L'objectif de ces travaux de thèse était d'étudier l'implication de l'autophagie dans le cancer via l'analyse de deux protéines QSOX1 et GABARAPL1. La protéine QSOX1 possède deux isoformes majoritaires QSOX1-S et QSOX1-L et est impliquée dans le repliement correct des protéines par la création de ponts disulfures. Des études de notre laboratoire ont également mis en évidence que QSOX1-S est impliquée dans laprotection contre les stress et le cancer. En effet, l'expression de QSOX1-S est induite suite à un stress oxydant ou un stress du réticulum endoplasmique et protège les cellules contre la mort induite par ces stress. De plus, QSOX1-S réduit les phénotypes des cellules de cancer du sein in vitro et la croissance tumorale in vivo. Néanmoins, le rôle de QSOX1 dans le cancer est complexe et diffère selon les types de cancer, principalement à cause de l'existence de ces différents transcrits. Etant donné le rôle de QSOX1-S dans les stress et le cancer, deux mécanismes étroitement liés à l'autophagie, nous avons étudié le rôle de QSOX1-S dans l'autophagie. Nos résultats ont permis de mettre en évidence que l'expression de QSOX1-S augmente suite à l'induction de l'autophagie et permet le maintien de l'homéostasie cellulaire.Nous avons également démontré que QSOX1-S inhibe le flux autophagique en inhibant la fusion autophagosome/lysosome et pourrait réduire l'invasion des cellules de cancer du sein par sa fonction dans l'autophagie. La protéine GABARAPL1 appartient à la famille ATG8 et sous-famille GABARAP dont les membres sont impliqués dans l'autophagie. Il a été mis en évidence au sein de notre laboratoire que GABARAPL1 est associée aux autophagosomes lors de l'autophagie. Les membres de la famille GABARAP interviendraient lors des étapes tardives de l'autophagie. Un rôle de la protéine GABARAPL1 dans la dégradation du glycogène par autophagie, appelée glycophagie, a également été mis en évidence, suggérant une fonction de cette protéine dans le métabolisme. De plus, GABARAPL1 inhibe les phénotypes des cellules de cancer du sein in vitro et la croissance tumorale in vivo, suggérant un rôle de suppresseur de tumeur de cette protéine. Au vu du rôle de GABARAPL1 dans le cancer et l'autophagie, nous avons poursuivi et approfondi le rôle de cette protéine dans l'autophagie et étudié l'implication de l'autophagiedans les fonctions de GABARAPL1 liées aux cellules cancéreuses. Nous avons mis en évidence que GABARAPL1 agit au niveau des étapes précoces et tardives de l'autophagie de manière dépendante ou indépendante de sa liaison aux autophagosomes. De façon intéressante, nosrésultats montrent que la fonction de suppresseur de tumeur de GABARAPL1 semble indépendante de sa liaison aux autophagosomes. Nos résultats ont également mis en évidence que GABARAPL1 joue un rôle important dans la régulation du métabolisme cellulaire et dansla régulation de l'homéostasie mitochondriale via l'autophagie qui pourrait expliquer son rôle dans le cancer. L'ensemble de ces travaux ont permis de mieux caractériser et d'identifier des liens entre autophagie, stress cellulaire, métabolisme et cancer. / The aim of my thesis was to study the role of QSOX1 and GABARAPL1 (GL1) in autophagy and cancer. QSOX1 protein has been shown to be involved in the regulation of protein folding and is associated with protection against cellular stress and cancer. Given the function of QSOX1 in stress and cancer, two processes which have been previously linked to autophagy, we have studied the role of QSOX1 in autophagy. We showed that QSOX1 protein can maintain cellular homeostasis during amino acids starvation. Our results also indicated that QSOX1 inhibits autophagy through the inhibition of autophagosome/lysosome fusion which could explain the role of QSOX1 on cell invasion. The GL1 protein, belonging to the ATG8 family and GABARAP subfamily, is associated with autophagosomes during autophagy and have a tumor suppressor role. Given the function of GL1 in cancer and autophagy, we aimed to characterize the role of GL1 in autophagy and determine whether GL1 conjugation to autophagosomes is necessary for its tumor suppressive functions. Our results demonstrated that GL1 presents different regulatory functions during early and later stages of autophagy. Sorne of these functions seem to be independent of its conjugation to autophagosomes. Interestingly, GLl tumor suppressive function appeared independent of its conjugation to autophagosomes. Our results also demonstrated that GL1 play an important role in the regulation of metabolism and mitochondrial homeostasis through autophagy, function which could explain its role in cancer. Together, this work allowed us to establish a link between autophagy, cellular stress, metabolism and cancer

La protéine GABARAPL1 (GABARAP like 1) ou GEC1 (Glandular Epithelial Cell 1), présente de forts pourcentages d'identité avec les protéines GABARAP (GABAA Receptor-Associated Protein), GATE-16 (Golgi-Associated ATPase Enhancer of 16 kDa) et Atg8 (Autophagy-related 8) ainsi qu'une identité moindre avec les protéines de la sous-famille LC3 (Light Chain 3). GABARAPL1 est exprimée dans tous les tissus, préférentiellement dans le système nerveux central, et intervient dans le transport intracellulaire des récepteurs GABAA (Gamma-AminoButyric Acid type A receptor) et KOR (K Opioid Receptor). De plus, une faible expression du gène gabarap1 est observée dans diverses lignées cancéreuses, suggérant son implication dans la genèse et/ou la progression tumorale. La recherche de partenaires protéiques a abouti à l'identification de différentes protéines. L'interaction entre GABARAPL1 et la protéine HSP90 (Heat Shock Protein 90) nouvellement identifiée a été étudiée dans le cerveau de rat et dans les cellules MCF-7. Ainsi, nous avons montré que HSP90 protège GABARAPL1 de la dégradation par le protéasome. Par ailleurs, il a été établi qu'au cours de !'autophagie, GABARAPL1 est clivée, maturée puis conjuguée à des phospholipides. Elle co-Iocalise alors partiellement au niveau de lysosomes et d'autophagosomes. Nous avons également démontré que gabarap1 est faiblement exprimé dans les tissus tumoraux de sein et que la surexpression de la protéine FLAG-GABARAPL1-6HIS dans les cellules MCF-7 diminue considérablement leur croissance. De plus, une forte expression de gabarapl 1 est corrélée à une augmentation de la survie de patientes atteintes de cancer du sein avec envahissement ganglionnaire. / The GABARAPL1 (GABARAP like 1) protein, also named GECl (Glandular Epithelial Cell 1), displays a high percentage of identity with the GABARAP (GABAA Receptor-Associated Protein), GATE-16 (Golgi-Associated A TPase Enhancer of 16 kDa) and Atg8 (Autophagy-related 8) proteins, and a lesser identity with LC3 (Light Chain 3) family of proteins. The GABARAPL1 protein is expressed in ail tissues, predominantly in the central nervous system and is involved in intracellular transport of GABAA receptors (Gamma-AminoButyric Acid type A receptor) and KOR (K Opioid Receptor). In addition, a Iow expression of the gabarap1 gene was shown in various cancer cell lines, suggesting its involvement in the genesis and/or progression oftumors. The search for GABARAPL 1 prote in partners has Ied to the identification of different proteins. The interaction between GABARAPL1 and the protein partner: HSP90 (Heat Shock Protein 90) was studied in rat brain and MCF-7 cells, in which we showed that HSP90 protects GABARAPL1 from degradation by the proteasome. Additionally, it was established that during autophagy, GABARAPL1 is cleaved to its mature form and conjugated to phospholipids. lt then co-localizes partially with lysosomes and autophagosomes. We also demonstrated that gabarap!J is weakly expressed in breast tumor tissues and that overexpression of the FLAG­GABARAPL1-6HIS recombinant protein in MCF-7 cells significantly reduces their growth. Finally, a strong expression of gabarap1 is correlated with increased survival of patients with lymph node-positive breast cancer.

Le gène gec1/gabarapl1 (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identifié au sein de notre équipe, est un gène apparenté à la famille atg8 (autophagy related gene 8) et  la  sous-­‐famille  gabarap  (GABAA  receptor  associated  protein)  incluant  les  gènes  gabarap, gabarapl1, gabarapl2 et gabarapl3. Les protéines codées par ces gènes présentent de très fortes identités de séquences et des structures similaires. Le gène gabarapl1 est exprimé préférentiellement dans le SNC dans lequel il est le transcrit de la famille atg8 le plus fortement exprimé. Des études fonctionnelles ont démontré que la protéine GABARAPL1 intervient dans le trafic intracellulaire de récepteurs, et plus particulièrement  du  récepteur  GABAA  et  du  récepteur  aux  κ-­‐opioïdes,  via  son  interaction avec les microtubules. Cependant, le rôle de cette protéine ne se limite probablement  pas  au  seul  transport  de  ces  récepteurs.  Notre  équipe  a  d’ailleurs  récemment démontré que GABARAPL1 est impliquée dans le processus d’autophagie, un mécanisme de dégradation cellulaire. Dans  le  cadre  de  ma  thèse,  j’ai  eu  trois  objectifs :  (1)  l’étude  de  la  spécificité  d’anticorps anti-­‐GABARAPL1 commerciaux disponibles, (2) la cartographie détaillée de l’expression de GABARAPL1 dans le cerveau murin et (3) l’étude de la surexpression de GABARAPL1 dans un modèle neuronal in vitro en conditions de stress mitochondriaux. Etant donné la forte homologie entre GABARAPL1 et GABARAP, aucun anticorps spécifique  commercial  n’était  disponible  lorsque  nous  avons  débuté  mon  projet  de  recherche. Nous avons donc, dans un premier temps, étudié la spécificité des différents anticorps commerciaux anti-­‐GABARAPL1 disponibles et identifié un anticorps capable de détecter de façon spécifique cette protéine in vitro et in vivo. Grâce  à  cet  anticorps  spécifique,  nous  avons  ensuite  entrepris  l’étude  de  l’expression in vivo de la protéine GABARAPL1 dans le SNC de souris chez l’adulte et au cours du développement embryonnaire. Nous avons ainsi démontré que GABARAPL1 est exprimée dans les neurones immatures et les fibres neuronales à partir du 11e jour de  développement  et  son  expression  augmente  progressivement  jusqu’à  un  taux  maximal observé chez l’adulte. Chez l’adulte, GABARAPL1 est exprimée uniquement dans  les  neurones  et  plus  particulièrement  dans  ceux  impliqués  dans  les  fonctions  motrices et neuroendocrines. De plus, nous avons noté que le marquage ponctiforme de  GABARAPL1  co-­‐localise  partiellement  avec  p62  dans  des  cultures  neuronales  primaires, confirmant son association aux vésicules autophagiques in vivo. Pour caractériser la fonction cellulaire de GABARAPL1, nous avons surexprimé cette protéine dans des cellules neuronales SK-­‐N-­‐BE(2). L’étude de ce nouveau modèle neuronal a montré que la surexpression de DsRed-­‐GABARAPL1 semble potentialiser la réponse  autophagique  des  cellules,  ce  qui  permet  une  induction  plus  précoce  suite  à  des traitements induisant l’autophagie. De plus, la surexpression de GABARAPL1 inhibe la mort des cellules soumises à des stress ciblant les mitochondries (CCCP), ce qui  suggère  que  GABARAPL1  pourrait  protéger  les  neurones  contre  certains  stress  aggravant la progression des maladies neurodégénératives. L’ensemble  de  ces  travaux  a  permis  d’identifier  un  outil  spécifique  à  l’immunodétection de GABARAPL1, de cartographier son expression dans le SNC murin au cours du développement et chez l’adulte et finalement, de démontrer un rôle protecteur  de  GABARAPL1  contre  la  mort  neuronale  induite  par  un  stress  mitochondrial. / The gec1/gabarapl1 gene (glandular epithelial cell 1/gabarap like 1), identified within our team, is a gene related to the atg8 (autophagy related gene 8) family and the gabarap  (GABAA  receptor-­‐associated  protein)  subfamily  of  genes  including  gabarap,  gabarapl1, gabarapl2 and gabarapl3. The protein products of these genes present a very  strong  sequence  identity  and  are  structurally  similar.  The  gabarapl1  gene  is  expressed preferentially in the central nervous system, in which it is the most highly expressed  transcript  of  the  atg8  family.  Functional  studies  have  shown  that  the  GABARAPL1 protein is involved in intracellular trafficking of receptors, in particular the  GABAA  receptor  and  the  κ-­‐opioid  receptor,  via  its  interaction  with  cytoskeletal  elements. The role of this protein, however, is clearly not limited to the transport. Our team has also recently shown that GABARAPL1 is involved in the autophagic process, a cellular degradation mechanism. My  thesis  objectives  were  three-­‐tiered:  (1)  the  study  of  the  specificity  of  anti-­‐GABARAPL1 antibodies, (2) the detailed mapping of GABARAPL1 expression in the mouse  brain  and  (3)  the  study  of  GABARAPL1  overexpression  under  conditions  of  mitochondrial stress in an in vitro neuronal model. Given the high homology between GABARAPL1 and GABARAP, no commercially available  specific  antibody  was  available  when  we  started  my  research  project.  As  such, we conducted a study on the specificity of different commercially available anti-­‐GABARAPL1 antibodies and identified an antibody that specifically recognized this protein in vitro and in vivo experiments. With this specific antibody, we then undertook a study of the in vivo expression of the GABARAPL1 protein in the adult mouse central nervous system and throughout embryonic development. In this study, we demonstrate that GABARAPL1 is expressed in immature neurons and neural fibers in the embryo from the 11th day of embryonic development and its expression gradually increases to a maximum in adults. In adults, GABARAPL1 is expressed in neurons, in particular, in those involved in motor control and  neuroendocrine  functions.  The  punctate  labeling  of  GABARAPL1  partially  co-­‐localizes with p62 in primary neuronal cultures, confirming its association with autophagic vesicles in vivo. To  characterize  the  cellular  function  of  GABARAPL1,  we  overexpressed  this  protein in neuronal SK-­‐N-­‐BE (2) cells. The study of our neuronal cell model revealed that  overexpression  of  DsRed-­‐GABARAPL1  appears  to  prime  cells  for  autophagy,  resulting in an earlier induction of autophagy after treatments that induce this processes.  In  addition,  overexpression  of  this  protein  delays  cell  death  in  a  CCCP-­‐induced mitochondrial stress model, suggesting that GABARAPL1 could protect neurons  against  certain  stresses  known  to  contribute  to  the  development  of  neurodegenerative diseases. Together,  this  work  has  identified  a  specific  tool  for  the  immunodetection  of  GABARAPL1, produced a detailed map of GABARAPL1 expression in the developing and  adult  murine  central  nervous  system  and  finally,  demonstrated  a  protective  role  for GABARAPL1 against neuronal death induced by mitochondrial stress.

Le gène Gec1/Gabarapl1 a été identifié au sein de notre laboratoire comme un gène régulé par les estrogènes. Il appartient à la famille Gabarap incluant les gènes Gabarap, gabarap/2 et Gabarapl3 qui codent des protéines présentant de fortes homologies de séquences. L'étude fonctionnelle de Gabarapl 1 a montré que cette protéine est impliquée dans le transport des récepteurs et particulièrement les récepteurs Gabaₐ et des κ-opioïdes via son interaction avec la tubuline et la protéine NSF. Cependant, il a été décrit que certaines protéines de la famille Atg8 sont impliquées dans l' autophagie, un mécanisme de dégradation et de survie cellulaire, qui se caractérise par la formation de doubles membranes appelées autophagosomes. Les objectifs de mon travail étaient, d'une part, de caractériser le rôle de la protéine GABARAPL1 au cours de !'autophagie et, d'autre part, de caractériser son expression dans des lignées et tissus cancéreux et sa régulation en réponse à des composés anti-cancéreux. Tout d'abord, nous avons montré que Gabarapl1 est clivée par la protéase Atg4B au niveau de sa glycine 116 avant sa conjugaison à des phopholipides. Cette forme modifiée, lipidée, est localisée à la surface des autophagosomes et des lysosomes. Nous avons ensuite montré que Gabarapl1 est faiblement exprimée dans de nombreuses lignées cancéreuses, que son expression est altérée dans les méningiomes et qu'elle est régulée par des inhibiteurs du protéasome. Ces travaux ont montré, pour la première fois, que la protéine Gabarapl1 est associée à des vésicules autophagiques et permettront de poser les hypothèses de nos futurs travaux. / The Gec1 / Gabarapl1 gene was identified in our laboratory as an early estrogen regulated gene. Gabarapl1 belongs to the Gabarap family, also including Gabarap, Gabarapl2 and Gabarapl3 genes, that encode proteins which present high sequence homology with each other. A functional study of the Gabarapl 1 protein showed that this protein is involved in the transport of receptors such as the Gabaₐ and κ-opioid receptors via its interaction with tubulin and NSF. It has been reported that the Atg8 family proteins are involved in autophagy, a mechanism of degradation and cell survival that is charactenzed by the formation of double membranes called autophagosomes. The aims of my research were, firstly, to characterize the role of the Gabarapl1 protein during autophagy and, secondly, to study its expression in cancer cell lines and cancerous tissues and its regulation in response to anti-cancer drugs. First, we showed that Gabarapl1 is cleaved in the cells by the protease Atg4B at its 116 glycine residue prior to its conjugation to phospholipids. This modified form, lipidated, is located on the surface of autophagosomes and lysosomes. We then showed that Gabarapl1 expression is reduced in many cancer cell lines, and that its expression is also altered in meningiomas. Finally, we showed that Gabarapl1 expression is regulated by proteasom€: inhibitors. Thus, our results demonstrated for the first time that the Gabarapl1 protein is associatec with autophagie vesicles and allow us to propose hypothesis for future work

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Glycogen, a branched polymer of glucose, acts as an intracellular carbon and energy reserve in many tissues and cell types. The breakdown of glycogen by hormonally regulated degradation involving the coordinated action of glycogen phosphorylase and debranching enzyme has been well studied. However, the importance of lysosomal disposal of glycogen has been underscored by a glycogen storage disorder, Pompe disease. This disease destroys tissues by over-accumulating glycogen in lysosomes due to a genetic defect in the lysosomal acid α-glucosidase. Details of the intracellular trafficking of glycogen are not well understood. Starch-binding domain-containing protein 1 (Stbd1) is a protein of previously unknown function with predicted hydrophobic N-terminus and C-terminal CBM20 carbohydrate binding domain. The protein is highly expressed in the liver and muscle, the major repositories of glycogen. Stbd1 binds to glycogen in vitro and in vivo with a preference for less branched and more phosphorylated polysaccharides. In animal models, the protein level of Stbd1 correlates with the genetic depletion of glycogen. Endogenous Stbd1 is found in perinuclear compartments in cultured mouse and rat cells. When over-expressed in cells, Stbd1 accumulates and coincides with glycogen and GABARAPL1, the autophagy protein. They form enlarged perinuclear structures which are abolished by removing the hydrophobic N-terminus of Stbd1. Stbd1, with point mutations in the CBM20 domain, retains the perinuclear localization but without concentration of glycogen in this compartment. In cells that are stably over-expressing glycogen synthase, glycogen exists as large perinuclear deposits, where Stbd1 can also be present. Removing glucose from the culture leads to a breakdown of the massive glycogen accumulation into numerous smaller and scattered deposits which are still positive for Stbd1. Furthermore, the autophagy protein GABARAPL1 co-immunoprecipates and co-localizes with Stbd1 when co-expressed in cells. Point mutation or deletion of the autophagy protein interacting region on Stbd1 eliminates the interaction and co-localization with GABARAPL1 but not the characteristic perinuclear distribution of Stbd1. We propose that Stbd1 is involved in glycogen metabolism. In particular, it participates in the vesicular transfer of glycogen to the lysosome with the recruitment of autophagy related proteins GABARAPL1 and/or GABARAP, as these vesicles mature prior to lysosomal fusion.