Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Coorientador: José Osmar Gaspar / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Priscila Belintani / Resumo: As atividades realizadas compreenderam a produção de cDNA utilizando primer anti-senso e RNA purificado, amplificação do gene codificador da proteína 25K do Cole latent virus (CoLV25K), purificação do fragmento amplificado, ligação em vetor de multiplicação pGEM-T, transformação em células competentes de Escherichia coli linhagem TOP 10, purificação do vetor, digestão enzimática com as enzimas Bam HI e Hind III, subclonagem no vetor de expressão pET28a, transformação em células competentes de E. coli linhagem BL21-RIL, sequenciamento do gene no vetor de expressão e expressão da proteína a 37 o C . Quando expressa a 37 ºC, a proteína, de 25 kDa, foi encontrada em sua totalidade nos corpos de inclusão. Dessa forma, a proteína foi purificada sob condição desnaturante (utilizando 8 M de uréia) e submetida à diálise para seu reenovelamento. Após o reenovelamento, a proteína foi concentrada para aproximadamente 3 mg/mL e foram realizadas medidas de dicroísmo circular, para verificar o seu conteúdo de estrutura secundária, e o espalhamento dinâmico de luz, para estimar a distribuição de tamanho das populações de partículas que estão presentes na solução. Os dados da deconvolução do experimento de dicroísmo circular indicam um percentual de 40-46% α-hélice, 12-14% folha-β, 15-22% voltas e 24-28% de outras estruturas, indicando que a proteína está estruturada; e os dados do espalhamento dinâmico de luz mostraram que a proteína encontra-se estável, monodispersa, mas apresenta um complexo de partículas que deve ser removido para que fique nas condições ideais de cristalização. Foram utilizadas também outras técnicas para tentar alcançar a solubilidade da proteína expressa: abaixando a temperatura... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The experiments performed were, the production of cDNA using anti-sense primers and purified RNA, amplification of the gene encoding the 25K protein of Cole latent virus (CoLV25K), purification of the amplified fragment, cloning in multiplication vector pGEM-T for cell transformation into competent Escherichia coli strain TOP 10, vector purification, enzymatic digestion using the enzymes Bam HI and Hind III, subcloning in expression vector pET28a, transformation into competent cells of E. coli strain BL21-RIL, sequencing of the gene cloned into the expression vector and protein expression at 37 o C. When expressed at 37 °C, the protein with a molecular mass of 25 kDa was detected in inclusion bodies. Thus, the protein was purified under denaturing conditions (using 8 M urea) and subjected to dialysis to stimulate refolding. After refolding, the protein was concentrated to approximately 3 mg / mL and the circular dichroism assay was performed to verify the content of secondary structure, and dynamic light scattering, to estimate the size distribution of particle populations which are present in solution. The data from the deconvolution of circular dichroism experiments indicate a percentage of 40-46% α-helix, 12-14% β-sheet, 15-22% turns and 24-28% of other structures, indicating a structured protein; and the data of the dynamic light scattering showed that the protein is stable, monodispersive, but forms a large complex of particles which must be separated to before crystallization experiments. Other techniques were used to solubilize the expressed protein: lowering the temperature of expression to 18 °C, using the method... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: Este trabalho abordou a determinação quali e quantitativa de enantiômeros de catequinas em extratos e infusões das folhas de espécies do gênero Byrsonima (Malpighiaceae), tais como: B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia e B. verbascifolia. O trabalho descreve a determinação rápida e eficiente de catequina, ent- catequina, epicatequina e ent-epicatequina por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de arranjo de fotodiodos e dicrísmo circular, usando coluna de fase estaconária quiral. O método possui alta seletividade e permite identificar inequivocadamente diastereômeros de catequinas em matrizes complexas como extratos vegetais, com limites de detecção (0,42 a 0,77 μg mL-1 ) e quantificação (1,27 a 2,32 μg mL-1 ) satisfatórios para as condições analisadas, e valores de precisão (0,3 to 4,8%) e exatidão (70,0 a 110,2%) recomendados pela ANVISA. Com exceção da espécie B. intermedia, quatro espécies do gênero apresentaram em seus extratos e infusões os diastereômeros catequina, epicatequina e ent-epicatequina. Experimentos para avaliar a epimerização da catequina indicaram que a incomum ent-epicatequina não é um artefato, podendo ser um produto do metabolismo de espécies do gênero Byrsonima. Enantiômeros da catequina apresentam diferentes atividades farmacológicas, o que pode causar a ocorrência de efeitos colaterais diversos, danosos à saúde humana. Portanto, esses resultados podem alertar quanto ao consumo indiscriminado de plantas medicinais pela população e contribuir para criação de políticas mais rigorosas no controle de qualidade de fitoterápicos no Brasil / Abstract: This work deals with the qualitative and quantitative determination of catechin and epicatechin enantiomers both in extracts and infusions from the leaves of the Byrsonima (Malpighiaceae) species (B.basiloba, B. cocolobifolia, B. crassa, B. intermedia and B. verbascifolia). This work describes a simple and reliable analytical high performance liquid chromatographic (HPLC) method coupled with photodiode array detector and circular dichroism for simultaneous determination of catechin, ent-catechin, epicatechin and ent-epicatechin. The direct separation was obtained in normal phase by HPLC using chiral stationary phase. The method has high selectivity. Regardless of variations in retention time, it was possible to identify unequivocally the enantiomers of catechin and epicatechin in complex matrices like plant extracts with satisfactory limit of detection (0.42 to 0.77 μg mL-1 ) and limite of quantification (1.27 to 2.32 μg mL-1 ). Under the conditions used, precision values were 0.3 to 4.8%, whereas accuracy values were 75.0 to 110.2%, recommended by ANVISA. Aside from B. intermedia specie, the other four Byrsonima species presented catechin, epicatechin and ent-epicatechin diastereomers both in methanolic extract and infusions. Experiments were carried out for verification the possibility of catechin epimerization. It was observed that the unusual ent- epicatechin was not an artifact, but product of Byrsonima species metabolism. Enantiomers of catechin present dissimilar pharmacological activities, which may cause the occurrence of various side effects, harmful to human health. Therefore, these results may warn about the indiscriminate use of medicinal plants by the population and contribute to the quality control of Brazilian herbal medicines / Orientador: Wagner Vilegas / Coorientador: Lourdes Campaner dos Santos / Banca: Mary Rosa Rodrigues de Marchi / Banca: Maysa Furlan / Banca: José Arimatéia Dantas Lopes / Banca: Suzana da Costa Santos / Doutor

Resumo: Estudos fitoquímicos visando o isolamento de benzopiranos quirais foram realizados em Peperomia obtusifolia e Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Da espécie P. obtusifolia foram isolados dois cromanos racêmicos, a peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1- benzopirano carboxílico, bem como oito ésteres isoméricos deste último com os monoterpenos borneol e fenchol, inéditos na literatura. P. gaudichaudianum forneceu o cromeno ácido gaudichaudiânico, também como racemato. As misturas estereoisoméricas foram resolvidas por meio de cromatografia líquida de alta eficiência quiral e os estereoisômeros purificados tiveram sua configuração absoluta determinada por comparação dos espectros experimentais de dicroísmo circular vibracional e eletrônico com aqueles preditos por cálculos mecânico-quânticos ab initio. Peperobtusina A e o ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)- 2-(4-metil-1,3-pentadienil)-2H-1-benzopirano carboxílico foram assinalados como (+)-R, enquanto o ácido gaudichaudiânico foi assinalado como (+)-S. Os ésteres de cromano com borneol foram assinalados como (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S e (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, enquanto os ésteres com fenchol foram assinalados como (−)- 2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Com a configuração absoluta assegurada, foi possível a verificação do potencial tripanocida seletivo e sinérgico para os enantiômeros do ácido gaudichaudiânico e inibidor de HIV-1 protease seletivo para o (−)-(S)-ácido 3,4-diidro-5-hidróxi-2,7-dimetil-8-(3-metil-2-butenil)-2-(4- metil-1,3-pentadienil)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Phytochemical investigations focused on chiral benzopyrans were carried out on Peperomia obtusifolia and Piper gaudichaudianum (Piperaceae). Two racemic chromanes, peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2- butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid, as well as eight novel isomeric esters of the latter with the monoterpenes borneol and fenchol, were isolated from P. obtusifolia. P. gaudichaudianum afforded the racemic chromene gaudichaudianic acid. All stereoisomeric mixtures were resolved using chiral high performance liquid chromatography and the purified compounds had their absolute configuration determined by comparison of experimental vibrational and electronic circular dichroism spectra with those calculated using ab initio quantummechanical methods. Peperobtusin A and 3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3- methyl-2-butenyl)-2-(4-methyl-1,3-pentadienyl)-2H-1-benzopyran carboxylic acid were assigned as (+)-R, whereas gaudichaudianic acid was assigned as (+)-S. The borneol chromane esters were assigned as (−)-2S,1′′′S,2′′′R,4′′′S and (+)- 2R,1′′′S,2′′′R,4′′′S, while the fenchol esters were assigned as (−)-2S,1′′′R,2′′′R,4′′′S e (+)-2R,1′′′R,2′′′R,4′′′S. Once the absolute configuration had been established it was possible to identify a selective and synergistic trypanocidal activity for the enantiomers of gaudichaudianic acid as well as a selective HIV-1 protease inhibitory potential for (−)-(S)-3,4-dihydro-5-hydroxy-2,7-dimethyl-8-(3-methyl-2-butenyl)-2-(4- methyl-1,3-pentadienyl)... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maysa Furlan / Coorientador: Silvia Noelí López / Banca: Alberto José Cavalheiro / Banca: André Luiz Meleiro Porto / Banca: Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva / Banca: Angelo da Cunha Pinto / Doutor

Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: João Procópio de Araújo Filho / Banca: Maria Teresa Lamy / Banca: Roberto da Silva / Banca: Valmir Fadel / Resumo: Neste trabalho estudamos a conformação em ambientes anisotrópicos e a atividade lítica em vesículas aniônicas e zwitteriônicas de um conjunto de peptídeos biologicamente ativos, extraídos de veneno de vespas solitárias, que se caracterizam por usar seus venenos para paralisar as presas com as quais alimentam suas larvas. Esses peptídeos que são desgranuladores de mastócitos, apresentam atividade antimicrobiana e a maioria deles não é hemolítica. Possuem entre 10 e 15 resíduos, são catiônicos, com alta proporção de resíduos carregados e polares, e são lineares e helicoidais em meios miméticos de membranas. Buscamos correlacionar a atividade lítica em vesículas de diferentes composições, analisada em experimentos de fluorimetria, às mudanças conformacionais, induzidas por diferentes ambientes miméticos, monitoradas por dicroísmo circular, complementando com a análise das características físico-químicas como comprimento da cadeia, amidação do terminal-C, carga líquida, influências no macrodipolo da hélice, hidrofobicidade, momento hidrofóbico e ângulo polar. Observamos que estes peptídeos apresentam intensa atividade em membranas modelo, interagem preferencialmente com bicamadas aniônicas, e sua atividade lítica acontece de modo cooperativo tanto em vesículas aniônicas como nas zwitteriônicas. Com exceção de Anoplin, todos os peptídeos com ação antimicrobiana apresentam curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Isso sugere que esses peptídeos se acumulam na superfície da vesícula até atingir uma concentração crítica, além da qual o vazamento aumenta cooperativamente. De uma forma geral os peptídeos mais eficientes como antimicrobianos, são também aqueles caracterizados pela maior eficiência em permeabilizar vesículas aniônicas do tipo PCPG 7030 e por baixas razões limite P/L. / Abstract: Solitary wasps use their venoms to paralise prays to feed their larvae. A set of biologically active peptides, obtained from these venoms, have been investigated in relation to the conformational changes they undergo in anisotropic environments and their lytic activity on zwitterionic and anionic vesicles. These peptides are mast cell degranulators, present antimicrobial activities and most of them are not hemolytic. They are cationic, their chain length are 10 to 15 residues long, with high hydrophilic / hydrophobic ratio; they are linear and helical in membrane mimetic environments. We searched correlation between the lytic activity in vesicles of different compositions, monitored in fluorimetric experiments, and conformational changes, induced by varied mimetic media, monitored by circular dichroism. The results have been also correlated with peptides' physical-chemical parameters such as chain length, amidated or carboxylated C-terminal, net charge, influences on the helix macrodipole, hydrophobicity, hydrophobic moment and polar angle. We observed that these peptides present intense activity on model membranes, they interact preferentially with anionic bilayers, and their lytic activity is a cooperative process either in anionic or in zwitterionic vesicles. Exception made to Anoplin, all the other peptides that have antimicrobial activity present in their dose-response curves a sigmoidal dependence with the peptide concentration. This fact suggests that these peptides accumulate on the vesicles surface until they reach a threshold concentration, beyond which leakage increases cooperatively. As a general rule, the most efficient antimicrobial peptides are also those characterized by efficient permeabilization of anionic vesicles, namely PCPG 7030 and by small threshold P/L ratios. / Doutor