La macroautophagie est un processus catabolique, situé au carrefour entre l’homéostasie et le métabolisme cellulaire. Dans le système immunitaire, elle joue des rôles spécialisés, en contribuant notamment à la régulation de l’inflammation et la présentation antigènique. En utilisant deux modèles murins, nous avons pu démontrer que la macroautophagy est nécessaire à la lignée lymphocytaire B et contribue à l’élaboration d’une réponse humorale optimale. En effet, la macroautophagie contribue à la survie des cellules sécrétrices d’antigènes, notamment la population plasmocytaire, ainsi que des cellules à longue durée de vie, telles que les lymphocytes B mémoire. Nous avons également démontré qu’une forme d’autophagie non-canonique était nécessaire pour la présentation efficace d’antigènes particulaires reconnus par le récepteur des lymphocytes B. Dans ce contexte, la machinerie macroautophagique contribue à la polarisation du cytosquelette des lymphocytes B, afin de former une synapse immunologique, nécessaire au chargement efficace du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II, et ainsi, à la présentation antigènique. A l’aide d’un troisième modèle de souris transgénique, nous avons caractérisé un rôle jusqu’alors inconnu de la macroautophagie dans le maintient de l’homéostasie des cellules de Langerhans. L’inhibition de la macroautophagie altère la survie de ces cellules, en les exposant à potentiel stress du réticulum endoplasmique, potentiellement non compensé. En somme, nous avons démontré que la macroautophagie était un acteur majeur au sein des cellules présentatrices d’antigènes. / Macroautophagy is a catabolic process at the crossroad between homeostasis and metabolism. In the immune system it also possesses specialized roles such as inflammation regulation and antigen presentation. Here we demonstrated in two mice models that macroautophagy is integral to B cell lineage for proper humoral responses. Indeed it insures the survival of secreting cells such as plasma cells and long living cells such as memory B cells. We also report that non-canonical autophagy is also needed for an efficient presentation of particulate antigen recognized by the B cell receptor. In this context it drives B cell cytoskeleton polarization to form an immune synapse necessary for the efficient loading of class two major histocompatibility complexes and the subsequent antigen presentation. Using a third mice model we unveiled a yet uncharacterized function of macroautophagy in Langerhans cells, a subset of epidermal dendritic cells, homeostasis. Macroautophagy inhibition impairs their survival by exposing them to a potentially uncompensated endoplasmic reticulum stress response. Altogether we demonstrated that macroautophagy is a major actor in several types of antigen presenting cells.

L’autophagie est un processus d’autodigestion dans lequel la cellule dégrade ses propres composants dans le but de maintenir l’homéostasie dans ses conditions basales. En absence de nutriments, l’autophagie est activée et favorise la survie cellulaire en fournissant des substrats énergétiques résistant aux conditions de stress. Autophagie et métabolisme communiquent à différents niveaux; une baisse en métabolites richement énergétiques, tels qu’en ATP et en NADH, est détectée par des senseurs cellulaires (AMPK et SIRT1 respectivement) et mène à l’activation de l’autophagie. Ici, nous définissons un niveau supplémentaire de régulation de l’autophagie induite par le jeûne. Dans ce travail, nous montrons que cette privation en nutriments est caractérisée par une diminution rapide de l’Acétyl CoA, intégrateur majeur de l’état nutritionnel au carrefour du catabolisme des graisses, des sucres et des protéines. La baisse en AcCoA s’accompagne de la réduction proportionnelle des niveaux généraux d’acétylation des protéines ainsi que par l’induction de l’autophagie. Les manipulations destinées à augmenter ou diminuer les niveaux cytosoliques d’AcCoA, ciblant soit la synthèse mitochondriale soit son transport dans le cytoplasme, résultent en la suppression ou l’induction de l’autophagie aussi bien dans les cultures cellulaires que dans les tissus de souris. La déplétion en AcCoA impacte directement l’activité des KATs utilisant l’AcCoA comme substrat pour l’acétylation protéique. Nous avont montré que cette baisse en AcCoA réduit spécifiquement l’activité de EP300; cette KAT est en effet nécessaire à la suppression de l’autophagie à des niveaux élevés d’AcCoA, se comportant ainsi comme le senseur des niveaux cytosoliques d’AcCoA. A son tour, EP300 contrôle l’autophagie en inhibant les protéines autophagiques clés. Dans l’ensemble, nos résultats illustrent les fonctions de l’AcCoA cytosolique comme régulateur métabolique central de l’autophagie, délimitant ainsi des stratégies pharmacologiques centrées sur l’AcCoA qui permettent la manipulation thérapeutique de l’autophagie. En effet, la privation en nutriments et la restriction calorique sont connues pour jouer un rôle positif sur la santé et la longévité en promouvant leurs effets. Néanmoins, les stratégies basées sur la restriction calorique sont difficilement applicables en clinique. Ici, nous proposons une nouvelle définition biochimique des Mimétiques de la Restriction Calorique, composés imitant l’effet positif du jeûne. Dans notre contexte, un MRC est un composé capable de réduire l’acétylation protéique par des mécanismes distincts mais convergents: premièrement, par diminution des niveaux d’AcCoA, deuxièmement par inhibition directe des KATs, et enfin, par activation des protéines déacétylases. Ces résultats de l’exécution d’un programme cellulaire conduisent finalement à des effets pro-santé liés à la restriction calorique incluant mais non limités à l’autophagie. / Autophagy is a self-digestion process in which cell degrades its own components in order to maintain homeostasis in basal conditions. In absence of nutrients, autophagy is activated and promotes cell survival by providing energetic substrates to sustain stressful condition. Autophagy and metabolism crosstalk at different levels; a drop in energy-rich metabolites, such as ATP and NADH, is detected by cellular sensors (AMPK and SIRT1 respectively) and leads to autophagy activation. Here, we define a further regulatory level of starvation-induced autophagy. In this work, we show that nutrient deprivation is characterized by a rapid depletion of Acetyl CoA, a major integrator of the nutritional status at the crossroads of fat, sugar, and protein catabolism.Decrease in AcCoA is accompanied by the commensurate reduction in overall protein acetylation levels as well as by autophagy induction. Manipulations designed to increase or reduce cytosolic levels of AcCoA, either targeting mitochondrial synthesis or its transport in the cytoplasm, resulted in the suppression or induction of autophagy both in cultured cells and in mice tissues. Depletion of AcCoA directly impacts on the activity of cellular KATs, which use AcCoA as substrate for acetylating proteins. We showed that a drop in AcCoA specifically reduces the activity of EP300; this KAT was indeed required for the suppression of autophagy by high AcCoA levels, thus behaving as the sensor of cytosolic AcCoA levels. In turn, EP300 controls autophagy by inhibiting key autophagic proteins. Altogether, our results indicate that cytosolic AcCoA functions as a central metabolic regulator of autophagy, thus delineating AcCoA-centered pharmacological strategies that allow for the therapeutic manipulation of autophagy. Indeed, nutrient deprivation and caloric restriction are known to play pro-healthy and longevity promoting effects. Nonetheless, CR-based strategies are hardly suitable in clinical settings. Here, we propose a new biochemical definition of Caloric Restriction Mimetics, compounds that mimic the positive effects of nutrient starvation. In our setting, a CRM is a compound able to reduce protein acetylation through distinct but convergent mechanisms: first, by decreasing AcCoA levels, second by directly inhibiting KATs, third by the activation of protein deacetylases. This results in the execution of a cellular program ultimately leading to CR-related pro-healthy effects, including but not limited to autophagy.

Le gène gec1/gabarapl1 (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identifié au sein de notre équipe, est un gène apparenté à la famille atg8 (autophagy related gene 8) et  la  sous-­‐famille  gabarap  (GABAA  receptor  associated  protein)  incluant  les  gènes  gabarap, gabarapl1, gabarapl2 et gabarapl3. Les protéines codées par ces gènes présentent de très fortes identités de séquences et des structures similaires. Le gène gabarapl1 est exprimé préférentiellement dans le SNC dans lequel il est le transcrit de la famille atg8 le plus fortement exprimé. Des études fonctionnelles ont démontré que la protéine GABARAPL1 intervient dans le trafic intracellulaire de récepteurs, et plus particulièrement  du  récepteur  GABAA  et  du  récepteur  aux  κ-­‐opioïdes,  via  son  interaction avec les microtubules. Cependant, le rôle de cette protéine ne se limite probablement  pas  au  seul  transport  de  ces  récepteurs.  Notre  équipe  a  d’ailleurs  récemment démontré que GABARAPL1 est impliquée dans le processus d’autophagie, un mécanisme de dégradation cellulaire. Dans  le  cadre  de  ma  thèse,  j’ai  eu  trois  objectifs :  (1)  l’étude  de  la  spécificité  d’anticorps anti-­‐GABARAPL1 commerciaux disponibles, (2) la cartographie détaillée de l’expression de GABARAPL1 dans le cerveau murin et (3) l’étude de la surexpression de GABARAPL1 dans un modèle neuronal in vitro en conditions de stress mitochondriaux. Etant donné la forte homologie entre GABARAPL1 et GABARAP, aucun anticorps spécifique  commercial  n’était  disponible  lorsque  nous  avons  débuté  mon  projet  de  recherche. Nous avons donc, dans un premier temps, étudié la spécificité des différents anticorps commerciaux anti-­‐GABARAPL1 disponibles et identifié un anticorps capable de détecter de façon spécifique cette protéine in vitro et in vivo. Grâce  à  cet  anticorps  spécifique,  nous  avons  ensuite  entrepris  l’étude  de  l’expression in vivo de la protéine GABARAPL1 dans le SNC de souris chez l’adulte et au cours du développement embryonnaire. Nous avons ainsi démontré que GABARAPL1 est exprimée dans les neurones immatures et les fibres neuronales à partir du 11e jour de  développement  et  son  expression  augmente  progressivement  jusqu’à  un  taux  maximal observé chez l’adulte. Chez l’adulte, GABARAPL1 est exprimée uniquement dans  les  neurones  et  plus  particulièrement  dans  ceux  impliqués  dans  les  fonctions  motrices et neuroendocrines. De plus, nous avons noté que le marquage ponctiforme de  GABARAPL1  co-­‐localise  partiellement  avec  p62  dans  des  cultures  neuronales  primaires, confirmant son association aux vésicules autophagiques in vivo. Pour caractériser la fonction cellulaire de GABARAPL1, nous avons surexprimé cette protéine dans des cellules neuronales SK-­‐N-­‐BE(2). L’étude de ce nouveau modèle neuronal a montré que la surexpression de DsRed-­‐GABARAPL1 semble potentialiser la réponse  autophagique  des  cellules,  ce  qui  permet  une  induction  plus  précoce  suite  à  des traitements induisant l’autophagie. De plus, la surexpression de GABARAPL1 inhibe la mort des cellules soumises à des stress ciblant les mitochondries (CCCP), ce qui  suggère  que  GABARAPL1  pourrait  protéger  les  neurones  contre  certains  stress  aggravant la progression des maladies neurodégénératives. L’ensemble  de  ces  travaux  a  permis  d’identifier  un  outil  spécifique  à  l’immunodétection de GABARAPL1, de cartographier son expression dans le SNC murin au cours du développement et chez l’adulte et finalement, de démontrer un rôle protecteur  de  GABARAPL1  contre  la  mort  neuronale  induite  par  un  stress  mitochondrial. / The gec1/gabarapl1 gene (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identified within our team, is a gene related to the atg8 (autophagy related gene 8) family and the gabarap  (GABAA  receptor-­‐associated  protein)  subfamily  of  genes  including  gabarap,  gabarapl1, gabarapl2 and gabarapl3. The protein products of these genes present a very  strong  sequence  identity  and  are  structurally  similar.  The  gabarapl1  gene  is  expressed preferentially in the central nervous system, in which it is the most highly expressed  transcript  of  the  atg8  family.  Functional  studies  have  shown  that  the  GABARAPL1 protein is involved in intracellular trafficking of receptors, in particular the  GABAA  receptor  and  the  κ-­‐opioid  receptor,  via  its  interaction  with  cytoskeletal  elements. The role of this protein, however, is clearly not limited to the transport. Our team has also recently shown that GABARAPL1 is involved in the autophagic process, a cellular degradation mechanism. My  thesis  objectives  were  three-­‐tiered:  (1)  the  study  of  the  specificity  of  anti-­‐GABARAPL1 antibodies, (2) the detailed mapping of GABARAPL1 expression in the mouse  brain  and  (3)  the  study  of  GABARAPL1  overexpression  under  conditions  of  mitochondrial stress in an in vitro neuronal model. Given the high homology between GABARAPL1 and GABARAP, no commercially available  specific  antibody  was  available  when  we  started  my  research  project.  As  such, we conducted a study on the specificity of different commercially available anti-­‐GABARAPL1 antibodies and identified an antibody that specifically recognized this protein in vitro and in vivo experiments. With this specific antibody, we then undertook a study of the in vivo expression of the GABARAPL1 protein in the adult mouse central nervous system and throughout embryonic development. In this study, we demonstrate that GABARAPL1 is expressed in immature neurons and neural fibers in the embryo from the 11th day of embryonic development and its expression gradually increases to a maximum in adults. In adults, GABARAPL1 is expressed in neurons, in particular, in those involved in motor control and  neuroendocrine  functions.  The  punctate  labeling  of  GABARAPL1  partially  co-­‐localizes with p62 in primary neuronal cultures, confirming its association with autophagic vesicles in vivo. To  characterize  the  cellular  function  of  GABARAPL1,  we  overexpressed  this  protein in neuronal SK-­‐N-­‐BE (2) cells. The study of our neuronal cell model revealed that  overexpression  of  DsRed-­‐GABARAPL1  appears  to  prime  cells  for  autophagy,  resulting in an earlier induction of autophagy after treatments that induce this processes.  In  addition,  overexpression  of  this  protein  delays  cell  death  in  a  CCCP-­‐induced mitochondrial stress model, suggesting that GABARAPL1 could protect neurons  against  certain  stresses  known  to  contribute  to  the  development  of  neurodegenerative diseases. Together,  this  work  has  identified  a  specific  tool  for  the  immunodetection  of  GABARAPL1, produced a detailed map of GABARAPL1 expression in the developing and  adult  murine  central  nervous  system  and  finally,  demonstrated  a  protective  role  for GABARAPL1 against neuronal death induced by mitochondrial stress.

L’autophagie est un processus catabolique lié aux lysosomes, essentiel à la l’homéostasie cellulaire notamment dans les lymphocytes. Elle est impliquée dans la pathogenèse de nombreuses maladies et pourrais jouer un rôle dans le développement de maladies auto-immunes. Nous avons voulu étudier son rôle in vivo dans les lymphocytes B et T. Nous avons généré des souris déficientes en autophagie spécifiquement dans ces cellules et montré que l’autophagie n’est pas essentielle au développement des LB, mais que dans un contexte auto-immun la persistance de plasmocytes et la production d’autoanticorps été diminuée. Cela démontre un rôle de l’autophagie dans les réponses à long terme. Les réponses humorales à long-terme T dépendantes sont également impactées. De plus des souris transplantées avec des LT CD4+ déficients en autophagie montrent une réponse humorale mémoire diminuée. Nous nous sommes également intéressé aux voies de signalisation conduisant à l’induction de l’autophagie en réponse à une stimulation du TCR dans des LT normaux et pathologiques. Nos résultats préliminaires montrent une implication de la voie calcique. / Autophay is a catobolic lysosomal process essentail for cellular maintenance and fucntion such as lymphocyte homeosatsis. The generation of mice models with an Atg5 conditional knock-out in B and T cells respectively, have allowed us to study autophagy requirements of those immune cells in vivo. We have demonstrated that autophagy was dispensable for B cell development but that in autoimmune settings B cell autophagy was required for the maintenance of long-lived plasma cells and for the production of autoantibodies. In mice deficient for autophagy in T cells, long-term tumoral response to a T-dependent antigen is decreased. We also showed that in mice adoptively transferred with autophagy deficient CD4 T cells, the antigen specific memory humoral immune response was impaired. We also investigated the signaling pathways leading to autophagy induction upon TCR stimulation in normal and lupus T cells and showed that the calcium signaling is highly involved.

Les cils primaires et motiles sont des structures microtubulaires présentent à la surface de nombreux types cellulaires. Les structures ciliées contrôlent de nombreuses fonctions allant de la motilité cellulaire à l’intégration par la cellule de stimuli chimiques et mécaniques. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le dialogue entre le cil primaire et l’autophagie, un processus d’autodigestion qui permet à la cellule de s’adapter à des situations de stress. L’hypothèse de ce dialogue reposait sur l’analyse de la littérature montrant que de nombreux médiateurs (calcium, carence en sérum, arrêt du cycle cellulaire) stimulent à la fois l’activité ciliaire et l’autophagie. Dans un premier temps de notre étude nous avons montré que l’inhibition de la ciliogenèse altère l’induction de l’autophagie en réponse à la carence en sérum dans des fibroblastes d’embryon de souris, des cellules épithéliales rénales et des lignées de neurone. Nous avons aussi montré que la carence en sérum induisait une redistribution de nombreuses protéines Atg (Autophagy-related), protéines impliquées dans la biogenèse de l’autophagosome, au niveau du cil primaire (soit au niveau du corps basal soit au niveau de l’axonème). Particulièrement la protéine Atg16L1 est co-transportée vésiculairement au corps basal avec la protéine ciliaire IFT20. L’inhibition génétique ou pharmacologique de la voie de signalisation Hedgehog inhibe à la fois le transport de la protéine Atg16L1 au corps basal et l’induction de l’autophagie en absence de sérum. Nous avons aussi montré que l’invalidation de gènes ATG est associée à une ciliogenèse accrue. Dans ces conditions nous avons conclu sur des bases morphologiques et biochimiques que ces cils primaires sont fonctionnels. La protéine IFT20 s ‘accumule dans les cellules déficientes en autophagie et est dégradée par autophagie dans les cellules sauvage en présence de sérum. Ces résultats montre que l’autophagie basale (autophagie observée en présence de sérum) est un mécanisme qui contribue au contrôle de la croissance du cil primaire. Dans une deuxième partie du travail nous avons étudié l’importance de l’autophagie dans la réponse cellulaire à stress mécanique. Le contrôle de la taille et du volume des cellules épithéliales rénales est un élément important pour maintenir la polarité planaire des cellules tubulaires. Cette propriété est dépendante du cil primaire. Au cours de l’application d’un flux de liquide (1 dyn/cm2) concomitamment à la réduction du volume et de la taille cellulaire nous avons observé une stimulation de l’autophagie. Cette réponse autophagique dépend du cil primaire. L’invalidation de l’autophagie dans des cellules épithéliales ciliées abolit le contrôle du volume et de la taille cellulaire dans les cellules épithéliales rénales. L’ensemble de ces résultats montre le dialogue qui existe en l’autophagie et le cil primaire et l’importance de ce dialogue dans l’intégration par la cellule du stress mécanique. / Motile and primary cilia are microtubule-based structures located at the cell surface of many cell types. Cilia govern cellular functions ranging from motility to integration of mechanical and chemical signaling from the environment. In this work we investigate the potential cross-talk between the primary cilium and macroautophagy. Macroautophagy or self-eating is a lysosomal degradative pathway that allows cells to adapt to various stress situations. The rational for the study was based on the survey of the literature showing that many stress situations that trigger primary cilium signaling also stimulates autophagy (serum starvation, calcium mobilization, cell cycle arrest). In the first part of the study we showed that inhibition of ciliogenesis severely impairs serum-induced autophagy in mouse embryo fibroblasts, kidney epithelial cells and neurons. We also showed that in response to serum deprivation many Autophagy-related proteins (Atg proteins) involved in autophagosome formation are co-localized with cilium subdomains (axoneme and basal body). Notably the protein Atg16L1 is co-transported to the basal body with the ciliary protein IFT20. The localization of Atg16L1 to the basal body as well as serum-induced autophagy were severely impaired by inhibiting the Hedgehog signaling pathway either genetic or pharmacological approaches. We also showed that invalidation of ATG genes induced an increase in primary cilium length in basal condition. Cilia were functional in ATG-deficient cells because of the presence of a ciliary pocket and the activation of the Hedgehog signaling pathway. Finally we identified IFT20 as a substrate for autophagy. Thus autophagy is required to regulate the level of IFT20 and consequently that of the length of the primary cilium. In the second part of the work we investigate the role of the cross-talk between autophagy and the primary cilium in regulating the size of kidney epithelial cells. Previous studies have shown that the primary cilium plays a central role in regulating cell size and cell volume. This regulation is important to keep the physiological functions of tubular renal cells by maintaining the planar polarity in kidney tubule. By applying a liquid flow of 1 dyn/cm2 to MDCK or mouse kidney epithelial cells to mimic physiological conditions, we show that the flow induces autophagy and reduction of the cell volume. In absence of cilium we observed that autophagy is not induced and that the cell size/volume is not responsive to the mechanical stress. Finally we showed that ablation of autophagy led also to an impairment of flow-dependent regulation of cell size/volume in ciliated kidney epithelial cells. In conclusion primary cilium-dependent autophagy plays a major role in controlling the epithelial kidney cell size/volume during mechanical stress induced by fluid flow.

Le gène Gec1/Gabarapl1 a été identifié au sein de notre laboratoire comme un gène régulé par les estrogènes. Il appartient à la famille Gabarap incluant les gènes Gabarap, gabarap/2 et Gabarapl3 qui codent des protéines présentant de fortes homologies de séquences. L'étude fonctionnelle de Gabarapl 1 a montré que cette protéine est impliquée dans le transport des récepteurs et particulièrement les récepteurs Gabaₐ et des κ-opioïdes via son interaction avec la tubuline et la protéine NSF. Cependant, il a été décrit que certaines protéines de la famille Atg8 sont impliquées dans l' autophagie, un mécanisme de dégradation et de survie cellulaire, qui se caractérise par la formation de doubles membranes appelées autophagosomes. Les objectifs de mon travail étaient, d'une part, de caractériser le rôle de la protéine GABARAPL1 au cours de !'autophagie et, d'autre part, de caractériser son expression dans des lignées et tissus cancéreux et sa régulation en réponse à des composés anti-cancéreux. Tout d'abord, nous avons montré que Gabarapl1 est clivée par la protéase Atg4B au niveau de sa glycine 116 avant sa conjugaison à des phopholipides. Cette forme modifiée, lipidée, est localisée à la surface des autophagosomes et des lysosomes. Nous avons ensuite montré que Gabarapl1 est faiblement exprimée dans de nombreuses lignées cancéreuses, que son expression est altérée dans les méningiomes et qu'elle est régulée par des inhibiteurs du protéasome. Ces travaux ont montré, pour la première fois, que la protéine Gabarapl1 est associée à des vésicules autophagiques et permettront de poser les hypothèses de nos futurs travaux. / The Gec1 / Gabarapl1 gene was identified in our laboratory as an early estrogen regulated gene. Gabarapl1 belongs to the Gabarap family, also including Gabarap, Gabarapl2 and Gabarapl3 genes, that encode proteins which present high sequence homology with each other. A functional study of the Gabarapl 1 protein showed that this protein is involved in the transport of receptors such as the Gabaₐ and κ-opioid receptors via its interaction with tubulin and NSF. It has been reported that the Atg8 family proteins are involved in autophagy, a mechanism of degradation and cell survival that is charactenzed by the formation of double membranes called autophagosomes. The aims of my research were, firstly, to characterize the role of the Gabarapl1 protein during autophagy and, secondly, to study its expression in cancer cell lines and cancerous tissues and its regulation in response to anti-cancer drugs. First, we showed that Gabarapl1 is cleaved in the cells by the protease Atg4B at its 116 glycine residue prior to its conjugation to phospholipids. This modified form, lipidated, is located on the surface of autophagosomes and lysosomes. We then showed that Gabarapl1 expression is reduced in many cancer cell lines, and that its expression is also altered in meningiomas. Finally, we showed that Gabarapl1 expression is regulated by proteasom€: inhibitors. Thus, our results demonstrated for the first time that the Gabarapl1 protein is associatec with autophagie vesicles and allow us to propose hypothesis for future work