Die retinale in vivo Bildgebung gewann in den letzten 2 Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung. Es fehlt aber häufig die Korrelation der in vivo erstellten quasi „histologischen“ Aufnahmen mit der tatsächlichen Histologie. An der Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde des Universitätsklinikums Würzburg wurde ein standardisiertes System zur vergleichenden in vivo/ex vivo und histologischen retinalen Bildgebung des menschlichen Auges etabliert. In der vorliegenden „proof of concept study“ konnte der Arbeitsablauf erfolgreich gezeigt werden. Es wurden Abläufe geschaffen, die die ex vivo multimodale retinale Bildgebung analog zur in vivo Bildgebung an denselben Geräten ermöglichen. Die histologische Aufarbeitung des Gewebes erfolgt im Anschluss und ermöglicht die Korrelation von technisch gefundenen Veränderungen mit lichtmikroskopisch beschriebenen Auffälligkeiten. Diese histologischen Korrelate tragen zum besseren Verständnis von in vivo gefundenen Veränderungen bei. Gleichzeitig verbessern neu gefundene Auffälligkeiten in der in vivo Bildgebung das Verständnis und Früherkennung vieler retinaler Erkrankungen. Die Vorteile exzellent konservierter, aufbereiteter und histologisch untersuchter Proben wurde hier am Beispiel der CNTF-Expression dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Zytokin insbesondere bei neovaskulärer AMD in den Fotorezeptoraußensegmenten exprimiert wird. / Retinal in vivo imaging has become increasingly important over the past two decades. However, there is often no correlation between the almost histological image quality made in vivo and the actual histology. A standardized system for comparing in vivo/ex vivo and histological retinal imaging of the human eye was established at the “Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde des Universitätsklinikums Würzburg”. In this "proof of concept study" the workflow could be successfully demonstrated. Procedures were created that enable ex vivo multimodal retinal imaging analogous to in vivo imaging on the same devices. The histological processing of the tissue is then carried out and enables the correlation of technically found changes with abnormalities described by light microscopy. These histological correlations contribute to a better understanding of changes found in vivo. At the same time, newly found abnormalities in in vivo imaging improve the understanding and early detection of many retinal diseases. The advantages of excellently preserved, processed and histologically examined samples were presented here using CNTF expression as an example. It could be shown that this cytokine is expressed in the photoreceptor outer segments, particularly in neovascular AMD.

Neurotrophic factor signaling modulates differentiation, axon growth and maintenance, synaptic plasticity and regeneration of neurons after injury. Ciliary neurotrophic factor (CNTF), a Schwann cell derived neurotrophic factor, has an exclusive role in axon maintenance, sprouting and synaptic preservation. CNTF, but not GDNF, has been shown to alleviate motoneuron degeneration in pmn mutant mice carrying a missense mutation in Tbce gene, a model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). This current study elucidates the distinct signaling mechanism by which CNTF rescues the axonal degeneration in pmn mutant mice. ... / Neurotrophe Faktoren beeinflussendie die neuronale Differenzierung, das Wachstum und die Stabilisierung von Axonen sowie Synaptische Plastizität und die Regeneration von Neuronen nach Verletzung. Der von Schwannzellen synthetisierte neurotrophe Faktor Ciliary neurotrophic factor (CNTF) spielt eine wichtige Rolle bei der axonalen Erhaltung sowie bei der Induktion und Reduktion von axonalen Verzweigungen. Die Behandlung der pmn Mausmutante mit CNTF, aber nicht mit GDNF führt zu einem späteren Krankheitsbeginn und verminderten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Diese Mausmutante, die eine Punktmutation im Tbce Gen trägt, dient als Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die zugrunde liegenden Signalkaskaden aufzudecken, die den CNTF-vermittelten Effekt auf den Krnakheitsverlauf bei der pmn Maus verursachen. ...

1. Zusammenfassung Während der Embryogenese und nach Verletzungen von Nerven regulieren neurotrophe Faktoren Signalwege für Apoptose, Differenzierung, Wachstum und Regeneration von Neuronen. In vivo Experimente an neugeborenen Nagern haben gezeigt, dass der Verlust von Motoneuronen nach peripherer Nervenläsion durch die Behandlung mit GDNF, BDNF, und CNTF reduziert werden kann In der pmn-Mausmutante, einem Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose, führt die Gabe von CNTF, nicht aber von GDNF zu einem verzögerten Krankheitsbeginn und einem verlangsamten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Auslöser der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus ist eine Mutation im Tubulin spezifischen Chaperon E (Tbce) Gen, das für eines von fünf Tubulin spezifischen Chaperonen (TBCA-TBCE) kodiert und an der Bildung von -Tubulinheterodimeren beteiligt ist. Diese Arbeit sollte dazu beitragen, die CNTF-induzierten Signalwege zu entschlüsseln, die sich lindernd auf den progredienten Verlauf der Motoneuronendegeneration in der pmn-Maus auswirken. Primäre pmn mutierte Motoneurone zeigen ein reduziertes Axonwachstum und eine erhöhte Anzahl axonaler Schwellungen mit einer anomalen Häufung von Mitochondrien - ein frühes Erkennungsmerkmal bei ALS-Patienten. Die Applikation von CNTF nicht aber von BDNF oder GDNF, kann in vitro die beobachteten Wachstumsdefekte und das bidirektionale axonale Transportdefizit in pmn mutierten Motoneurone verhindern. Aus älteren Untersuchungen war bekannt, dass CNTF über den dreiteiligen transmembranen Rezeptorkomplex, bestehend aus CNTFR, LIFR und gp130, Januskinasen aktiviert, die STAT3 an Tyrosin 705 phosphorylieren (pSTAT3Y705). Ich konnte beobachten, dass axonales fluoreszenzmarkiertes pSTAT3Y705 nach CNTF-Gabe nicht retrograd in den Nukleus transportiert wird. Stattdessen führt die CNTF-induzierte Phosphorylierung von STAT3 an Tyrosin 705 zu einer transkriptionsunabhängigen lokalen Reaktion im Axon. Diese pSTAT3Y705 abhängige Reaktion ist notwendig und ausreichend, um das reduzierte Axonwachstum pmn mutierter Motoneurone zu beheben. Wie die Kombination einer CNTF Behandlung mit dem shRNA vermittelten knock-down von Stathmin in pmn mutierten Motoneuronen zeigt, zielt die CNTF-STAT3 Signalkaskade auf die Stabilisierung axonaler Mikrotubuli ab und wirkt sich positiv auf die anterograde und retrograde Mobilität von axonalen Mitochondrien aus. Interessanter Weise konnte ich außerdem feststellen, dass eine akute Gabe von CNTF das mitochondriale Membranpotential in Axonen primärer pmn mutierter und wildtypischer Motoneurone erhöht und einen Anstieg von ATP auslöst. Meine Beobachtungen legen nahe, dass CNTF unerwarteter Weise auch eine transiente Phosphorylierung an STAT3 Serin 727 (pSTAT3S727) auslöst, die zur anschließenden Translokation von pSTAT3S727 in Mitochondrien führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass STAT3 mehrere lokale Ziele im Axon besitzt, nämlich axonale Mikrotubuli und Mitochondrien. / 2. Summary Both during development and after injury neurotrophic factors induce signaling pathways that regulate apoptosis, differentiation, growth and regeneration of neurons. In newborn rodents, treatment with GDNF, BDNF and CNTF can reduce the loss of motoneurons after peripheral nerve lesion. In the pmn mutant mouse, a model for amyotrophic lateral sclerosis, CNTF but not GDNF delays disease onset and slows down the course of motoneurons degeneration. Pmn mutant mice, suffer from a point mutation in tubulin specific chaperon E (Tbce) gene that codes for one of five tubulin specific chaperones (TBCA-TBCE) and is necessary for proper -tubulin heterodimer formation. The work presented here was designed to study the specific signaling pathways that are used by CNTF for attenuating progression of motoneuron degeneration in pmn mutant mice. Primary motoneurons from pmn mutant mice show reduced axon growth and irregular axonal swellings with abnormal accumulation of mitochondria – an early hallmark of pathology in ALS patients. In vitro, CNTF but not BDNF or GDNF was able to rescue defective axon growth and to prevent bidirectional transport interruption. It has already been shown that CNTF acts via the tripartite transmembrane receptor complex, composed of CNTFR, LIFR and gp130 to recruit Janus kinases that subsequently phosphorylate STAT3 on tyrosine 705 (pSTAT3Y705). After application of CNTF, I observed that axonal pSTAT3Y705 fused to a fluorescent tag is not retrogradely transported to the nucleus. In contrast, CNTF induced phosphorylation of STAT3 at tyrosine 705 leads to a transcriptional independent local reaction in motor axons which is necessary and sufficient to rescue axon growth in pmn mutant motoneurons. Combining CNTF treatment with shRNA mediated knock-down of Stathmin in pmn mutant motoneurons shows that CNTF-STAT3 signaling leads to microtubule stabilization in axons as well as improving anterograde and retrograde mobility of axonal mitochondria. Interestingly, I additionally found that an acute application of CNTF increases the membrane potential of axonal mitochondria that is accompanied with a rise of ATP levels in pmn mutant and wildtype motoneurons. Unexpectedly, I found STAT3 phosphorylated on serine 727 co-localizing with mitochondria after CNTF application. These results demonstrate that multiple local targets of STAT3 exist in axons that modulate structure and function of microtubules and mitochondria.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2001. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 111-122).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2008. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 86-111).

Als Therapieversuch bei Plexusläsionen wird die Replantation ausgerissener Vorderwurzelfasern durchgeführt. Voraussetzung für die erfolgreiche Regeneration von Motoneuronaxonen sind 1. Überleben einer ausreichenden Anzahl von Motoneuronen 2. erfolgreiche Wiederherstellung der Kontuität ausgerissener Axone mit dem Rückenmark und 3. funktionelle Hochwertigkeit regenerierter Axone. Neurotrophe Faktoren können Überleben und Regenerationsfähigkeit von Motoneuronen fördern. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Analyse des Einflusses von CNTF und BDNF auf die Regeneration von Motoneuronaxonen nach Ausriss und Replantation im Segment C7 nach einer Überlebenszeit von 3 Wochen bzw. 6 Monaten. Vervollständigt wurden diese Untersuchungen durch detaillierte morphologische Analysen von Spinalganglien, durchtrennter Hinterwurzel und verletztem Hinterhorn. In verschiedenen Gruppen von adulten Kaninchen wurden CNTF, BDNF, oder beide Faktoren auf die ventrolaterale Replantationsstelle appliziert, Kontrollen wurden ohne Faktor belassen (n>5). Die Überlebenszeit der Versuchstiere lag bei 3 Wochen (n=3 Kontrollen) und 6 Monaten (n=27). Aus dem perfundiertem Gewebe wurden Semidünnschnitte durch Vorderwurzel/Spinalganglien und Kryostatserienschnitte durch das Segment C7 angefertigt. DiI-Fluoreszenztracing, Markscheidenfärbung, eine modifizierte Klüver-Barrera-Färbung der Kryostatschnitte sowie eine Touloidinblaufärbung der Semidünnschnitte ermöglichte die morphologische und morphometrische Analyse des Gewebes. Die Anzahl der überlebenden Motoneurone lag nach sechs Monaten bei allen Versuchsgruppen bei etwa 30%. Fluoreszenz-Tracing und Markscheidenfärbungen von Serienschnitten zeigten, dass Axone sowohl über die ursprünglichen ventralen Austrittstellen als auch über die ventrolaterale Replantationsstelle das Rückenmark verließen und im Bereich des Spinalganglions eine kompakte Vorderwurzel bildeten. Ventral austretende Axone zeigten signifikant größere Durchmesser als lateral austretende. Ausmaß und Art der Regeneration waren interindividuell unterschiedlich, die besten Ergebnisse zeigte die Replantation nah am ursprünglichen Austrittsort der Vorderwurzel. Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht deutlich. In Semidünnschnitten durch die regenerierte Vorderwurzel fanden sich nach drei Wochen kaum intakte, myelinisierte Axone, nach sechs Monaten war die Zahl der Axone auf etwa 45% der Zahl der gesunden Seite angestiegen. Regenerierte Axone waren dünn, typische Motoneuronaxone stellten nur einen kleinen Teil der regenerierten Axone. Gruppenunterschiede fanden sich im Axon-Myelinverhältnis, das bei Kontrollen der replantierten Seiten signifikant erniedrigt war. Diese Erniedrigung war noch vorhanden, jedoch nicht mehr signifikant bei Tieren, die mit CNTF- und BDNF-behandelt wurden. Die replantierten Vorderwurzeln der CNTF+BDNF-Gruppe zeigte überwiegend eine signifikant bessere Myelinisierung als die replantierten Kontrollen. An der früheren Hinterwurzeleintrittszone am Rückenmark wurden in Tieren mit geringem Verletzungsausmaß kleine ZNS-Gewebsprotrusionen beobachtet, in denen sich myelinisierte Axone befanden. Diese Axone zeigten eine Wachstumsrichtung in die Peripherie, was auf eine Sprossung der sensorischen Rückenmarksneurone schließen lässt. Innerhalb des Spinalganglions waren Neuron- und Axondichte auf den verletzten Seiten nicht wesentlich verändert. Eine leichte Abnahme des relativen Anteils großer Neurone und Axone wurde in den verletzten Seiten der Kontrollgruppe beobachtet. Für Axone war diese Abnahme statistisch signifikant. Im Gegensatz dazu war dies in Tieren, die mit neurotrophen Faktoren behandelt wurden, nicht zu beobachten. Bei allen Tieren zeigte sich ein beträchtliches Auswachsen von Hinterwurzelaxonen aus dem Spinalganglion. Diese Axone fanden keine spontane Verbindung mit dem proximalen Rest der Wurzel, sondern waren durch Bindegewebe eingehüllt. Bei etwa der Hälfte der Tiere zeigte sich, dass einer Untergruppe dieser Axone in Richtung des Narbengewebes der replantierten Vorderwurzel gewachsen war und über Defekte in der Bindegewebshülle teilweise sogar in die Vorderwurzel einwuchsen. Ein möglicher Einfluss der applizierten neurotrophen Faktoren auf das quantitative Regenerationsergebnis scheint also in diesem Modell gering zu sein. Auf eine qualitative Verbesserung deutet die Normalisierung des Axon-Myelinverhältnisses großer regenerierter Axone bei Kombinationsbehandlung hin. Die im vorliegenden Modell beträchtliche Regenerationskapazität der Hinterwurzel scheint bisher unterschätzt worden zu sein. Das unerwartete Einwachsen von Hinterwurzelaxonen in die Vorderwurzel könnte mit einer funktionellen Beeinträchtigung der regenerierten Vorderwurzel verbunden sein. / Treatment of brachial plexus lesions is attempted by surgical replantation of avulsed nerve roots. Prerequisites for successful regeneration of motoneuron axons are 1. survival of a large number of motoneurons, 2. restoration of connectivity between avulsed nerve roots and spinal cord and 3. high quality of regenerated axons. Regeneration and survival of motoneurons can be supported by neurotrophic factors. In the present study, the influence of CNTF and BDNF on regeneration of motoneurons after C7 ventral root avulsion and replantation after 3 weeks and 6 months was analysed. Additionally, detailed morphological analyses of dorsal root ganglia (DRG), severed dorsal roots and injured dorsal horns were performed. In adult rabbits C7 dorsal roots were severed, ventral roots were avulsed and replanted ventrolaterally. CNTF, BDNF, or both was applied to the replantation site, controls were replanted without application of neurotrophic factors (n>5). After 3 weeks (n= 3 controls) and 6 months (n= 27) after avulsion and replantation semi-thin sections of ventral roots and DRGs as well as cryostat serial sections from C7 spinal cord segment were prepared. DiI-fluorescence tracing, myelin-sheath staining, modified Klüver-Barrera staining of cryostat section and touloidinblue staining of semi-thin sections served for morphological and quantitative analyses. Six months after lesion, a survival of 30% of the C7 motoneurons was found without differences between the experimental groups. Retrograde fluorescent tracing and histological analysis documented that many axons had regrown through the original ventral exit zones or had exited the spinal cord at the lateral replantation site. However, many laterally exiting axons had not grown out directly from the ventral horn through the lateral white matter but had elongated vertically before leaving the spinal cord. The mean axonal diameter was significantly higher in regenerated axons that had exited through the original ventral exit zones in comparison with axons which had grown out laterally. Application of BDNF and/or CNTF did not show any effects on the pathways of regeneration into the replanted root. Three weeks after ventral root avulsion and replantation the number of axons was rare. After six months, the number of myelinated axons increased to 45% compared to unlesioned sides. Regenerated axons were mainly of small caliber with few axons showing typical properties of motoneuron axons. In controls myelination was significantly reduced compared to the unlesioned sides. This was not observed after CNTF, BDNF and CNTF+BDNF treatment. In CNTF+BDNF treated animals myelination was significantly increased compared to replanted controls in the majority of cases. At the dorsal root entry zone, small myelinated axons extended into central tissue protrusions, in cases with well-preserved morphology. This suggested sprouting of spinal neuron processes into the central dorsal root remnant. In lesioned DRGs, the density of neurons and myelinated axons was not significantly altered, but a slight decrease in the relative frequency of large neurons and an increase of small myelinated axons was noted (significant for axons). Unexpectedly, differences in the degree of these changes were found between control and neurotrophic factor-treated animals. Central axons of DRG neurons formed dorsal root stumps of considerable length which were attached to fibrous tissue surrounding the replanted ventral root. In cases where gaps were apparent in dorsal root sheaths, a subgroup of dorsal root axons entered this fibrous tissue. Continuity of sensory axons with the spinal cord was never observed. Some axons coursed ventrally in the direction of the spinal nerve. In summary, the number of surviving motoneurons and regenerating axons appeared not to be influenced by a single- dose application of neurotrophic factors in this model. However, improvement of myelination indicated that the quality of regeneration can be increased especially by CNTF+BDNF- treatment. Moreover, the considerable capacity of dorsal root regeneration we observed in this study has possibly been underestimated previously. The unexpected ingrowth of dorsal root axons into the regenerated ventral roots could be harmful for ventral root regeneration.

In this study I investigate the role of Schwann cell and axon-derived trophic signals as modifiers of axonal integrity and sprouting in motoneuron disease and diabetic neuropathy (DNP). The first part of this thesis focuses on the role of the Schwann-cell-derived ciliary neurotrophic factor (CNTF) for compensatory sprouting in a mouse model for mild spinal muscular atrophy (SMA). In the second part, the role of the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and its binding protein 5 (IGFBP-5) is examined in the peripheral nerves of patients with DNP and in two corresponding mouse models. Proximal SMA is caused by homozygous loss or mutation of the SMN1 gene on human chromosome 5. The different forms of SMA can be divided into four groups, depending on the levels of SMN protein produced from a second SMN gene (SMN2) and the severity of the disease. Patients with milder forms of the disease, type III and type IV SMA, normally reach adulthood and regularly show enlargement of motor units, signifying the reinnervation of denervated muscle fibers. However, the underlying mechanisms are not understood. Smn+/- mice, a model of type III/IV SMA, are phenotypically normal, but they reveal progressive loss of motor neurons and denervation of motor endplates starting at 4 weeks of age. The progressive loss of spinal motor neurons reaches 50% at 12 months but muscle strength is not reduced. The first evidence for axonal sprouting as a compensatory mechanism in these animals was the more than 2-fold increase in amplitude of single motor unit action potentials (SMUAP) in the gastrocnemius muscle. Confocal analysis confirmed pronounced sprouting of innervating motor axons. As CNTF is highly expressed in Schwann cells and known to be involved in sprouting, its role for this compensatory sprouting response and the maintenance of muscle strength in Smn+/- mice was investigated. Deletion of CNTF in this mouse model results in reduced sprouting and decline of muscle strength in Smn+/- Cntf-/- mice. These findings indicate that CNTF is necessary for a sprouting response and thus enhances the size of motor units in skeletal muscles of Smn+/- mice. DNP afflicting motor and sensory nerve fibers is a major complication in diabetes mellitus. The underlying cellular mechanisms of motor axon degeneration are poorly understood. IGFBP-5, an inhibitory binding protein for IGF-1, is highly upregulated in peripheral nerves in patients with DNP. The study investigates the pathogenic relevance of this finding in transgenic mice overexpressing IGFBP-5 in motor axons. These mice develop motor axonopathy similar to that seen in DNP. Motor axon degeneration is also observed in mice in which the IGF-1 receptor (IGF-1R) was conditionally depleted in motoneurons, indicating that reduced activity of IGF-1 on IGF-1R in motoneurons is responsible for the observed effect. These data provide evidence that elevated expression of IGFBP-5 in diabetic nerves reduces the availability of IGF-1 for IGF-1R on motor axons leading to progressive neurodegeneration, and thus offers novel treatment strategies. / In dieser Arbeit habe ich die Rolle der neurotrophen Faktoren Ciliary neurotrophic factor (CNTF) und Insulin-like-growth factor 1 (IGF-1), die in Schwannzellen gebildet werden, als Modulatoren der axonalen Integrität bei einer degenerativen Motoneuronenerkrankung und bei diabetischer Neuropathie (DNP) untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wird gezeigt, dass CNTF für ein kompensatorisches Sprouting von motorischen Axonen in einem Mausmodell für spinale Muskelatrophie (SMA) verantwortlich ist. Im zweiten Teil wird die Rolle von IGF-1 und dessen Bindeprotein, IGFBP-5, in Axonen motorischer Nerven bei Patienten mit DNP und zwei korrespondieren Mausmodellen gezeigt. Die proximale SMA wird durch einen homozygoten Verlust oder Mutation des SMN1 Gens auf dem Chromosom 5 verursacht. Bei der spinalen Muskelatrophie unterscheidet man verschiedene Schweregrade, abhängig von der Menge an SMN Protein, das vom zweiten SMN Gen (SMN2) produziert werden kann. Patienten mit einer milderen Form von SMA (Typ III und IV) erreichen das Erwachsenenalter und zeigen oft vergrößerte motorische Einheiten, im Gegensatz zu Patienten mit den schweren kindlichen Formen der Erkrankung. Smn+/- Mäuse, ein Modell für die leichten SMA Formen Typ II und IV, zeigen denervierte Endplatten bereits 4 Wochen nach der Geburt und einen fortschreitenden Verlust von Motoneuronen, der nach 12 Monaten mehr als 50% beträgt, ohne dass sich die Muskelkraft der Tiere verringert. Die Amplitude der Summenpotenziale von einzelnen motorischen Einheiten (Single motor unit action potential, SMUAP) im Wadenmuskel ist mehr als 2-fach erhöht. Konfokale Aufnahmen bestätigen ausgeprägtes Sprouting der noch innervierenden Axone. Smn+/- Mäuse ohne CNTF, das normalerweise stark in Schwann-Zellen exprimiert ist, zeigen reduziertes Sprouting und verringerte Muskelkraft. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass CNTF für das Sprouting und die vergrößerten motorischen Einheiten in Smn+/- Mäusen verantwortlich ist. Dieser kompensatorische Mechanismus könnte neue Behandlungs-möglichkeiten für Motoneuronerkrankungen eröffnen. Die Diabetische Neuropathie (DNP), eine der Hauptkomplikationen bei Diabetes Mellitus, betrifft sowohl motorische als auch sensorische Nervenfasern. Die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen, die zur Degeneration motorischer Axone in Spätstadien der Erkrankung führen, sind größtenteils noch ungeklärt. IGFBP-5, ein IGF-1 hemmendes Bindeprotein, ist in peripheren Nervbiopsien von DNP Patienten stark überexprimiert. Diese potenzielle pathogene Relevanz wurde bei IGFBP-5 überexprimierenden transgenen Mäusen untersucht. Diese Mäuse entwickeln ähnlich wie die DNP Patienten eine motorische Axonopathie. Diese Axondegeneration zeigen auch Mäuse, bei denen der IGF-1 Rezeptor (IGF-1R) neuronenspezifisch ausgeschaltet wurde. Das bedeutet, dass reduzierte Wirkung von IGF-1 am IGF-1R auf Axonen von Motoneuronen für die beobachtete Axonopathie verantwortlich ist. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass erhöhtes IGFBP-5 in diabetischen Nerven die Verfügbarkeit von IGF-1 für den IGF-1R reduziert und zu progressiver Neurodegeneration führt. Diese Erkenntnis könnte neue Behandlungsstrategien für Patienten mit DNP eröffnen.

Orientadores: Francesco Langone, Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:39:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AndreSchwambach_M.pdf: 3969141 bytes, checksum: 53eff5b5bbec953a73e9ddc63cd3ea39 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O Fator Neurotrófico Ciliar (CNTF) é uma neurocitocina com múltiplas atividades biológicas, sendo notável sua habilidade de proteger motoneurônios. Entretanto, a administração de CNTF leva à redução de peso corporal. Por outro lado, a administração do CNTF fusionado a um Domínio de Transdução de Proteínas (PTD), denominado TAT-CNTF, é capaz de proteger motoneurônios da medula espinhal axotomizados sem causar este efeito. O presente trabalho investigou se a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de TAT-CNTF produz os conhecidos efeitos catabólicos do CNTF. Para isso, ratos Wistar machos, com uma cânula crônicamente implantada no ventrículo lateral, foram distribuídos em quatro grupos: TAT-CNTF (2,5µg/8µl), CNTF (2,5µg/8µl), Leptina (LEP) (5µg/8µl) e PBS, que receberam uma infusão i.c.v. a cada 12h por 4 dias. O grupo tratado com TAT-CNTF apresentou menor perda de peso quando comparado aos grupos CNTF e LEP. As infusões i.c.v. de TAT-CNTF não reduziram o peso das gorduras retroperitonial (RP), epididimal (EP) e marrom interescapular (GM). O grupo CNTF apresentou redução do peso destas gorduras. Os grupos CNTF e LEP apresentaram aumento da fragmentação do DNA nas gorduras RP e EP. Por outro lado, o grupo TAT-CNTF não apresentou aumento da fragmentação do DNA nas amostras de RP, EP e GM. Um padrão de degradação internucleossomal do DNA e a presença de células TUNEL positivas foram detectados apenas nas gorduras dos animais dos grupos CNTF e LEP. Estes grupos também apresentaram aumento da expressão da UCP1 na GM, ao passo que o grupo TAT-CNTF não apresentou tal resultado. A análise da fosforilação da STAT3 no hipotálamo após uma única infusão i.c.v. de TAT-CNTF demonstrou, após 20 minutos, um efeito menor que o observado após infusão de CNTF. Em conclusão, nossos dados sugerem que o TAT-CNTF possui ação diferente do CNTF nas áreas hipotalâmicas envolvidas no controle da ingesta e do metabolismo / Abstract: The Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) is a neurocitokine with multiple biological activities, being notable its ability to protect lesioned motoneurons. However, administration of CNTF leads to reduction of body mass, while administration of CNTF fusioned with a Protein Transduction Domain (PTD), named TAT-CNTF, protects lesioned spinal motoneurons with no effects on body weight. In the present work, we investigated whether intracerebroventricular (i.c.v.) administration of TAT-CNTF would produce CNTF known catabolic effects. Male Wistar rats with a canula chronically implanted in the lateral ventricle were randomly assigned to four treatment groups: TAT-CNTF (2,5µg/8µl), CNTF (2,5µg/8µl), Leptin (LEP) (5µg/8µl) and PBS, that received an i.c.v. infusion every 12h for 4 days. TAT-CNTF treated group had a reduced weight loss when compared with CNTF and LEP groups. TAT-CNTF i.c.v. infusions did not reduce the weights of retroperitoneal (RP) and epididimal (EP) white adipose tissue, as well as interescapular brown adipose tissue (BAT) while CNTF i.c.v. administration reduced the weight of all these tissues. CNTF and LEP groups showed an increase of DNA fragmentation in RP and EP. On the other hand, TAT-CNTF group had no increase in DNA fragmentation in RP, EP and GM. A DNA ladder pattern and TUNEL positive cells could only be detected in adipose tissues from CNTF and LEP groups. CNTF and LEP treated groups had an increase in the expression of UCP1 in BAT, while TAT-CNTF treatment had no effects on UCP1 expression. An acute i.c.v. administration demonstrated that after 20 minutes TAT-CNTF induced less intense STAT3 phosphorilation in the hypothalamus when compared with CNTF acute infusions. In conclusion these data suggest that TAT-CNTF has a different action on hypothalamic areas involved in the control of food intake and energy metabolism / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Axonal degeneration is a major pathological feature of the central nervous system (CNS) inflammatory demyelinating disease multiple sclerosis (MS). This axonal degeneration has major consequences, as functional axonal regeneration in the CNS is largely absent. Cumulative axonal degeneration is the likely cause of the majority of progressive MS-related disability, and therefore, the need for novel neuroprotective therapies for MS exists. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS pathology, also produces axonal injury. In particular, the optic nerve and spinal cord are key sites of neuroinflammation in mouse EAE. By utilizing this model, the short term and long term effects of the putative neuroprotective cytokine, leukaemia inhibitory factor (LIF), were investigated in the optic nerve and spinal cord utilising a number of outcome measures of axonal dysfunction. These included MRI measures of water diffusivity along (ADC ||) and across (ADC┴) the optic nerves, serum levels of phosphorylated neurofilament heavy chain subunit (pNF-H) and histological morphometric measures. LIF treatment reduced EAE grade and pNF-H plasma levels, decreased ADC┴, but had no effect on ADC ||, axon counts or inflammatory infiltration. / In contrast, genetic deletion of LIF and its sister cytokine ciliary neurotrophic factor (CNTF), not only increased EAE grade and pNF-H levels, but also decreased optic nerve ADC|| and optic nerve and spinal cord axon densities. After reviewing current literature, we hypothesize that the target cell for endogenously upregulated LIF in EAE may be the neuron or axon, whereas the target cell for exogenously administered therapeutic LIF may be another cell type, possibly infiltrating macrophages and activated microglial cells. LIF antagonist treatment did not have any affect on EAE grade, pNF-H levels or MRI parameters. This lack of effect may be due to the inability of the LIF antagonist to enter the CNS, supporting the hypothesis that endogenous LIF has a centrally acting mechanism.

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_GustavoJorge_M.pdf: 2550633 bytes, checksum: 914361a57f5efd5794bcee99ff8ce2a4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Diabetes Mellitus (DM) é uma síndrome metabólica, de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia crônica, decorrente da falta de insulina, às vezes, associado à resistência dos tecidos periféricos a esse hormônio. O DM1 é caracterizado pela infiltração de macrófagos e linfócitos do tipo T-CD4+ e T-CD8+ no pâncreas, devido a uma falha do reconhecimento no sistema autoimune, que desencadeiam processos inflamatórios com liberação de óxido nítrico (NO), de radicais livres e de citocinas tais como: interleucina-1? (IL-1 ?) e Interferon- ? (IFN- ?). Essas citocinas pró-inflamatórias ativam mecanismos que levam a morte celular por apoptose, com perda da massa funcional das células beta. Esses mecanismos podem ser reproduzidos in-vitro pela exposição de células beta a essas citocinas ou à Aloxana. O CNTF é uma citocina de sobrevivência neuronal, e em células beta age sobre o controle glicêmico inibindo secreção de insulina e promovendo sobrevivência de ilhotas. A AMPK é uma proteína quinase que em células beta atua como um sensor do estado energético celular e, quando as concentrações intracelulares de ATP diminuem, a AMPK é ativada estimulando geração de ATP e inibindo o consumo desse nucleotídeo. Em ilhotas, a AMPK desempenha função importante na regulação da secreção de insulina sendo que a inibição de AMPK protege as células beta da apoptose mediada por citosinas (IL-1? e IFN-?) ou induzidas por células T do tipo CD8+ e CD4+. Diante do exposto, conclui-se que CNTF e AMPK desempenham funções importantes e correlatas nas células beta pancreáticas e, podem ser considerados alvos terapêuticos para o tratamento do DM tipo I. Contudo, a interação entre esses dois fatores (CNTF e AMPK) em células secretoras de insulina permanece desconhecida. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a possível papel da interação entre CNTF e AMPK na morte celular induzida pelos agentes diabetogênicos IL-1? e Aloxana. Nossos resultados indicaram que: A Aloxana e a IL-1? dependem da via da AMPK para induzir apoptose em células MIN6; O CNTF modula a via da AMPK em células MIN6 e ilhotas de camundongos Swiss neonato. O CNTF foi capaz de impedir a morte celular induzida por Aloxana e por IL-1? através da downregulation da via da AMPK em células MIN6. / Abstract: Diabetes Mellitus (DM) is a metabolic syndrome of multiple etiologies, resulting from the lack of insulin sometime associated with an increase in the resistance to the hormone by insulin-target tissues. DM1 is characterized by the infiltration of macrophages and T-type CD4 + and T-CD8 + cells in the pancreas, due to a failure of the autoimmune system, causing inflammation and leading to the release of nitric oxide (NO), free radicals, and cytokines such as interleukin-1? (IL-1?) and interferon-? (IFN-?). These pro-inflammatory cytokines activate pro-apoptotic mechanisms, triggering beta cell death apoptosis, leading to a loss in functional beta cell mass. These mechanisms may be reproduced in vitro with exposure of beta cells to pro-inflammatory cytokines such as IL-1? or to Alloxan. The cytokine CNTF is a neuronal survival factor. Besides, CNTF modulates glycemia, inhibiting insulin secretion and promoting islet cells survival. AMPK is a protein kinase that acts on pancreatic beta cells as a sensor of the cellular energy state, and is activated when the cellular ATP concentrations decrease, stimulating ATP generation and inhibiting ATP consumption. In islets, AMPK plays an important role in regulating insulin secretion and inhibition of AMPK protects beta cells from apoptosis mediated by either cytokines (IL-1? and IFN-?) and/or induced T cell CD8 + and CD4 +. AIMS: Given that, both CNTF and AMPK play important role in beta cells and may be used as therapeutic targets for the treatment of DM1. However, the interaction between these two factors (CNTF and AMPK) in pancreatic beta cells remains unknown. Thus, the objective of this work was to investigate the relationship between interaction of AMPK and CNTF on pancreatic beta cell death, induced by Alloxan or IL-1?. Our results indicated that both Alloxan and IL-1? are dependent of AMPK pathway to induce apoptosis in MIN6 cells; CNTF inhibits AMPK pathway in MIN6 cells as well as in islets of newborn Swiss mice; CNTF prevents beta cell death, induced by Alloxan and IL-1?, through downregulation of AMPK pathway in MIN6 cells. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular