Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-17T19:02:33Z No. of bitstreams: 1 AlmirSouzaESilvaNeto_TESE.pdf: 7594512 bytes, checksum: e73e4bac15af98e3446fb9a14895033b (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-02-17T21:29:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AlmirSouzaESilvaNeto_TESE.pdf: 7594512 bytes, checksum: e73e4bac15af98e3446fb9a14895033b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T21:29:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlmirSouzaESilvaNeto_TESE.pdf: 7594512 bytes, checksum: e73e4bac15af98e3446fb9a14895033b (MD5) Previous issue date: 2016-08-22 / Nos dias atuais observa-se um grande avan?o na ?rea aeroespacial, em sistema de telemetria, sensoriamento remoto, sistemas de radar (rastreamento e monitora??o), sistemas de comunica??es via sat?lite e novas tecnologias de comunica??es de voz e dados. As antenas de microfita cada vez mais t?m sido utilizadas devido as suas caracter?sticas e vantagens. Dessa forma, este trabalho apresenta an?lises, simula??es e medi??es de antenas de microfitas para aplica??o em: redes locais sem fio WLAN (Wireless Local Area Network) com opera??o em 2,4 GHz; tecnologia de quarta gera??o 4G para o uso em 2,5 GHz; tecnologia de quinta gera??o 5G nas frequ?ncias de 28 GHz e 60 GHz; aplica??es em UWB (Ultra Wide Band) com bandas de rejei??o utilizando ressoadores de anel partido; sat?lites com opera??o na banda Ku e aplica??o em telemetria utilizando estruturas cil?ndricas operando na faixa de 2 a 4 GHz, na banda S. Foram feitas an?lises com aplica??o de estrutura EBG (Electromagnetic Band Gap) no substrato e no plano de terra, utiliza??o de substrato metamaterial, aplica??o de estruturas DGS (Defected Ground Strutures) no plano de terra e arranjos, com objetivo de obter melhoria nos par?metros, em especial ganho e largura de banda. O m?todo de an?lise das antenas de microfita utilizado neste trabalho foi o m?todo de Linha de Transmiss?o Transversa. Os resultados simulados foram obtidos atrav?s do software comercial Ansoft HFSS. Compara??es entre os resultados simulados e medidos das antenas propostas foram realizados para efeito de valida??o dos prot?tipos. Ao final, s?o apresentadas sugest?es para a continuidade deste trabalho. / Nowadays there has been a major breakthrough in aerospace, in telemetry system, remote sensing, radar systems (tracking and monitoring), satellite communications systems and new technologies for voice and data communications. The microstrip antennas have increasingly been used due to their characteristics and advantages. Thus, this work presents analysis, simulations and measurements of microstrip antenna for use in: wireless local area networks WLAN (Wireless Local Area Network) with operation at 2.4 GHz; fourth generation 4G technology for use in 2.5 GHz; fifth-generation technology 5G at frequencies of 28 GHz and 60 GHz; applications in UWB (Ultra Wide Band) with rejection bands using resonators party ring; satellites operating in the Ku band and application in telemetry using cylindrical structures operating at 2 to 4 GHz band, the S band. Analysis were made with application of EBG structure (Electromagnetic Band Gap) on substrate and in the ground plane, using substrate metamaterial, application DGS structures (Defected Ground Structures) in the ground plane and arrangements, in order to achieve improvement in the parameters, in particular gain and bandwidth. The method of analysis of microstrip antennas used in this work was the Transverse Transmission Line method. The simulated results were obtained by Ansoft HFSS commercial software. Comparisons between simulated and measured results of the antennas proposals were made for effect of validation of the prototypes. Suggestions are made for the continuity of this work.

Quality Monitor is application, which automatically analyzes software projects forquality and makes quality assessment reports. This thesis project aims to instantiate Quality Monitor for a large real-world .Net project and to extend Quality Monitor by considering other data sources than just source code. This extended analysis scope includes bug reports, features, and time reports besides .Net assemblies (code) as artifacts. Different tools were investigated for the analysis of code, bug reports, features and time reports. The analysis of .Net assemblies was implemented as none of the existing tools under evaluation met all requirements. The analysis of .Net assemblies was successfully completed; it allows the extraction data necessary for creating Call and Control Flow graphs. These graphs are used for calculating additional metrics allowing for an improved assessment of quality of the project. Implementation of .Net assembly reader was tested using large real world industrial project. Other data sources were analyzed theoretically, but excluded for further implementation. Altogether the thesis includes an analysis of possible Quality Monitor extensions including their requirements, design, and (partially) their implementation and evaluation.

Des mutations du gène STK11 furent initialement décrites comme responsable du syndrome Peutz-Jeghers, dont la gravité est lliée à une incidence accrue d’apparition de tumeurs. Le produit de ce gène, la sérine/thréonine kinase LKB1, a une expression ou une activité catalytique réduite, voir perdue, consécutivement à des mutations somatiques dans plusieurs types de cancer mais principalement du poumon (30% des NSCLC). Cette kinase est considérée de ce fait comme un suppresseur de tumeur d’importance. Les mécanismes moléculaires responsables de sa propriété suppresseur de tumeur restent à identifier. En effet, alors que sa fonction dans le métabolisme cellulaire, au travers de l’activation de la kinase AMPK, fut longtemps privilégiée, elle est actuellement remise en cause au profit de sa fonction de régulatrice de la signalisation Wnt canonique. Mes travaux de thèse confortent cette éventualité dans le cas des tumeurs pulmonaires (NSCLC). En effet, parmi les deux complexes fonctionnels que forme LKB1 avec les pseudokinases STRADα ou β, mes résultats démontrent que seul celui impliquant STRADβ intervient dans la régulation de la voie Wnt. Pour cela, le complexe LKB1/STRADβ se localise au niveau du cil primaire et participe à l’activation de la kinase MARK3. Ces résultats, étayés par un modèle murin invalidé pour STRADβ ainsi que l’analyse, a posteriori, de bases de données transcriptomiques adossées aux données cliniques de patients atteints de NSCLC, suggèrent que l’activité suppresseur de tumeur de LKB1 est associée à sa localisation et à sa fonction au niveau du cil primaire en participant à l’activation de MARK3 et à la régulation de la signalisation Wnt canonique. / STK11 gene mutations were originally identified as responsible for the Peutz-Jeghers syndrome of which severity is mainly related to an increase incidence of tumor development. The product of this gene the serine/threonine kinase LKB1 gets its activity or its expression reduced, sometimes even lost, following somatic mutations in several types of cancer such as pancreas, liver but mainly from lung. Indeed, almost 30% of non-small cell lung carcinoma (NSCLC) does not express anymore or only an inactive form, has led to consider this kinase as tumor suppressor of importance. While there is no doubt of the involvement of its catalytic activity molecular mechanisms responsible for its tumor suppressor properties remain to be identified. Indeed, whereas its function as regulator of cellular metabolism through AMPK has been favor for a while, it is currently re-assess to benefit to its regulator function on canonical Wnt signaling. My thesis work, reinforce this eventuality in NSCLC. Indeed, among the two functional complexes formed by LKB1 through its association with STRADα or β pseudokinases, my results show that only the complex related to STRADβ is involved in the canonical Wnt pathway regulation. For that, LKB1/STRADβ complex localizes at primary cilia and participates to MARK3 kinase activation. These results strengthened by a STRADβ knockout mouse model and an a posteriori transcriptomic analysis of lung adenocarcinoma patient datasets related to their clinical records, suggest that LKB1 tumour suppressor activity is associated with its localization and its function at primary cilia participating in the activation of MARK3 and thus regulation of canonical Wnt signaling.

Pendant le développement du cervelet, les progéniteurs des neurones granulaires (PNG) nécessitent la présence du cil primaire pour proliférer en réponse à Sonic Hedgehog (SHH). En effet, la prolifération dérégulée des PNGs peut conduire à la formation d'une tumeur pédiatrique maligne appelée SHH-médulloblastome (MB), de ce fait comprendre comment le cil primaire est régulé dans les PNGs est crucial.Nous montrons que le facteur de transcription Atoh1 contrôle la présence du cil primaire dans les PNGs in vitro et in vivo. En particulier, la suppression du cil primaire par l’inactivation génétique de gènes impliqués dans la ciliogenèse (par exemple, Kif3a ou Ift88) empêche Atoh1 de maintenir les PNGs en prolifération, ce qui indique qu’Atoh1 favorise l’expansion des PNGs en maintenant la présence du cil primaire. D’un point de vue moléculaire, Atoh1 contrôle la formation du cil primaire en régulant le bon positionnement peri-centrosomal des satellites centriolaires (SC), complexes protéiques essentiels pour la ciliogenèse. L'inactivation de Atoh1 dans les PNGs perturbe en effet la distribution subcellulaire des SCs, altérant ainsi inévitablement la ciliogenèse. Cette nouvelle fonction de Atoh1 est gouvernée par la régulation transcriptionnelle directe d'un composant clé des SCs, Cep131. L’expression ectopique de Cep131 dans les PNGs restore les effets liés à l'inactivation d'Atoh1, rétablissant la localisation correcte du SC et comme conséquence la présence d’un cil primaire.De plus, nous avons montré que cette voie Atoh1-SC-cil primaire-SHH contrôlant la prolifération des PNGs est également conservée dans le contexte du SHH-MB, où Atoh1 est surexprimée et essentielle pour sa formation et sa maintenance.Ces données révèlent un mécanisme par lequel la ciliogenèse est régulée dans des progéniteurs de neurones, offrant de nouvelles informations sur la neurogenèse dans le cervelet et sur la pathogenèse du SHH-MB. / Cerebellar granule neuron progenitors (GNPs) require the primary cilium to proliferate in response to Sonic Hedgehog (SHH) during cerebellar development. As aberrant proliferation of GNPs may lead to SHH-type medulloblastoma (SHH-MB), a pediatric brain tumor, understanding which mechanisms control ciliogenesis in GNPs represents a major interest in the field. Here, we show that the proneural bHLH transcription factor Atoh1 controls the presence of primary cilia in GNPs both in vitro and in vivo, thus maintaining GNPs responsive to the mitogenic effects of SHH. Indeed, loss of primary cilia induced via knockdown of specific ciliary components (e.g. Kif3a and Ift88) abolishes the ability of Atoh1 to keep GNPs in proliferation in vivo. Mechanistically, Atoh1 controls ciliogenesis by regulating the proper peri-centrosomal clustering of centriolar satellites (CS), large multiprotein complexes working as essential machineries for ciliogenesis. Knockdown of Atoh1 in GNPs perturbs CS subcellular distribution, leading to impairment of ciliogenesis. Luciferase reporter assays and chromatin immunoprecipitation experiments indicate that Atoh1 can directly regulate the expression of Cep131, a key CS core component. Importantly, ectopic expression of Cep131 in GNPs depleted of Atoh1, is sufficient to restore proper CS localization and consequent primary cilia formation, indicating that the Atoh1-Cep131-CS axis is responsible for ciliogenesis in GNPs.In addition, we further demonstrated that these functions of Atoh1 are conserved in the context of SHH-MB, where Atoh1 is typically overexpressed and acts as a lineage-dependent transcription factor.These data reveal a mechanism whereby ciliogenesis is regulated in neuron progenitors providing novel insights into cerebellar neurogenesis and pathogenesis of SHH-MB.

Les centrosomes sont de petits organites qui régulent divers processus cellulaires comme la polarité ou la mitose dans les cellules de mammifères. Ils sont composés de deux centrioles entourés par une matrice péricentriolaire. Ces centrosomes sont les principaux centres organisateurs de microtubules. De plus, ils favorisent la formation de cils, des protubérances sur la surface des cellules quiescentes qui sont critiques pour la transduction du signal. Une grande variété de maladies humaines telles que les cancers ou les ciliopathies sont liées à un mauvais fonctionnement des centrosomes et des cils. C’est pourquoi le but de mes projets de recherche est de comprendre les mécanismes nécessaires à la biogénèse et au fonctionnement des centrosomes et des cils. Tout d'abord, j’ai caractérisé une nouvelle protéine centrosomale nommée nephrocystine - 5 (NPHP5). Cette protéine est localisée dans les cellules en interphase au niveau de la région distale des centrioles. Sa déplétion inhibe la migration des centrosomes à la surface cellulaire lors de l’étape précoce de la formation des cils. NPHP5 interagit avec la protéine CEP290 via sa région C-terminale qui est essentielle pour la ciliogenèse. Elle interagit également avec la calmoduline ce qui empêche son auto-agrégation. J’ai démontré que les domaines de liaison de NHPH5 à CEP290 et à la calmoduline, ainsi que son domaine de localisation centrosomale sont séparables. De plus, j’ai démontré que les protéines NPHP5 présentant des mutations pathogènes ne peuvent plus interagir avec CEP290 et ne sont plus localisées aux centrosomes, rendant ainsi ces protéines non fonctionnelles. Enfin, en utilisant une approche pharmacologique pour moduler les événements en aval dans la voie ciliogénique, j’ai montré que la formation des cils peut être restaurée même en absence de NPHP5. D’autre part, j’ai étudié le rôle de NPHP5 dans l'assemblage et le trafic du complexe BBSome dans le cil. Le BBSome est composé de huit sous-unités différentes qui s’assemblent en un complexe fonctionnel dont on sait peu de chose sur la régulation spatiotemporelle de son processus d'assemblage. J’ai précédemment montré que NPHP5 favorisait la formation des cils et que son dysfonctionnement contribuait au développement de néphronophtise (NPHP). Bien que la NPHP et le syndrome de Bardet-Biedl (BBS) soient des ciliopathies qui partagent des caractéristiques cliniques communes, la base moléculaire de ces ressemblances phénotypiques n’est pas comprise. J’ai constaté que NPHP5, localisé à la base du cil, contient deux sites de liaison distincts pour le BBSome. De plus, j’ai démontré que NPHP5 et son partenaire CEP290 interagissent de façon dynamique avec le BBSome pendant la transition de la prolifération à la quiescence. La déplétion de NPHP5 ou CEP290 conduit à la dissociation d’au moins deux sous-unités du BBSome formant alors un sous-complexe dont la capacité de migration dans le cil n’est pas compromise. J’ai montré que le transport des cargos vers le compartiment ciliaire par ce sous-complexe n’est que partiellement altéré. Enfin, j’ai également concentré mes recherches sur une autre protéine centrosomale peu caractérisée. La protéine centrosomale de 76 kDa (Cep76) a été précédemment impliquée dans le maintien d’une duplication unique des centrioles par cycle cellulaire, et dans une interaction avec la kinase cycline-dépendante 2 (CDK2). Cep76 est préférentiellement phosphorylée par le complexe cycline A/CDK2 sur le site unique S83. Cet événement est essentiel pour supprimer l'amplification des centrioles en phase S. J’ai démontré que Cep76 inhibe cette amplification en bloquant la phosphorylation de Plk1 au niveau des centrosomes. D’autre part, Cep76 peut être acétylée au site K279 en phase G2, ce qui régule négativement son activité et sa phosphorylation sur le site S83. Ces études permettent d'améliorer notre compréhension de la biologie des centrosomes et des cils et pourraient conduire au développement de nouvelles applications diagnostiques et thérapeutiques. / Centrosomes are small organelles that regulate diverse cellular processes such as polarity or mitosis in mammalian cells. They are composed of two centrioles surrounded by a pericentriolar matrix. These centrosomes are the major microtubule organizing centers. Moreover, they promote the formation of cilia, protrusions on the surface of quiescent cells that are critical for signal transduction. A wide variety of human diseases such as cancers or ciliopathies are linked to a malfunction of centrosomes and cilia. Therefore the aim of my research is to understand the mechanisms necessary for the biogenesis and function of centrosomes and cilia. First, I have characterized a novel centrosomal protein called nephrocystin - 5 (NPHP5). This protein is localized, in interphase cells, in the distal region of centrioles. Its depletion inhibits the migration of centrosomes to the cell surface during the early stage of cilia formation. NPHP5 interacts with CEP290 via its C-terminal region that is essential for ciliogenesis. It also interacts with calmodulin, which prevents its self-aggregation. I have demonstrated that the Cep290- and CaM-binding domains as well as the centrosomal localization domain of NPHP5 are separable. Moreover, I have shown that NPHP5 proteins with pathogenic mutations can no longer interact with CEP290 and are not localized to centrosomes, rendering these proteins non-functional. Finally, using a pharmacological approach to modulate the downstream events in the ciliogenic pathway, I showed that cilia formation can be restored even without NPHP5. On the other hand, I studied the role of NPHP5 in the assembly and trafficking of the BBSome into the cilium. The BBSome consists of eight different subunits that assemble into a functional complex of which little is known about the spatiotemporal regulation of its assembly process. I have previously shown that NPHP5 favored the formation of cilia and its dysfunction contributes to the development of nephronophthisis (NPHP). Although the NPHP and BBS syndrome (BBS) are ciliopathies that share common clinical features, molecular basis of these phenotypic similarities is not understood. I found that NPHP5, located at the base of the cilium, contains two separate binding sites for BBSome. Furthermore, I demonstrated that NPHP5 and his partner CEP290 interact dynamically with the BBSome during the transition from quiescence to proliferation. Depletion NPHP5 or CEP290 leads to the dissociation of at least two subunits of BBSome forming a sub-complex that can still traffic into the cilium. I have shown that the transport of cargo to the ciliary compartment through this sub-complex is only partially altered. Finally, I have also focused my research on another centrosomal protein poorly characterized. The centrosomal protein of 76 kDa (Cep76) was previously involved in the maintenance of a single duplication of centrioles per cell cycle, and interacts with the cyclindependent kinase 2 (CDK2). Cep76 is preferentially phosphorylated by cyclin A/CDK2 on the single site S83. This event is essential to suppress centrioles amplification in S phase. I have demonstrated that Cep76 inhibits amplification by blocking the phosphorylation of Plk1 at the centrosome. Moreover, Cep76 can be acetylated at the K279 site in G2 phase, which negatively regulates its activity and phosphorylation on the site S83. These studies will improve our understanding of the biology of centrosomes and cilia and could lead to development of new diagnostic and therapeutic applications.

La protéine RFX3 appartient à une famille de facteurs de transcription RFX (Regulatory Factor X) très conservée au cours de l'évolution. Avec plusieurs autres membres de cette famille, RFX3 est impliquée dans la régulation de l'expression de gènes nécessaires pour l'assemblage et la fonction des cils. L’objectif de mon travail de thèse a été de comprendre le rôle du facteur de transcription RFX3 au cours du développement du poumon de la souris. RFX3 est exprimée dès le début du développement pulmonaire dans les cellules du mésenchyme et de l'épithélium, de manière corrélée à la présence de cils primaires. En absence de RFX3, le nombre des cils primaires est réduit. A la naissance, l’expression de RFX3 se restreint aux cellules multiciliées de l'épithélium bronchique. Les poumons de souris Rfx3-/- ou conditionnellement inactivées pour Rfx3 dans le mésenchyme, présentent un défaut de formation des alvéoles, associé à un nombre réduit de précurseurs des myofibroblastes en cours de migration en périphérie des poumons. In vivo, le nombre de précurseurs des myofibroblastes chez les souris Rfx3-/- est diminué. En culture primaire, les myofibroblastes Rfx3-/- ont une capacité proliférative réduite, ainsi qu'une altération du comportement migratoire. La voie induite par le PDGFAA, facteur de croissance responsable de la migration des myofibroblastes in vivo, est intact chez les myofibroblastes Rfx3-/-. En conclusion, RFX3 régule la croissance des cils primaires et gouverne la différentiation des myofibroblastes pendant le développement du poumon. Ce travail de thèse suggère donc une nouvelle fonction des cils primaires durant le développement pulmonaire / RFX3 belongs to the regulatory factor X (RFX) family transcription factors that are conserved in a wide range of species. With several other members of this family, RFX3 is involved in regulating the expression of genes required for assembly and function of cilia. The aim of my thesis was to understand the role of the transcription factor RFX3 during mouse lung development. RFX3 is expressed early in lung development in mesenchymal and epithelial cells, correlated to the presence of primary cilia. In the absence of RFX3, the number of primary cilia is reduced. At birth, RFX3 expression is restricted to multiciliated cells of the bronchial epithelium. The lungs of Rfx3-/- mice, or conditionally inactivated for Rfx3 in the mesenchyme, exhibit an alveolarization defect, associated with a reduced number of myofibroblast precursors that migrate in the lung periphery. In vivo, the number of myofibroblast precursors in Rfx3-/- mice is reduced. In primary culture, Rfx3-/- myofibroblasts have a reduced proliferative capacity, and an altered migratory behavior. The pathway induced by PDGFAA, a growth factor responsible for the myofibroblast migration in vivo, is intact in Rfx3-/- myofibroblasts. In conclusion, RFX3 regulates the growth of primary cilia and governs the differentiation of myofibroblasts during lung development. This thesis suggests a novel function of primary cilia during lung development

Le cil primaire est un organite présent à la surface de la plupart des cellules de Vertébrés. Il participe à l’organogénèse en régulant l’activité de voies de signalisation comme la voie Hedgehog. Une dysfonction du cil primaire mène à des maladies rares, sévères et pléiotropiques, les ciliopathies, qui peuvent inclure des défauts cardiaques. Cependant, le rôle que le cil primaire joue dans la morphogénèse cardiaque est encore mal compris. Le projet principal de la thèse porte sur l’étude du rôle du cil primaire des cellules cardiaques dans le développement du cœur. Dans ce but, nous avons utilisé un modèle murin de délétion conditionnelle de Ift20, un gène essentiel pour la ciliogénèse. La délétion est contrôlée par l’allèle Mesp1Cre exprimé dans la plupart des précurseurs précoces cardiaques. A la naissance, les mutants conditionnels présentent des défauts importants de septation des voies efférentes et des chambres cardiaques, les oreillettes et les ventricules. Ces défauts sont similaires à ceux caractérisés dans les mutants de la voie Hedgehog. Nous avons également identifié de nouveaux phénotypes associés à la suppression du cil. Les mutants présentent une augmentation significative de la taille du ventricule droit et des malformations du réseau de vascularisation coronaire. Pour mieux comprendre la cause des défauts de croissance observés à la naissance, nous avons analysé les comportements cellulaires sous-jacents. Aucune différence significative des taux de prolifération, de la taille et de la proportion des types cellulaires n’a été détectée au stade prénatal, suggérant que ces défauts ont une origine développementale plus précoce. Des expériences sont en cours pour déterminer les mécanismes moléculaires des défauts observés. Dans le cadre d’une collaboration avec le laboratoire de Julien Vermot, à Strasbourg, nous avons étudié le rôle du cil primaire dans le développement du proépicarde, un organe précurseur de l’épicarde du cœur mature. Nous avons montré que les embryons mutants Ift20 constitutifs présentent une augmentation significative du volume du proépicarde. Des analyses sont en cours pour identifier les voies de signalisation impliquées dans ce phénotype. Les travaux effectués durant ce projet de thèse ont permis de caractériser de nouveaux rôles du cil primaire dans le développement cardiaque. Nos résultats participent à une meilleure compréhension des ciliopathies et des défauts cardiaques qui leur sont associés. / The primary cilium is an organelle present at the surface of most of Vertebrate cells. It is involved in organogenesis by regulating signalling pathways such as Hedgehog signalling. Primary cilium dysfunction leads to severe, rare and pleiotropic diseases, ciliopathies, which can include cardiac defects. Howevr, the role that the primary cilia plays in cardiac morphogenesis is still poorly understood. The main project of the PhD focuses on the study of the role of primary cilia in cardiac cells during heart development. We have used a mouse mode of conditional deletion of Ift20, a gene essential for ciliogenesis. The deletion is controlled by the Mesp1Cre allele, expressed in the majority of cardiac precursors. At birth, conditional mutants display severe defects in septation of the outflow tract, the atria and the ventricles. These defects are similar to the ones characterized in Hedgehog signalling mutants. We also have identified novel phenotypes linked to cilium suppression. The mutants display a significant increase in the size of the right ventricle and defective coronary vasculature development. To better understand the growh defects observed at birth, we analysed the underlying cell behaviour. No significant differences in the proliferation rates, nor in the size and proportions of different cell types were detected at prenatal stages, suggesting that these defects have an earlier developmental origin. Experiments are underway to determine the molecular mechanisms of the observed defects. In collaboration with the laboratory of Julien Vermot, in Strasbourg, we studied the role of the primary cilium in the development of the proepicardium, a precursor organ of the mature epicardium. We have shown that Ift20 constitutive mutants show a significant increase in proepicardial volume. Analyses are ongoing to identify the signalling pathways involved in this phenotype. The works performed during this PhD project allowed the characterization of new roles for the primary cilium in cardiac development. Our results participate in a better understanding of ciliopathies and their associated cardiac defects.

Les ciliopathies sont un groupe de maladies génétiques multi-systémiques liées à un dysfonctionnement du cil primaire, une structure sensorielle présente à la surface des cellules qui régule des voies de signalisation clés au cours du développement et de l'homéostasie tissulaire. Afin d'identifier de nouveaux gènes responsables de ciliopathies développementales sévères, ~ 500 patients / fétus ont été analysés par une approche de séquençage à haut débit de l'exome ciblant > 1 200 gènes ciliaires ("ciliome"). Nous avons identifié huit nouvelles mutations dans le gène NEK8/NPHP9 chez cinq familles dont les syndromes se chevauchent. NEK8/NPHP9 code une protéine kinase de la famille des NIMA qui se localise au niveau du compartiment Inversine du cil primaire et agit comme un régulateur de la signalisation Hippo, une voie essentielle contrôlant la taille des organes. Nous montrons pour la première fois que les mutations du gène NEK8 sont associées à une agénésie rénale et une hypodysplasie. De plus, notre travail met en évidence une corrélation génotype/phénotype: les mutations "perte de fonction" de NEK8 conduisant à reins élargies et kystiques, des kystes pancréatiques et hépatique, alors que les mutations faux-sens de NEK8 causent une hypodysplasie/agénésie rénale associée à une cardiopathie et une paucité des canaux biliaires. La première partie de mon projet de thèse porte sur l'étude de l'impact des mutations faux-sens de NEK8 sur divers processus cellulaires et des voies de signalisation dépendantes de NEK8. Nous avons démontré un effet "gain de fonction" des mutations faux-sens de NEK8 puisqu'elles affectent la ciliogenèse et la composition du compartiment Inversine (localisation ciliaire de ANKS6). De plus, ces mutations altèrent la localisation nucléaire de YAP, le principal acteur de la voie Hippo, ainsi que l'expression des gènes cibles de YAP dans les fibroblastes de patients et dans la lignée cellulaire rénale (mIMCD3) invalidée pour NEK8. De même, nous avons montré une accumulation anormale de YAP nucléaire dans les reins polykystiques de la souris Jck, porteuse d'une mutation faux-sens de Nek8. Un déséquilibre de la voie Hippo serait donc à l'origine des défauts de morphogenèses épithéliales. En effet, les cellules mIMCD3 invalidées pour NEK8 forment en culture 3D des structures anormales et/ou des sphères élargies qui s'accompagnent d'une persistance du marquage nucléaire de YAP et Ki-67 et forment de grandes sphères par rapport aux cellules contrôles. Des défauts plus sévères ont été observés pour les cellules ré-exprimant les différents mutants de NEK8, confirmant la pathogénicité de ces mutations et leur effet "gain de fonction". Enfin, le traitement par la Vertéporfine, un inhibiteur spécifique de l'activité transcriptionnelle de YAP, améliore non seulement le phénotype des fibroblastes de patients et des cellules rénales invalidées pour NEK8 en culture 3D, mais également in vivo les anomalies observées chez les embryons de poisson zèbre dues à la surexpression de la forme NEK8 humaine, confirmant ainsi l'implication d'une dérégulation de YAP dans les mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, nous avons observé que les mutants de NEK8 s'accumulent de manière anormale au niveau de l'appareil de Golgi dans les fibroblastes de patients, et que cet appareil de Golgi apparait dispersé. Nos résultats montrent que le recrutement de NEK8 au Golgi est sensible à la Brefeldine A et dépendrait donc de ARF1, une petite GTPase impliquée dans le trafic de protéines entre les compartiments du Golgi et du réticulum endoplasmique. Nous avons démontré que NEK8 interagit et co-localise préférentiellement avec la forme d'ARF1 liée au GDP, suggérant pour NEK8 une possible fonction de facteur d'échange d'ARF1 à des sites spécifiques (appareil de Golgi, membranes, cil) afin de promouvoir le trafic vésiculaire de protéines telles que les protéine ciliaires. (...) / Ciliopathies are a group of genetic multi-systemic disorders related to dysfunction of the primary cilium, a sensory organelle present at the cell surface that regulates key signaling pathways during development and tissue homeostasis. In order to identify novel genes whose mutations would cause severe developmental ciliopathies, ~500 patients/fetuses were analyzed by a targeted high throughput sequencing approach allowing exome sequencing of > 1200 ciliary genes. We have identified eight novel mutations in NEK8/NPHP9 in five independent families with severe overlapping syndromic disorders. NEK8/NPHP9 encodes a NIMA-related kinase that localizes at the inversin compartment of the primary cilium and acts as a regulator of Hippo signaling, a pathway that is essential for control of organ size during development. We show for the first time that NEK8 mutations are associated with renal agenesis and hypodysplasia, and our work highlights a genotype/phenotype correlation with NEK8 loss-of-function mutations leading to enlarged cystic kidney, pancreas and liver, whereas NEK8 gain-of-function (missense) mutations cause renal hypodysplasia, cardiopathy and paucity of bile ducts. The first part of my thesis project focuses on the study of the impact of these NEK8 missense mutations on various cellular processes and NEK8-dependent signaling pathways. We demonstrate that NEK8 missense mutations impair the Inversin (INVS) compartment composition and ciliogenesis, and also alter the nuclear localization of the main Hippo signalling effector, YAP, as well as expression of its target genes in patient fibroblasts and renal cell lines. We also demonstrated that this Hippo pathway imbalance causes epithelial morphogenesis defects in 3D matrigel culture. Indeed, mIMCD3 cells depleted for NEK8 showed persistent YAP and Ki-67 staining and formed bigger spheres compared to control cells. Abnormal sphere volume was also observed in cells re-expressing NEK8-GFP mutations, suggesting their pathogenicity. We confirm these data in vivo in Jck mice, a model of polycystic kidney disease bearing a Nek8 missense mutation. Finally, treatment with Verteporfin, a specific inhibitor of YAP transcriptional activity, improves the mutant phenotype of both cellular models and zebrafish embryos overexpressing human NEK8, further supporting the involvement of YAP dysregulation in the pathogenic cellular mechanisms. Surprisingly, in patient fibroblasts, we showed that mutated NEK8 accumulates at the Golgi that appeared dispersed. NEK8 recruitment at the Golgi apparatus is dependent on ARF1 (Brefeldin A sensitive), a small GTPase involved in protein trafficking between Golgi compartments and ER. We notably demonstrated that NEK8 mostly interacts and localizes with the dominant negative form of ARF1 (T31N), suggesting that NEK8 could act as an activator (GEF) of ARF1 to promote vesicular trafficking of ciliary proteins. The second part of my project focuses on a new candidate gene for which a missense homozygous mutation has been identified in 3 individuals presenting a late onset NPH with hepatic fibrosis. This gene encodes ANKS3, an evolutionarily conserved protein whose function is still poorly characterized. Interestingly, ANKS3 has been reported to be a partner of NEK8, even though we showed it does not localize at the INVS compartment with NEK8 but is rather present at the base of cilia in fibroblasts. We showed that the missense mutation does not affect ANKS3 localization but leads to longer cilia and abnormal accumulation of NEK8 at the cilium base in patient fibroblasts and kidney tubules. Altogether, my work focused on NEK8 and its partners, ANKS6 and ANKS3, each of whose related gene is mutated in patients presenting a broad clinical spectrum of phenotypes. (...)

Les cils et les flagelles sont des organites conservés chez les eucaryotes où ils jouent des rôles essentiels et variés comme la motilité et la signalisation cellulaire. La zone de transition est une structure complexe, localisée à la base des cils, indispensable à l'assemblage du cil et pour la sélection des constituants ciliaires. Chez l'Homme, de nombreuses pathologies appelées ciliopathies sont associées à des défauts d'assemblage ou de fonctionnement des cils. Les plus sévères sont liées à des défauts de protéines de la zone de transition. La zone de transition comprend les fibres de transition qui font le lien entre le centriole et la membrane plasmique, puis les liens Y avec une composition protéique complexe organisé en 3 complexes, MKS, NPHP et CEP290 interagissant étroitement entre eux. D'autres protéines, dont CBY conservée des mammifères à la drosophile, s'ajoutent à ces modules mais leur interconnections ne sont pas connues.Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé fonctionnellement les orthologues des protéines des fibres de transition et analysé la fonction de nouvelles protéines de la zone de transition en utilisant le modèle de la drosophile. J'ai également caractérisé une protéine impliquée dans la spermatogenèse qui est essentielle pour l'individualisation des spermatides et la fertilité des males.En conclusion, ce travail apporte de nouvelles connaissances sur l'assemblage de la zone de transition et sur le rôle de CBY dans les mécanismes qui contrôlent la ciliogenèse. De plus l'étude de Salto amène à une meilleure compréhension de la spermatogenèse chez la drosophile / Cilia and flagella are highly conserved organelles among eukaryotes species. They are composed of a microtubular cytoskeleton and play essential functions during development and in numerous physiological processes. As a result, in humans, cilia dysfunction leads to a wide range of pathologies, called ciliopathies

Les cils primaires et motiles sont des structures microtubulaires présentent à la surface de nombreux types cellulaires. Les structures ciliées contrôlent de nombreuses fonctions allant de la motilité cellulaire à l’intégration par la cellule de stimuli chimiques et mécaniques. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le dialogue entre le cil primaire et l’autophagie, un processus d’autodigestion qui permet à la cellule de s’adapter à des situations de stress. L’hypothèse de ce dialogue reposait sur l’analyse de la littérature montrant que de nombreux médiateurs (calcium, carence en sérum, arrêt du cycle cellulaire) stimulent à la fois l’activité ciliaire et l’autophagie. Dans un premier temps de notre étude nous avons montré que l’inhibition de la ciliogenèse altère l’induction de l’autophagie en réponse à la carence en sérum dans des fibroblastes d’embryon de souris, des cellules épithéliales rénales et des lignées de neurone. Nous avons aussi montré que la carence en sérum induisait une redistribution de nombreuses protéines Atg (Autophagy-related), protéines impliquées dans la biogenèse de l’autophagosome, au niveau du cil primaire (soit au niveau du corps basal soit au niveau de l’axonème). Particulièrement la protéine Atg16L1 est co-transportée vésiculairement au corps basal avec la protéine ciliaire IFT20. L’inhibition génétique ou pharmacologique de la voie de signalisation Hedgehog inhibe à la fois le transport de la protéine Atg16L1 au corps basal et l’induction de l’autophagie en absence de sérum. Nous avons aussi montré que l’invalidation de gènes ATG est associée à une ciliogenèse accrue. Dans ces conditions nous avons conclu sur des bases morphologiques et biochimiques que ces cils primaires sont fonctionnels. La protéine IFT20 s ‘accumule dans les cellules déficientes en autophagie et est dégradée par autophagie dans les cellules sauvage en présence de sérum. Ces résultats montre que l’autophagie basale (autophagie observée en présence de sérum) est un mécanisme qui contribue au contrôle de la croissance du cil primaire. Dans une deuxième partie du travail nous avons étudié l’importance de l’autophagie dans la réponse cellulaire à stress mécanique. Le contrôle de la taille et du volume des cellules épithéliales rénales est un élément important pour maintenir la polarité planaire des cellules tubulaires. Cette propriété est dépendante du cil primaire. Au cours de l’application d’un flux de liquide (1 dyn/cm2) concomitamment à la réduction du volume et de la taille cellulaire nous avons observé une stimulation de l’autophagie. Cette réponse autophagique dépend du cil primaire. L’invalidation de l’autophagie dans des cellules épithéliales ciliées abolit le contrôle du volume et de la taille cellulaire dans les cellules épithéliales rénales. L’ensemble de ces résultats montre le dialogue qui existe en l’autophagie et le cil primaire et l’importance de ce dialogue dans l’intégration par la cellule du stress mécanique. / Motile and primary cilia are microtubule-based structures located at the cell surface of many cell types. Cilia govern cellular functions ranging from motility to integration of mechanical and chemical signaling from the environment. In this work we investigate the potential cross-talk between the primary cilium and macroautophagy. Macroautophagy or self-eating is a lysosomal degradative pathway that allows cells to adapt to various stress situations. The rational for the study was based on the survey of the literature showing that many stress situations that trigger primary cilium signaling also stimulates autophagy (serum starvation, calcium mobilization, cell cycle arrest). In the first part of the study we showed that inhibition of ciliogenesis severely impairs serum-induced autophagy in mouse embryo fibroblasts, kidney epithelial cells and neurons. We also showed that in response to serum deprivation many Autophagy-related proteins (Atg proteins) involved in autophagosome formation are co-localized with cilium subdomains (axoneme and basal body). Notably the protein Atg16L1 is co-transported to the basal body with the ciliary protein IFT20. The localization of Atg16L1 to the basal body as well as serum-induced autophagy were severely impaired by inhibiting the Hedgehog signaling pathway either genetic or pharmacological approaches. We also showed that invalidation of ATG genes induced an increase in primary cilium length in basal condition. Cilia were functional in ATG-deficient cells because of the presence of a ciliary pocket and the activation of the Hedgehog signaling pathway. Finally we identified IFT20 as a substrate for autophagy. Thus autophagy is required to regulate the level of IFT20 and consequently that of the length of the primary cilium. In the second part of the work we investigate the role of the cross-talk between autophagy and the primary cilium in regulating the size of kidney epithelial cells. Previous studies have shown that the primary cilium plays a central role in regulating cell size and cell volume. This regulation is important to keep the physiological functions of tubular renal cells by maintaining the planar polarity in kidney tubule. By applying a liquid flow of 1 dyn/cm2 to MDCK or mouse kidney epithelial cells to mimic physiological conditions, we show that the flow induces autophagy and reduction of the cell volume. In absence of cilium we observed that autophagy is not induced and that the cell size/volume is not responsive to the mechanical stress. Finally we showed that ablation of autophagy led also to an impairment of flow-dependent regulation of cell size/volume in ciliated kidney epithelial cells. In conclusion primary cilium-dependent autophagy plays a major role in controlling the epithelial kidney cell size/volume during mechanical stress induced by fluid flow.