L'utilisation excessive d'agents antifongiques, aggravée par la pénurie de nouveaux médicaments introduits sur le marché, provoque l'accumulation de phénotypes de multi-résistance de nombreuses souches fongiques. Dans ce contexte alarmant, le développement de nouvelles molécules alternatives aux agents antifongiques conventionnels constitue un enjeu majeur de santé publique afin de prévenir l’émergence de nouvelles résistances fongiques pour limiter les problèmes socio-économiques. Dans ce contexte, la cateslytine (CTL), un peptide naturel issu de la maturation endogène de la chromogranine A, et déjà décrit comme un agent antimicrobien efficace contre de nombreux agents pathogènes, dont Candida albicans, présente un intérêt particulier. Dans la présente étude, nous avons ainsi comparé l'activité antimicrobienne de deux conformations de CTL, L-CTL et D-CTL contre différentes souches de Candida. Nos résultats démontrent que D-CTL est l'agent antifongique le plus efficace et le plus sûr. De plus, contrairement à L-CTL, D-CTL n'est pas dégradé par les protéases sécrétées par Candida albicans et est également stable dans la salive. La vidéo-microscopie révèle une invasion rapide de Candida albicans par D-CTL, et démontre l’importance de la division cellulaire pour la propagation de D-CTL d'une cellule mère à une cellule fille. La microscopie électronique en transmission permet d’illustrer la perméabilisation de la membrane fongique induite par les deux peptides. Enfin, nos résultats révèlent un effet antifongique additif de la combinaison entre D-CTL et le voriconazole, un agent antifongique de référence dans le traitement des infections liées à Candida. En conclusion, D-CTL peut être considéré comme un agent antifongique efficace, sûr et stable et pourrait être utilisé seul ou en association avec le voriconazole pour traiter les infections orales liées à Candida et servir dans le futur à l’élaboration de biomatériaux actifs. / The excessive use of antifungal agents, compounded by the shortage of new drugs being introduced into the market, is causing the accumulation of multi-resistance phenotypes in many fungal strains. Consequently, new alternative molecules to conventional antifungal agents are urgently needed to prevent the emergence of fungal resistance. In this context, Cateslytin (CTL), a natural peptide derived from the processing of Chromogranin A, has already been described as an effective antimicrobial agent against several pathogens including Candida albicans. In the present study, we compared the antimicrobial activity of two conformations of CTL, L-CTL and D-CTL against various strains of Candida. Our results show that D-CTL was the most efficient and safe antifungal agent. Moreover, in contrast to L-CTL,D-CTL was not degraded by proteases secreted by Candida albicans and was also stable in saliva. Using video-microscopy, we also demonstrated that D-CTL can rapidly enter Candida albicans, but is unable to spread within a yeast colony unless from a mother cell to a daughter cell during cellular division. Besides, transmission electron microscopy illustrated the permeabilization of the fungal membrane induced by both peptides. Finally, we revealed that the antifungal activity of D-CTL could be synergized by voriconazole, an antifungal of reference in the treatment of Candida related infections. In conclusion, D-CTL can be considered as an effective, safe and stable antifungal and could be used alone or in a combination therapy with voriconazole to treat Candida associated infections including oral candidosis.

Les peptides antimicrobiens (PAMs) représentent des composants importants de l`immunité innée. Ils sont présents dans la plupart des organismes multicellulaires et constituent la première ligne de défense contre les infections. Ils possèdent un large éventail d`activités, une non-toxicité contre les cellules de l`hôte et des effets synergiques avec les antibiotiques conventionnels. Par conséquent, ils peuvent être d`excellents candidats dans le développement de nouveaux antibiotiques pour lutter contre la résistance de microorganismes. Concernant les PAMs dérivés de la chromogranine A (CgA), la cateslytine (Ctl) présente des activités antimicrobiennes directes et des propriétés immunomodulatrices. Dans ma thèse, j`ai cherché à caractériser l`épipeptide D-Ctl, où tous les résidus en conformation-L ont été remplacés par des résidus en conformation-D. Tout d`abord, la stabilité dans les surnageants bactériens et des dosages de l`activité antimicrobienne ont été réalisés, ainsi que l`analyse de viabilité des cellules et des dosages des cytokines libérées par les cellules immunitaires. L`efficacité de D-Ctl a été comparée à celle de L-Ctl contre des souches bactériennes, puis les CMIs ont été déterminées et comparées dans le cas de combinaisons avec des antibiotiques conventionnels, afin de montrer un effet synergique et/ou additif. De plus, D-Ctl ne déclenche pas de résistance chez E. coli. Des tests de cytotoxicité ont été effectués sur plusieurs types de lignées cellulaires et de PBMCs. Les effets inflammatoires aussi ont été testés. Ensuite, le modèle bactérien E. coli MDR a été utilisé pour des analyses physico-chimiques, telles que la microscopie à épifluorescence, la spectroscopie ATR-FTIR et la microscopie à force atomique. Enfin, le brevet D-Ctl a été déposé en 2016 sous le numéro EP 16306539.4 « Nouveau peptide de cateslytine en conformation D ». En conclusion, D-Ctl est capable de tuer rapidement un large spectre de micro-organismes, et il pourrait potentialiser l`effet antimicrobien de plusieurs antibiotiques. / Antimicrobial peptides (AMPs) represent important components of innate immunity. They are present in most multicellular organisms and constitute the first line of defense against infections. They exhibit a large spectrum of activities, a non-toxicity against host cells and synergistic effects with conventional antibiotics. Therefore, they can be as excellent candidates in the development of new antibiotics to fight pathogens resistance. Concerning to AMPs derived from chromogranin A (CgA), Cateslytin (Ctl) represents a new antibiotic, which displays direct antimicrobial activities and immunomodulatory properties. In my thesis, I aimed to characterize the epipeptide D-Ctl, where all (L-conformation) residues were replaced by (D-conformation) residues. Firstly, antimicrobial assays were performed, cells viability, immune assays, and the stability in bacterial supernatant was tested. The efficiency of D-Ctl was compared with L-Ctl against bacterial strains, then MICs were determined and compared with combinations in presence of classical antibiotics in order to show synergistic or/and additive effect. Moreover, D-Ctl does not trigger resistance in E. coli. Also, cytotoxicity assays were performed on several types of cell line and PBMCs. Inflammatory effects were tested too. Then, bacterial model E. coli MDR was used for physicochemical analysis such as epifluorescence microscopy, ATR-FTIR spectroscopy and atomic force microscopy. Finally, D-Ctl patent has been deposited in 2016 under the number EP 16306539.4 “New D-configured cateslytin peptide”. To conclude: D-Ctl is able to rapidly kill a broad spectrum of microorganisms, and it could potentiate the antimicrobial effect of several antibiotics.

Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d'infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l'intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d'un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l'interaction bactérie-peptide analysée. L'étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d'antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l'implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l'activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l'O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l'activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés.

Les premières souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont connues depuis 70 ans et se sont multipliées ces dernières années posant un grave problème de santé publique. Parmi les nombreux types d’infections induites par ces bactéries, nous nous sommes intéressés aux infections intestinales qui peuvent dégénérer en maladies inflammatoires de l’intestin et cancers. Notre travail de thèse a consisté à proposer des outils thérapeutiques dans le traitement des pathologies intestinales infectieuses : des peptides antimicrobiens dérivés de la chromogranine A et des extraits de plantes de la médecine traditionnelle béninoise. La chromogranine A est une protéine libérée par les cellules nerveuses, neuroendocrines et immunitaires au cours d’un stress et maturée en peptides. Des peptides actifs contre quatre souches bactériennes pathogènes (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei et Vibrio cholera non O1) ont été identifiés et l’interaction bactérie-peptide analysée. L’étude de la combinaison peptide-antibiotique montre que la cateslytine permet de réduire les doses d’antibiotiques nécessaires. Ensuite, nous avons étudié l’implication de deux peptides sur un modèle de cellules neuroendocrines, les cellules BON. La chromofungine provoque la stimulation des cellules BON en induisant un influx de calcium extracellulaire, tandis que la catestatine est capable de bloquer l’activité de la chromofungine.Après un screening des extraits de 14 plantes du Bénin, nous avons isolé deux molécules, la sinensétine et l’O-tétraméthyléther scutellaréine, responsables de l’activité antibactérienne de Chromolaena odorata contre les pathogènes étudiés. / The first bacterial strains resistant to antibiotics appeared 70 years ago and have proliferated in recent years causing a serious public health problem. Such bacteria are responsible of several types of infections including intestinal infections with chronic inflammatory bowel diseases and cancers. This work consisted of proposing new therapeutic tools in the treatment of intestinal pathologies. In this context, we have studied antimicrobial peptides derived from chromogranin A and plant extracts used in Beninese traditional medicine for the treatment of such diseases. Chromogranin A is a protein produced by nervous, endocrine and immune cells during a stress and processed to generate biologically active peptides. We identified antimicrobial peptides, active against four pathogenic bacterial strains (Klebsiella oxytoca, Salmonella enterica, Shigella sonnei and Vibrio cholera non O1) and analyzed the bacteria-peptide interactions. Moreover, the study of the peptide-antibiotic combination shows that cateslytin is useful for reducing doses of antibiotic drugs. In addition of this work, we have studied the effects of two peptides derived from chromogranin A on neuroendocrine cells with model of BON cells. Chromofungin stimules BON cells by inducing an influx of extracellular calcium, whereas catestatin is able to block chromofungin’s activity.With plant extracts, after a screening on 14 plants from Benin, our works enabled us to isolate two active molecules, sinensetin and O-tetramethylether scutellarein, responsible of the antimicrobial activity of Chromolaena odorata against the studied pathogenic strains.

Les cellules neuroendocrines possèdent d’une part la voie de sécrétion constitutive, existant dans tous les types cellulaires, qui permet le renouvellement continu de la membrane plasmique et de la matrice extracellulaire, et d’autre part la voie de sécrétion régulée, spécifique aux cellules sécrétrices, qui permet la sécrétion d’hormones suite à la stimulation de la cellule. Les organites impliqués dans cette dernière voie sont des granules de sécrétion à cœur dense (GS), sui stockent les hormones ainsi que les glycoprotéines solubles, les granines. Parmi ces dernières, la chromogranine A (CgA) joue un rôle majeur dans la biogénèse des GS mais les mécanismes moléculaires ne sont pas clairement définis. Dans une lignée de cellules non-endocrines COS7 (dépourvues de granines et donc de voie de sécrétion régulée), mon équipe d’accueil a démontré que l’expression de la CgA induit la formation de vésicules présentant une structure et des fonctions caractéristiques des GS. L’analyse du protéome des GS purifiés à partir d’une lignée de cellules COS7 exprimant de manière stable la CgA (COS7-CgA) a révélé la présence de protéines liant les éléments du cytosquelette et le calcium. Durant ma thèse, nous avons focalisé notre attention sur la myosine 1b (myo1b), l’actine et le complexe de nucléation de l’actine Arp2/3 du fait de leur capacité à induire le bourgeonnement de compartiments post-golgiens dans des cellules non-endocrines. Nous avons montré (i) que la myo1b contrôle la formation des GS ainsi que la sécrétion régulée au sein des cellules COS7-CgA et des cellules neuroendocriniennes PC12, et (ii) que la myo1b et le complexe Arp2/3 permettent le recrutement d’actine fibrillaire dans la région golgienne et la formation des GS. Ces travaux montrent pour la première fois l’implication du complexe actomyosine dans la formation des GS. Afin d’identifier le lien moléculaire entre la CgA luminale et la myo1b cytosolique, nous avons recherché les interactions potentielles de la CgA avec les lipides de la membrane du réseau trans-golgien (TGN). Nous avons montré (i) que la CgA interagit avec l’acide phosphatidique (PA), (ii) que les espèces de PA prédominantes sont communes dans les membranes golgienne et granulaire, (iii) que la CgA est capable d’interagir spécifiquement avec des espèces de PA intégrées avec des membranes artificielles et (iv) que l’inhibition de la production du PA au niveau golgien altère significativement la formation des GS et la sécrétion régulée dans les cellules neuroendocrines. L’ensemble des résultats obtenus dans le cadre de ma thèse suggère que l’interaction entre la CgA et le PA est cruciale pour la biogenèse de GS à partir de la membrane du TGN. Nous émettons l’hypothèse que cette interaction est à l’origine de la formation de microdomaines enrichis en PA qui contrôleraient la courbure de la membrane du TGN et le recrutement du complexe actomyosine. / Neuroendocrine cells exhibit the constitutive secretory pathway which is common all cell types and allows the continuous renewal of the plasma membrane and the extracellular matrix, and the regulated secretory pathway, which is specific to secretory cells and allows hormone secretion following cell stimulation. The organelles supporting the latter pathway are dense-core secretory granules (SG), which store hormones and soluble glycoproteins, called granins. Among these, chromogranin A (CgA) plays a major role in the biogenesis of SG but the molecular mechanisms underlying this process are not clearly understood. Using non-endocrine COS7 cell line (which are devoid of granins and regulated secretory pathway), my host team has demonstrated that the CgA expression induces the formation of vesicles with structural and functional characteristic of SG. The proteome analysis of purified SG from a COS7 cell line stably expressing CgA (COS7-CgA) revealed the presence of cytoskeleton- and calcium-binding proteins. During my thesis, we focused our attention on myosin 1b (myo1b), actin and actin nucleation complex Arp2/3 due to their ability to induce the budding of post-Golgi compartments in non-endocrine cells. We have shown (i) that myo1b controls SG formation as welle as the regulated secretion in COS7-CgA and PC12 neuroendocrine cells, (ii) that myo1b and Arp2/3 complex are required to recruit fibrillar actin (F-actin) to the Golgi region and to SG formation. These results highlight for the first time the involvement of the actomyosin complex in SG formation. In order to identify the molecular link between luminal CgA and Cytosolic myo1b, we investigated the potential interactions of CgA with lipids of the trans-Golgi network (TGN) membrane. We showed (i) that CgA interacts with phosphatidic acid (PA), (ii) that the predominant PA species are common in Golgi and granular membranes, (iii) that Cg Ais able to interact specifically with these PA species included in artificial membranes, and (iv) that inhibition of PA production at the Golgi level significantly alters SG formation and regulated secretion in neuroendocrine cells. All these results obtained during my thesis suggest that the interaction between CgA and PA is crucial for SG biogenesis from the TGN membrane. We suggest that this interaction is at the origin of the formation of PA-enriched microdomains that could control the curvature of the TGN membrane and the recruitment of the actomyosin complex.