Plants contain a host of secondary metabolites that may be of dietary use to man. A comprehensive approach to plant-based nutrition would include investigating all aspects of a nutrient, from creation through storage and consumption. Here, experiments address each of these facets for a group of important antioxidant and pigment compounds, the carotenoids. The carotenoid biosynthetic pathway regulatory mechanisms leading to lycopene accumulation are well defined in the model fruit, tomato. Those leading to accumulation of other carotenoids and flesh colors, however, are poorly understood. The variety of flesh colors available in watermelon fruit (red, orange, salmon yellow, and canary yellow) makes it an ideal candidate for investigating the regulation of the full pathway. Carotenoid accumulation was measured in ten watermelon varieties, representing the four flesh colors and three ploidy levels, throughout fruit maturation. It was found that the putative regulatory mechanisms controlling lycopene accumulation in red-fleshed fruit may be applied in a generalized fashion to each flesh color in respect to the major carotenoid accumulated at maturity. Additionally, triploid varieties were generally found to have higher accumulation levels than diploids, and tetraploids were intermediate to both. In addition to total carotenoid content, many factors are important in determining perceived benefit. Several of these factors involve components of the food matrix, cellular and subcellular species-specific characteristics of the food which act as barriers to nutrient release. Cell size, cell wall, and chromoplast (the carotenoid storage organelle) characteristics were observed in nine fruits and vegetables using light and transmission electron microscopy. Watermelon, tomato, and melon have the largest cells. Sweet potato, butternut squash, carrot, and mango have the most fibrous cell walls; mango and papaya additionally had the thickest walls. Chromoplast globular, tubular, crystalline, and membranous substructures were described for each food. These food matrix factors may be related to differences in carotenoid bioaccessibility between food sources. An in vitro digestion experiment was used to determine carotenoid bioaccessibility for each of these foods. Per serving, grapefruit yielded the most lycopene while carrot gave the most ?-carotene, ?-carotene, lutein, and phytoene, and mango proved a good source of violaxanthin.

La maturation des fruits est un processus complexe, principalement régulé par l'hormone végétal éthylène, qui entraîne d'importants changements métaboliques et physiologiques, ayant pour résultat la dispersion des graines. Le changement le plus visible qui se produit pendant la maturation des fruits est le changement de couleur. L'organite responsable de ce phénomène est le chromoplaste, lieu d’accumulation des caroténoïdes. Toutefois, ce n'est pas son unique rôle. Il a été montré qu’il est aussi impliqué dans la biosynthèse des lipides, de l’amidon, des vitamines et des arômes. Parce que la plupart des protéines (95%) qui composent le protéome du chromoplaste sont codées par le noyau, l’approche génomique n'est pas suffisante pour connaître les fonctions de chromoplaste dans la synthèse des métabolites d'intérêt. La protéomique de haut débit associée à la bio- nformatique a été utilisée pour caractériser le chromoplaste de tomate. L’analyse du protéome de chromoplastes de fruits de tomate rouges a révélé la présence de 988 protéines correspondantes à 802 unigènes d’Arabidopsis, dont 209 n’ont pas été répertoriés jusqu'à présent dans des banques de données plastidiales. Ces données ont révélé plusieurs caractéristiques du chromoplaste. Les protéines du métabolisme des lipides et de trafic sont bien représentées, y compris toutes les protéines de la voie de la lipoxygénase nécessaire à la synthèse des arômes volatiles dérivés de lipides. Les protéines impliquées dans la synthèse de l'amidon coexistent avec plusieurs protéines qui dégradent l'amidon. Les chromoplastes ne contiennent plus les protéines de biosynthèse de la chlorophylle mais contiennent des protéines impliquées dans la dégradation de la chlorophylle. Aucun des protéines impliquées dans le mécanisme de transport thylacoïdal n’ont été trouvées. Étonnamment, les chromoplastes contiennent l'ensemble des protéines du cycle de Calvin, y compris la Rubisco, ainsi que la voie des pentoses phosphates (OxPPP). L'analyse de l'évolution du transcriptome des gènes codant pour des protéines chromoplastiques a été réalisée. Ces données ont confirmé la réduction de la photosynthèse et le maintien du cycle de Calvin, ainsi que la biosynthèse de l'amidon et des lipides. Des analyses biochimiques complémentaires ont montré dans des chromoplastes isolés la présence d’une activité de deux enzymes importantes dans la biosynthèse des arômes (lipoxygénase et l'alcool déshydrogénase). Par ailleurs, à l’aide du couplage de protéines à la GFP et à leur expression dans des protoplastes, nous avons montré que des protéines ne présentant pas de peptide signal peuvent être localisées dans le chromoplaste. Enfin, un protocole d'isolement des plastes de fruits de tomate à différents stades de maturation a été mis au point et les fractions plastidiales ainsi obtenues ont été caractérisées par la microscopie confocale à balayage laser. La transition du chloroplaste à chromoplaste est un processus qui n'a jamais été décrit par la protéomique. Ce travail est en cours et devrait répondre à certaines questions concernant les changements qui ont lieu dans l'organite, et apporter des informations nouvelles pour la compréhension de la maturation des fruits. / Fruit ripening is a complex process, mainly regulated by the fruit hormone ethylene, resulting in significant metabolic and physiological changes, having as outcome seed dispersal. The most flagrant change taking place during ripening is the change in color. The organelle responsible for this is the chromoplast, the place of carotenoids accumulation. However this is not its unique role. It was found to be involved in lipid, starch, vitamins and aroma biosynthesis. Due to the fact that most proteins (95%) composing the chromoplast are codified by the nucleus knowledge on gene expression and genome sequences is not useful in the investigation of the functions of chromoplast in the synthesis of the metabolites of interest. High- hroughput proteomics associated with bio-informatics was used to characterize the tomato chromoplast and to reveal its intimate structure. Analysis of the proteome of red fruit chromoplasts revealed the presence of 988 proteins corresponding to 802 Arabidopsis unigenes, among which 209 had not been listed so far in plastidial data banks. These data revealed several features of the chromoplast. Proteins of lipid metabolism and trafficking were well represented, including all the proteins of the lipoxygenase pathway required for the synthesis of lipid-derived aroma volatiles. Proteins involved in starch synthesis co- xisted with several starch-degrading proteins and starch excess proteins. Chromoplasts lacked proteins of the chlorophyll biosynthesis branch and contained proteins involved in chlorophyll degradation. None of the proteins involved in the thylakoid transport machinery were discovered. Surprisingly, chromoplasts contain the entire set of Calvin cycle proteins including Rubisco, as well as the oxidative pentose phosphate pathway (OxPPP). The analysis of the evolution of the transcriptome of chromoplastic protein-encoding genes was performed. This data confirmed the reduction of the photosynthesis and the maintenance of the Calvin cycle, and of the lipid and starch biosynthesis. Further analysis is performed showing the activity of two important actors in the aroma biosynthesis (lipoxygenase and alcohol dehydrogenase). Several proteins with possible chromoplastic location were coupled with the GFP and expressed in the single cell system. A protocol for isolating tomato fruit chloroplasts and immature chromoplasts was described along with the characterization of the plastidial fractions by confocal microscopy. The transition of the chloroplast to chromoplast is a process that was never described by means of proteomics. This work answers some questions regarding the changes that take place in the organelle, and brings novel information for the understanding of fruit ripening process

L'un des phénomènes les plus importants survenus pendant la maturation du fruit de tomate est le changement de couleur du vert au rouge. Ce changement a lieu dans les plastes et correspond à la différenciation des plastes photosynthétiques, les chloroplastes, en plastes non-photosynthétiques qui accumulent des caroténoïdes, les chromoplastes. Dans cette thèse, nous présentons d'abord une introduction bibliographique sur le domaine de la transition chloroplaste-chromoplaste, en décrivant les modifications structurales et physiologiques qui se produisent pendant la transition. Puis, dans le premier chapitre, nous présentons des observations microscopiques de plastes isolés à trois stades de mûrissement, puis des enregistrements en temps réel de la fluorescence des pigments sur les tranches de fruits de tomate. Il a été possible de montrer que la transition chloroplaste-chromoplaste était synchrone pour tous les plastes d'une seule cellule et que tous les chromoplastes proviennent de chloroplastes préexistants. Dans le deuxième chapitre, une approche protéomique quantitative de la transition chloroplaste-chromoplaste est présentée, pour identifier les protéines différentiellement exprimées. Le traitement des données a identifié 1932 protéines parmi lesquelles 1529 ont été quantifiées par spectrométrie de masse. Les procédures de quantification ont ensuite été validées par WESTERN blot de certaines protéines. La chromoplastogénèse comprend les changements métaboliques suivants : diminution de l'abondance des protéines de réaction à la lumière et du métabolisme des glucide, et l'augmentation de la biosynthèse des terpénoïdes et des protéines de stress. Ces changements sont couplés à la rupture de la biogenèse des thylakoïdes, des photosystèmes et des composants de production d'énergie, et l'arrêt de la division des plastes. Dans le dernier chapitre nous avons utilisé la lincomycine, un inhibiteur spécifique de la traduction à l'intérieur des plastes, afin d'étudier les effets sur la maturation des fruits et sur l'expression de gènes nucléaires impliqués dans la maturation. Les résultats préliminaires indiquent que l'inhibition de la traduction des protéines dans les plastes affecte la maturation du fruit en réduisant l'accumulation de caroténoides. L'expression de plusieurs gènes nucléaires a été modifiée mais une relation claire avec le phénotype altéré de maturation n'a pas pu être établie. Au total, notre travail donne de nouveaux aperçus sur le processus de différenciation chromoplaste et fournit des données nouvelles ressources sur le protéome plaste / One of the most important phenomenons occurring during tomato fruit ripening is the color change from green to red. This change takes place in the plastids and corresponds to the differentiation of photosynthetic plastids, chloroplasts, into non photosynthetic plastids that accumulate carotenoids, chromoplasts. In this thesis we first present a bibliographic introduction reviewing the state of the art in the field of chloroplast to chromoplast transition and describing the structural and physiological changes occurring during the transition. Then, in the first chapter we present an in situ real-time recording of pigment fluorescence on live tomato fruit slices at three ripening stages. By viewing individual plastids it was possible to show that the chloroplast to chromoplast transition was synchronous for all plastids of a single cell and that all chromoplasts derived from pre-existing chloroplasts. In chapter two, a quantitative proteomic approach of the chloroplast-to-chromoplast transition is presented that identifies differentially expressed proteins. Stringent curation and processing of the data identified 1932 proteins among which 1529 were quantified by spectral counting. The quantification procedures have been subsequently validated by immune-blot evaluation of some proteins. Chromoplastogenesis appears to comprise major metabolic shifts (decrease in abundance of proteins of light reactions and carbohydrate metabolism and increase in terpenoid biosynthesis and stress-related protein) that are coupled to the disruption of the thylakoid and photosystems biogenesis machinery, elevated energy production components and loss of plastid division machinery. In the last chapter, we have used lincomycin, a specific inhibitor of protein translation within the plastids, in order to study the effects on fruit ripening and on the expression of some ripening-related nuclear genes. Preliminary results indicate that inhibiting protein translation in the plastids affects fruit ripening by reducing the accumulation of carotenoids. The expression of several nuclear genes has been affected but a clear relationship with the altered ripening phenotype could not be established. Altogether, our work gives new insights on the chromoplast differentiation process and provides novel resource data on the plastid proteome

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