milieu plasmatique un rendement de soixante-cinq pour cent (65%). Cette méthode d'extraction permet d'évaluer la présence de VX dans de très faibles volumes d'échantillons de plasma (entre 20 et 1000 µL), donc dans des volumes compatibles avec des expérimentations sur de petits rongeurs. Cette extraction est suivie d'une analyse par LC-MS/MS en phase 100% organique. Des limites de détection de 0,15 et 0,5 pg/mL (pour 5 µL injecté) sont obtenues respectivement avec l'utilisation de la colonne Allure Biphényl (Restek) et Lux Cellulose-1 (Phenomenex). Afin d'étudier la toxicocinétique des énantiomères du VX dans le plasma, nos recherches se sont ensuite focalisées sur la séparation de ces derniers. Des résultats prometteurs ont été obtenus en utilisant une colonne Lux cellulose-2 (Phenomenex). / Innovative analytical methods have been developed to detect and quantify the organophosphorus nerve agent, VX (O-ethyl S–(2(diisopropylamino)ethyl) (methylphosphonothioate)), in plasma using liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS) technique. Liquid-liquid extraction of VX from HBSS environment was achieved with excellent yields (> 99%). Next, extraction from plasma was performed and generated a recovery rate of approximately sixty-five percent (65%). Our distinctive extraction methodology was implemented to evaluate the presence of VX in very small quantities of plasma (between 20 to 1000 µL) as in small rodents' experiments. It was followed by an LC-MS/MS analysis in a 100% organic phase. A Lux Cellulose-1 column (Phenomenex) and an Allure biphenyl column (Restek) were tested with detection limit at 0.15 pg/mL and 0.5 pg/mL in plasma (5 µL injected), respectively. Finally, our study was focused on the separation of VX enantiomers and hopeful results were provided using a Lux cellulose-2 column (Phenomenex).

En recherche clinique ou environnementale, les biomarqueurs protéiques présentent un intérêt croissant. Bien que les immuno-dosages restent les méthodes de référence pour leur quantification, les récentes avancées en spectrométrie de masse (MS) font de cette technique une alternative crédible à l'ELISA. Ce travail apporte quelques éléments méthodologiques pour repousser certaines limitations de la MS. D'abord, deux dosages ont été proposés. Celui réalisé chez G. fossarum représente le premier exemple de dosage de la Vitellogénine chez un invertébré par LC-MS/MS. L'un des défis de la méthode présentée est de doser spécifiquement une protéine dans un organisme dont le génome est majoritairement inconnu. Le second dosage concerne les peptides contenant une méthionine. Nous avons développé un protocole d'oxydation des méthionines afin de s'affranchir du biais lié à leur oxydation partielle. Cette méthode a ensuite été appliquée à une protéine impliquée dans la maladie d'Alzheimer (l'Apolipoprotéine E4) dans une cohorte de 673 plasmas. Ce dosage est à ce jour l'une des plus grandes études réalisées par LC-MS/MS et montre toute la robustesse de cette approche. Enfin, l'influence de la phase mobile sur la sensibilité des dosages de peptides a été étudiée : d'abord en phase inverse, où le méthanol est une bonne alternative à l'acétonitrile ; ensuite en HILIC, où les difficultés liées à l'étude d'ions multichargés en milieu majoritairement organique ont été abordées. Les problèmes liés à la capacité de charge des colonnes ont également été soulevés. La chromatographie HILIC reste prometteuse pour la quantification de peptides puisqu'un facteur dix en sensibilité peut être apporté.

Depuis plusieurs années, des mortalités anormalement élevées sont observées chez les abeilles, au niveau mondial. Plusieurs facteurs peuvent être à l’origine de ces phénomènes, dont l’utilisation de pesticides. Parmi ceux-ci, les insecticides de la famille des neonicotinoides et des pyrethrinoides ainsi que certains fongicides de la famille des carboxamides sont mis en cause. Les travaux présentés dans ce manuscrit sont consacrés au développement de méthodes analytiques pour l’identification, la détection et la quantification de 13 pesticides et leurs métabolites dans les abeilles et les produits de la ruche tels que le pain d’abeille et la cire d’abeille. Dans un premier temps, une méthode originale par dSPE a été développée pour l’extraction des pesticides cibles dans la cire d’abeille. Combinée à une méthode d’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse triple quadripole (UPLC-MS/MS), elle permet d’atteindre des limites de quantification jamais atteintes auparavant en multi-familles sur cette matrice complexe, comprises entre 1 et 40 ng.g-1. L’application de cette méthode sur des cires ainsi que l’analyse d’autres matrices apicoles fournis par des apiculteurs (au total 488 échantillons dont 125 abeilles, 87 cires et 276 pains d’abeille) ont montré une large présence de ces pesticides dans les ruchers français. Globalement, la cire d’abeille est la matrice présentant les plus fortes concentrations et le pain d’abeille est la matrice la plus contaminée en termes de nombre de pesticides présents. Une seconde partie des travaux est dédiée à la détection et à l’identification des métabolites de pesticides générés par des expérimentations in vitro et in vivo. Pour cela, une stratégie analytique, basée sur la complémentarité entre la spectrométrie de masse à temps de vol et triple quadripole, a été mise en place. La première permet l’identification des métabolites par la combinaison de la recherche de métabolites connus et de profils isotopiques spécifiques (Cl, Br, S). La seconde permet leur détection et leur quantification dans des échantillons d’abeille. Cette double approche a notamment permis d’identifier 9 métabolites de pesticides et 5 marqueurs d’exposition. Des métabolites et marqueurs d’exposition au boscalide (carboxamide), principalement issus de réactions d’hydroxylation, deshalogenation et substitution, ont été synthétisés. Ces derniers ont ensuite été détectés et quantifiés dans des échantillons d’abeilles issus de ruchers symptomatiques. Les développements analytiques et résultats permettent, d’une part, de faire un état des lieux de la présence de pesticides jugés préoccupants dans les ruchers français. D’autre part, ils fournissent aux écotoxicologues des données permettant de mieux comprendre les modes d’action des pesticides chez les abeilles / For several years, abnormally high mortalities have been observed in bees worldwide. Several factors may be responsible for these phenomena, including the use of pesti-cides. Among these, insecticides of the family of neonicotinoids and pyrethroids as well as some fungicides of the carboxamide family are implicated. The work presented is devoted to the development of analytical methods for the identification, detection and quantification of 13 pesticides and their metabolites in bees and hive products such as beebread and beeswax.Initially, an original dSPE method was developed for the extraction of targeted pesti-cides in beeswax. Combined with a liquid chromatographic analysis method coupled to triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS), it allows to reach limits of quantification never reached before in multi-families analysis on this complex matrix, between 1 and 40 ng.g-1.The application of this method to beeswaxes and the analysis of other beekeeping matrices provided by beekeepers (a total of 488 samples including 125 bees, 87 bees-waxes and 276 honeybees) showed a wide presence of these pesticides in french apiar-ies. Overall, beeswax is the matrix with the highest concentrations and beebread is the most contaminated matrix in terms of number of pesticides present.A second part of the work is devoted to the detection and identification of pesticide metabolites generated by in vitro and in vivo experiments. For this, an analytical strategy, based on the complementarity between time-of-flight and triple-quadrupole mass spectrometry, has been put in place. The first allows the identification of me-tabolites by combining the search for known metabolites and specific isotopic profiles (Cl, Br, S). The second allows their detection and quantification in bee samples.This dual approach has identified 9 pesticide metabolites and 5 markers of exposure. Metabolites and markers of exposure to boscalid (carboxamide), mainly derived from hydroxylation, dehalogenation and substitution reactions, have been synthesized. These were then detected and quantified in bee samples from symptomatic apiaries.These analytical developments and results make it possible, on the one hand, to make an inventory of the presence of pesticides of concern in french apiaries. On the other hand, they provide ecotoxicologists with data to better understand the behavior of pesticides in bees

Ces travaux mettent en avant le développement de méthodes analytiques afin d'évaluer l'Exposome selon différentes stratégies. Une méthode multirésidus sélective permettant l'analyse d'additifs plastiques et de leurs produits de dégradation pouvant être relargués par des emballages plastiques dans les boissons et les aliments, et ainsi être ingérés par l'Homme, a tout d'abord été mise au point. Cette méthode consiste en une extraction de type Stir Bar Sorptive Extraction sur des barreaux à base de dérivés de polydiméthylsiloxane des additifs plastiques ciblés, suivie d'une analyse par chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem de type triple quadripôle. Afin de détecter et quantifier une plus large gamme de contaminants entrant en contact avec l'Homme, une méthode de screening a été développée par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution avec un instrument de type QqToF, à partir d'une matrice urinaire. La méthode de screening ciblé, validée selon les recommandations FDA, a permis de quantifier des contaminants appartenant à diverses familles dans l'urine, sans préparation préalable de l'échantillon, à des concentrations de l'ordre du ng/mL. Appliquée à des urines de volontaires, la méthode de screening non ciblé a permis d'émettre de nombreuses hypothèses d'identification de composés après fragmentation MS/MS. La mise en place de tels outils pour caractériser l'Exposome, associée à des études statistiques et bio-informatiques, contribueront grandement à la compréhension des relations de causalité entre les maladies humaines et les facteurs environnementaux / These research works highlight the development of analytical methods, based on mass spectrometry, to assess the Exposome according to different strategies. A selective multiresidue method for the analysis of plastic additives and their degradation products that may be released by plastic packaging in food and beverages and thus ingested by man was developed. This method consists of a Stir Bar Sorptive Extraction with bars covered by polydimethylsiloxane derivatives, followed by an analysis by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry with a triple quadrupole instrument. To detect and quantify a wide range of contaminants in contact with man in daily routine, a screening method was developed by liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry with a quadrupole-time-of-flight instrument from urinary matrix. The targeted screening method validated according to FDA guidelines allows the quantification of contaminants classified according to different families, in urine without sample preparation, at concentrations of the order of ng.mL-1. This method was applied to volunteers’ urine samples. The non-targeted screening method allows issuing numerous assumptions of compound identification after MS/MS fragmentation. The implementation of this tool to measure the Exposome associated with statistical studies, contribute greatly to the understanding of the causal relationships between diseases and environmental factors

La présente étude s’inscrit dans le contexte post-Fukushima et avait pour objectif la mise en place d’une méthode d’analyse pour identifier et quantifier, rapidement, des radionucléides émetteurs alpha et bêta, en situation post-accidentelle, dans les échantillons de l’environnement. La première étape de l’étude a permis de dresser la liste des radio-isotopes émetteurs alpha et bêta susceptibles d’être rejetés dans l’environnement suite à un accident nucléaire. Dans une deuxième étape, un protocole d’analyse rapide a été développé pour 17 radio-isotopes de U, Th, Pu, Am, Np et Sr. L’objectif était d’automatiser l’étape de séparation radiochimique et de la coupler à la mesure. La séparation est réalisée en employant des colonnes contenant les résines d’extraction, TEVA®, TRU et Sr. La mesure est effectuée par ICP-MS (spectrométrie de masse à plasma induit) et dans certains cas par compteur proportionnel à gaz pour quantifier le radiostrontium (89Sr et 90Sr). D’excellentes performances analytiques ont été obtenues, lors de la mesure hors-ligne, pour des échantillons d’eaux (robinet, rivière et mer) et solides (sols et filtres d’aérosols), après une minéralisation par four à micro-ondes ou par fusion alcaline suivie d’une co-précipitation avec Ca3(PO4)2. Ces performances sont caractérisées par des rendements de récupération compris entre 70 % et 100 % et des écarts types entre 5 % et 10 %. Le protocole de séparation a été ensuite automatisé et transposé en mode couplage en ligne avec l’ICP-MS. Les paramètres opératoires ont été optimisés avec un plan d’expériences, défini et exploité avec le logiciel Minitab®. Après optimisation du protocole, l’automatisation et le couplage de la séparation permettent de quantifier rapidement, en 1,5 h par échantillon, U, Th, Pu, Am, Np et Sr et de gagner un facteur 20 sur les limites de détection des radio-isotopes artificiels. / The present study follows the Fukushima power plant accident and aimed to develop an analytical method to achieve, during an emergency situation, a rapid identification and quantification of alpha and beta emitters in environmental samples. The first step of this study allowed us to list the alpha and beta emitters which can be released in the environment in case of a nuclear accident. The second step aimed towards the development of a rapid analysis method to quantify 17 radionuclides of U, Th, Pu, Am, Np and Sr. The main objective was the automation of the radiochemical separation step and its coupling for the measurement. The separation is performed using columns containing extraction resins, namely TEVA®, TRU and Sr. The measurement is performed using an ICP-MS (inductively coupled plasma mass spectrometry) and in some cases a gas proportional counter to quantify radiostrontium (89Sr and 90Sr). Excellent figures of merit were obtained, off line, with water (tap, river and sea water) and solid matrices (soil and aerosol filters), after a micro-wave digestion or an alkaline fusion dissolution followed by a Ca3(PO4)2 coprecipitation. The proposed analytical strategy showed yields between 70 % and 100 % and standard deviations between 5 % and 10 %. The newly developed separation method was then automated and coupled on-line to ICP-MS. The operating parameters were optimized using a design of experiments and the results were processed with Minitab®. The optimized automated separation coupled on-line to the ICP-MS allows the rapid quantification, in 1.5 h per sample, of U, Th, Pu, Am, Np and Sr with detection limits gain as high as 20 times for artificial radionuclides.

Le travail présenté ici s'est penché sur les problèmes rencontrés sur ce type d'études protéomiques, et sur les solutions qui peuvent être explorées pour améliorer le débit d'évaluation des candidats biomarqueurs. Les peptides à méthionine sont généralement évités en raison de leur sensibilité à l'oxydation. Cependant, il semblait intéressant d'étudier leur modification endogène pouvant affecter les processus biologiques. Une première évaluation de l'impact de l'oxydation des apolipoproteins dans le cas de la maladie d'Alzheimer, a permis de mettre de côté ce biomarqueur potentiel, et de faire apparaître un certain nombre de problèmes liés au prélèvement et au stockage des échantillons biologiques. L'évaluation de dispositifs DBS (Dried Blood Spot) et Vivid à partir d'un panel de 32 protéines sanguines a permis de fournir une première solution envisageable pour maîtriser ces problèmes. Par la suite, un nouveau mode de quantification des peptides appelé MRM3 a été utilisé pour dépasser la complexité de la matrice biologique, et fournir une évaluation fiable des niveaux de concentration de 2 protéines plasmatiques, la C-Reactive protein et la TIMP-1, ainsi que 2 protéines urinaires, l'aquaporin-2 et la podocin. Pour améliorer la sensibilité d'analyse et réduire les coûts de solvants nécessaires aux analyses, l'évaluation d'une plate-forme de micro-chromatographie a été réalisée par comparaison à une plate-forme narrow-bore. Cette étude a permis de mettre en évidence l'impact important de l'effet matrice sur le processus analytique, nécessitant de développer de nouvelles stratégies de travail. Enfin, afin de réduire la complexité de l'échantillon, l'évaluation de cartouches d'extraction en phase solide à base de large taille de pores a été réalisé, et un protocole développé a permis d'analyser avec succès des enzymes contenus dans un échantillon de lessive commerciale. De plus, la durée nécessaire à la préparation d'échantillons biologiques a pu être fortement réduite en combinant une digestion rapide assistée par température combinée au dessalage en ligne, afin de permettre l'analyse quantitative des protéines qu'il contient seulement quelques heures après son arrivée au laboratoire / Over the past decade, interest in the use of biomarkers in clinical studies has greatly increased. Quantification of a candidate protein biomarker in complex samples (eg. plasma) requires targeted and multiplexed assays. Immunoassays are the gold standard for their quantification. However, with the need for targeted and multiplexed methods, recent developments in mass spectrometry (MS) make a viable alternative to ELISA. The present work has addressed the problems encountered in this type of proteomic studies, and solutions that can be explored to improve the workflow of candidate biomarker’s evaluation. Methionine peptides are generally avoided due to their susceptibility to oxidation. However, it seemed interesting to study how their endogenous modifications could affect biological processes. In a first time, apolipoproteins were dismissed as a potential biomarker of Alzheimer’s disease due to oxidation impact. In the same time, problems associated with biological sample collection and storage were highlighted. DBS (Dried Blood Spot) and Vivid device evaluation from a panel of 32 blood proteins has provided a first possible solution to overcome these troubles. Thereafter, a new peptide quantification method called MRM3 was used to overcome biological matrix complexity. Reliable level determinations of 2 plasma proteins (C-Reactive protein and TIMP-1) and 2 urinary proteins (aquaporin-2 and podocin) were obtained. To improve sensitivity and reduce analysis solvent costs, performances of a micro chromatography platform were compared to a narrow-bore platform. This study highlighted the significant impact of the matrix effect on the analytical process, requiring new strategie development. Finally, to reduce sample complexity, evaluation of wide pore solid-phase extraction cartridges has been achieved. A protocol was successfully developed to analyze enzymes contained in commercial laundry samples. Finally to optimize biological sample preparation time, heated-assisted digestion and online desalting step were successfully associated. Only few hours were then required for quantitative analysis

Différentes techniques de chromatographie liquide des polymères ont été étudiées selon leur principe d’élution et le comportement conformationnel des polymères suscité au sein de la phase stationnaire. De part leur capacité à caractériser des copolymères à blocs, la Chromatographie Liquide aux Conditions Critiques (LC CC) et la Chromatographie Liquide aux Conditions Limites de Désorption (LC LCD) ont été utilisées pour déterminer la composition chimique de copolymères à blocs à base de poly(oxyde d’éthylène) et de polystyrène. La LC LCD s’est distinguée par sa capacité à séparer de manière efficace les copolymères à blocs de leurs homopolymères parents. Cette méthode chromatographique a ensuite été optimisée afin d’être appliquée à une plus large gamme de masses molaires. / Several advanced techniques of liquid chromatography of polymers were studied according to their elution principle and the conformational behaviour of polymers along the stationary phase. Because of their potential to characterize block copolymers, Liquid Chromatography under Critical Conditions (LC CC) and Liquid Chromatography under Limiting Conditions of Desorption (LC LCD) were employed to determine the chemical composition of Poly(ethylene oxide) and Polystyrene based block copolymers. Interestingly, LC LCD was proved to be particularly efficiently to separate block copolymers from both their parent homopolymers. LC LCD method was then optimized to extend the applicable molar masses ranges.