La senescencia celular es una detención irreversible del ciclo celular que tiene lugar en respuesta a diversos estímulos de estrés, actuando como un mecanismo supresor de tumores para impedir la proliferación de células con riesgo de transformación maligna. Así, mutaciones que interfieren con el proceso de la senescencia pueden favorecer la formación tumoral. De todas formas, cada vez hay más pruebas que sugieren que las células senescentes también pueden ejercer efectos pro-tumorigénicos en el tejido circundante mediante el fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP). Así, descifrar los mediadores moleculares de la senescencia y el SASP es crítico para entender los estadios tempranos de la formación y progresión tumoral. Aquí mostramos que la isoforma ΔNα de p63, un factor de transcripción relacionado con p53, es un oncogén que promueve la iniciación tumoral en colaboración con Ras mediante la inhibición de la senescencia inducida por oncogenes (OIS). Efectivamente, el incremento en la expresión de ΔNp63α en queratinocitos primarios de ratón bloquea la OIS y directamente conduce a la formación de un carcinoma de células escamosas (SCC). También identificamos la Helicasa Específica Linfoide (Lsh), un miembro de la familia SNF2 de remodeladores de la cromatina, como nueva diana de p63 necesaria para la inhibición de la senescencia. Posteriormente, demostramos que Lsh es suficiente para iniciar la formación tumoral independientemente de p63, y que el aumento en su expresión conduce a un desarrollo tumoral más agresivo. Sorprendentemente, mostramos que Lsh tiene un papel en la inducción de la linfangiogénesis, un proceso característico de la progresión maligna y la metástasis. Es interesante notar que las pruebas apuntan hacia Lsh actuando sobre el SASP para dirigir la formación y la progresión tumoral. En conjunto, en este trabajo se identifican nuevos mediadores críticos de la senescencia y funciones de la desregulación de la senescencia durante la formación y la progresión tumoral. / Cellular senescence is an irreversible cell cycle arrest that occurs in response to various stresses, acting as a tumor-suppressive mechanism to impede the proliferation of cells at risk for malignant transformation. As such, mutations that interfere with the senescence process can favor tumor formation. However, increasing evidence suggests that senescent cells can also exert pro-tumorigenic effects on the surrounding tissue, through the senescence-associated secretory phenotype (SASP). As such, understanding the molecular mediators of senescence and the SASP is critical to unravel the early stages of tumor formation and progression. Here we show that the ΔNα isoform of p63, a p53-related transcription factor, is an oncogene that promotes tumor initiation in cooperation with Ras, through the inhibition of oncogene-induced senescence (OIS). Indeed, increased expression of Np63 in primary mouse keratinocytes blocks OIS and directly leads to the formation of squamous cell carcinoma (SCC). We also identify Lymphoid Specific Helicase (Lsh), a member of the SNF2 family of chromatin remodelers, as a novel target of p63, required for senescence bypass. Subsequently, we demonstrate that Lsh is sufficient to initiate tumor formation independently of p63, and that its increased expression leads to aggressive tumor development. Surprisingly, we show a role for Lsh in the induction of lymphangiogenesis, a hallmark of malignant progression and metastasis. Interestingly, the evidence points towards Lsh acting on the SASP to instruct tumor formation and progression. Together, this work identifies critical new mediators of senescence, and functional roles for senescence deregulation during tumor formation and progression.

Hydrogen peroxide (H2O2), a reactive oxygen species (ROS), is involved in both oxidative stress and signaling cascades in a dosage dependent manner. Its toxicity is partially explained through reactivity with iron via the Fenton reaction. Iron, indispensible for many cellular processes, is thus tightly regulated to balance between need and toxicity. Using fission yeast as a model system, we explored the relationship between H2O2 and the iron starvation response system, specifically whether cross-talk allowed mutual regulation that could prevent synergistic toxicity of ROS via diminishing iron quantity. We screened around of 2700 haploid Schizosaccharomyces pombe deletion mutants in different oxidative stress agents, identifying new genes amongst which fep1, pcl1 and sib2 are involved in iron homeostasis. H2O2, unexpectedly, triggers transcriptional iron starvation response, including enhanced iron import and decreased iron consumption. Over-expression of several antioxidant proteins, in particular heme-containing catalase, causes strong iron consumption within the cell, triggering the iron starvation pathway accidentally. Furthermore, glutaredoxin Grx4 contains an iron-sulfur cluster (ISC) involved in iron sensing, underpinning regulation of the iron starvation response. Finally, we identify and characterize the frataxin homolog gene in S. pombe, pfh1. Deficiencies in frataxin provoke a neurodegenerative disease called Friedreich ataxia; the function of this protein remains controversial. We create ∆pfh1 strain as a new model system to elucidate the molecular events leading to the disease. / El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un agente oxidante que además de participar en cascadas de señalización produce toxicidad por daño oxidativo. Parte de su toxicidad se explica por su reactividad con hierro. Así, las concentraciones de hierro en el interior celular han de estar estrictamente reguladas. Usando la levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe, como un sistema modelo, estudiamos las relaciones entre H2O2 y el sistema de respuesta a déficit de hierro. Genes como fep1, pcl1 y sib2, importantes para mantener su homeostasis, fueron encontrados en un análisis de 2700 mutantes de S. pombe, tras tratamiento con diferentes agentes oxidantes. Inesperadamente encontramos que H2O2 desencadena una respuesta transcripcional de déficit de hierro, incluyendo aumento de su entrada y disminución de su consumo. Ésta es una respuesta accidental debido a la sobreexpresión de proteínas como catalasa, una hemoproteína, consumidoras masivas de hierro. Encontramos además que la glutaredoxina Grx4 contiene un clúster de hierro-azufre implicado en sensar hierro. Finalmente, identificamos, caracterizamos y delecionamos el homólogo de frataxina en S. pombe, pfh1. Deficiencias en frataxina provocan ataxia de Friedreich. Los mecanismos por los cuales se desencadena esta enfermedad están todavía por elucidar, pero S. pombe es un buen sistema modelo para su estudio.

The embryo of Caenorhabditis elegans is a model system in which development can be studied at single cell resolution. In this thesis I describe the use of a semi-automatic nuclear tracking algorithm to analyze cellular movements in the early embryo, as well as how embryos respond to mechanical deformation and to genetic perturbation. During gastrulation cells were observed to not only ingress into the interior of the embryo, but also to egress onto the surface. Moreover, cell lineages were identified that undergo both directional movements, i.e. first internalize and then continue to move until finally reemerging on the surface, “transgressing” or “tunnelling” through the embryo. The previously described stereotypical early rotation movements in compressed embryos were found to be highly variable in uncompressed embryos, with this variable global rotation largely determining the final embryonic axes. In addition to constraining this early rotation, compression of the embryo was found to alter the relative positions of cell groups. A compensatory mechanism was identified consisting of a global rotation of cells initiating more than an hour after the four-cell stage that realigns the relative positions of cell groups and results in a further rotation of the embryonic axes. Possible mechanisms that drive these corrective cell movements are discussed. Inhibiting the expression of 20 general regulators of chromatin and analyzing the phenotypic consequences at single cell resolution revealed functions in chromosome segregation, mitotic cell cycle progression, cellular movements and lineage-specific development, and suggested the existence of functionally diverse chromatin-modifying protein complexes in the embryo. Moreover, a global re-arrangement of nuclear architecture was observed upon the inhibition of zygotic gene expression. Taken together, these analyses illustrate the power of single cell resolution phenotyping, identify previously unrecognized cell behaviors during early development, and identify regulative cell movements as a mechanism that confers robustness to the effects of mechanical deformation. / El nemátodo Caernorhabditis elegans ofrece la posibilidad de estudiar el desarrollo embrionario con una resolución celular. En esta tesis, describo el uso de un algoritmo semi-automático de seguimiento nuclear para analizar movimientos celulares en el embrión temprano, así como la manera en que el embrión responde a deformaciones mecánicas y a perturbaciones genéticas. Durante el proceso de gastrulación, observamos que ciertas células no solo ingresan al interior del embrión, pero también egresan hasta la superficie. Asimismo, identificamos linajes celulares que llevan a cabo ambos tipos de movimientos direccionales, esto es, primero internalizan y luego la continuan su movimiento hasta finalmente re-emerger en la superficie, “transgressing” o “tunneling” a través del embrión. Hemos descubierto que los movimientos estereotípicos de rotación en el embrión temprano, descritos previamente, son altamente variables en ausencia de compresión y esta variabilidad total en la rotación determina los ejes finales del embrión. Además de limitar esta rotación temprana, la compresión del embrión altera la posición relativa de grupos celulares. Hemos identificado un mecanismo compensatorio que consiste en la rotación global de células el cual tiene lugar mas de una hora después del estadio de cuatro células. Ese mecanismo re-alinea la posición relativa de los grupos celulares resultando en una rotación adicional de los ejes embrionarios. Posibles mecanismos responsables de estos movimientos correctivos son discutidos. La inhibición de la expresión de 20 reguladores generales de la cromatina y el análisis de las consecuencias fenotípicas con resolución celular ha revelado funciones en la segregación de cromosomas, la progresión mitótica del ciclo celular, movimientos celulares y desarrollo linaje-especifico, sugiriendo la existencia de diversos complejos de proteínas modificadoras de la cromatina en el embrión. Además, hemos observado una re-organización global de la arquitectura nuclear al inhibir la expresión zigótica en el embrión. En conclusión, estos análisis han permitido ilustrar el poder de la fenotipificación con resolución celular, así como la identificación de comportamientos celulares previamente desconocidos durante el desarrollo temprano y movimientos celulares regulativos como un mecanismo que confiere robustez a los efectos de deformaciones mecánicas.

Trabajos previos llevados a cabo en el laboratorio de acogida, usando como modelo el insecto basal Blattella germanica, mostraron que los microRNAs (miRNAs) son cruciales para completar la metamorfosis. El objetivo general de esta tesis fue identificar miRNAs que estuviesen implicados en este proceso. Como primer paso, se estableció un catálogo general de miRNAs en B. germanica mediante secuenciación con Solexa. A partir de ahí, se prepararon dos librerías de miRNAs, una en la etapa metamórfica y otro en la etapa no metamórfica, para distinguir miRNAs diferencialmente expresados entre las dos etapas y evaluar la influencia de las hormonas principales de la metamorfosis sobre la expresión de estos miRNAs. Nuestros experimentos también mostraron que los factores de transcripción Broad-complex inducen la expresión de let-7 y miR-100, y que estos miRNAs desempeñan un papel en la regulación del tamaño y del patrón de venas e intervenas de las alas de B. germanica. Por último, se estudió el papel de miR-8-3p y miR-8-5p en la regulación de los niveles de transcrito de atrofina, un factor implicado en la coordinación neuromuscular, que es importante para asegurar una adecuada ecdisis en la muda metamórfica. / Previous work carried out in the host laboratory, using the basal insect Blattella germanica as model, showed that microRNAs (miRNAs) are crucial to complete metamorphosis. The general goal of this thesis was to identify particular miRNAs involved in this process. As a first step, we established a general catalogue of miRNAs in B. germanica using high throughput Solexa sequencing. Thereafter, we prepared two miRNA libraries; one in the metamorphic stage and other one in the non-metamorphic stage, to distinguish miRNAs differentially expressed between the two stages, and to assess the influence of the main metamorphosis hormones on the expression of these miRNAs. Our experiments also showed that Broad complex transcription factors induce the expression of let-7 and miR-100, and that these miRNAs play a role in regulating the size and the vein-intervein patterning of B. germanica wings. Finally, we studied the role of miR-8-3p and miR- 8-5p in regulating the transcript levels of atrophin, a factor involved in neuromuscular coordination, which is important to ensure a proper ecdysis in the metamorphic molt.

Embryonic stem (ES) cells are able to differentiate into any cell type, a property called pluripotency, and have unlimited potential for self-renewal. Although the molecular mechanisms responsible for maintaining self-renewal and pluripotency in ES cells are not well known, recent studies have demonstrated the importance of epigenetic mechanisms in maintaining these processes. Histone modifying enzymes play decisive roles in differentiation and development. This study describes that SMYD2 (SET and MYND domain containing protein 2), a histone lysine methyltransferase, is induced during human ES cells differentiation and it is preferentially expressed in somatic cells versus pluripotent cells. Gain and loss-of-function experiments have shown that knockdown of SMYD2 in human ES cells promotes the induction of endodermal markers during differentiation, while overexpression has opposite effects. In vivo experiments in zebrafish revealed that knockdown of smyd2a (a homologue gene of human SMYD2) causes developmental delays and aberrant tail formation. The phenotype of smyd2a-morphant embryos correlates with a low expression of ntl and over induction Nodal-related genes during gastrulation. Finally, SMYD2 is shown to stimulate the activation of BMP signaling pathway and promotes the induction of BMP2-target genes in human ES cells. Overall, these findings suggest that SMYD2 plays a critical role at early stages during development and in human ES cells differentiation. / Les cèl·lules mare embrionàries (ES) són capaces de diferenciar-se a qualsevol tipus cel·lular, una propietat coneguda amb el nom de pluripotència, i presenten un potencial il·limitat d’auto-renovació. Tot i que els mecanismes moleculars responsables per al manteniment de la pluripotència i l’auto-renovació en ES encara no es coneixen bé, estudis recents han demostrat la importància dels mecanismes epigenètics en mantenir aquests processos. Els enzims modificadors d´histones juguen un paper decisiu durant la diferenciació i el desenvolupament. Aquest estudi descriu que SMYD2 (SET and MYND domain containing protein 2), una metiltransferasa d’histones, s’indueix durant la diferenciació de cèl·lules ES i s’expressa preferentment en cèl·lules somàtiques envers cèl·lules pluripotents. Experiments de guany i pèrdua de funció mostren que el noqueig de SMYD2 en cèl•lules ES humanes promou la inducció de marcadors d’endoderm durant la diferenciació, mentre que la sobre-expressió té efectes oposats. Experiments in vivo en el peix zebra van revelar que el noqueig de smyd2a (un gen homòleg de SMYD2 humà) causa retard en el desenvolupament i formació aberrant de la cua. El fenotip dels embrions absents de smyd2a es correlaciona amb una baixa expressió de ntl i una sobre-inducció dels gens relatius a Nodal durant la gastrulació. Finalment, SMYD2 estimula l’activació de la via de senyalització BMP i promou la inducció dels gens diana de BMP2 en cèl·lules ES humanes. En general, aquests descobriments suggereixen que SMYD2 juga un paper important durant els estadis primerencs en el desenvolupament embrionari i durant la diferenciació de cèl·lules ES humanes.

Seven linker histone H1 variants exist in human somatic cells with distinct prevalence among cell types and during differentiation. Despite being key chromatin structural components, it remains elusive how they participate in the regulation of nuclear processes. Moreover, it is not well understood whether the different variants have specific roles or are differentially distributed along the genome. By taking advantage of specific antibodies for H1 variants and HA-tagged recombinant H1s expressed in breast cancer cells, the distribution of somatic variants H1.2 to H1.5, H1.0 and H1X has been investigated by combining ChIP-qPCR, ChIP-chip, and ChIP-seq analysis. All H1 variants bind gene promoters and are depleted from the TSS in active genes, and also from regulatory sites. The extension of H1 depletion at promoters is dependent on the transcriptional status of the gene and differs between variants. Analyses show that histone H1 is not uniformly distributed along the genome and differences among variants exist, being H1.2 the variant showing a more specific pattern and a strongest correlation with gene repression in breast cancer cells. Results suggest that different variants may be present at different chromatin types, and this may depend on the cell type, differentiation state, and whether cells are originated from a neoplastic process. In a second part of the thesis, it is shown that a previously reported H1.4 knock-down cell line presents and off-target effect against lamin B2. Therefore, it has been developed a new inducible knock-down cell line specifically inhibiting H1.4, which resembles previously characterized H1.2 knock-down. Finally, combined depletion of H1.4/lamin B2 and H1.2/H1.4 causes similar effects in T47D breast cancer cell line. / Fins a set variants de la histona H1 s han identificat en mamífers, les quals mostres una prevalença diferent entre tipus cel lulars i durant el procés de diferenciació. Tot i que la histona H1 juga un paper clau en l estructuració de la cromatina, no s acaba d entendre encara com participa exactament en els diferent processos cel lulars. A més a més, encara no està clar si les diferents variants tenen funcions específiques ni si es distribueixen igual al llarg del genoma. Mitjançant anticossos específics per algunes variants d H1 i de línies cel lulars de càncer de mama que expressen H1s recombinant fusionades a un pèptid HA, s ha estudiat la distribució genòmica de H1.2 a H1.5, H1.0 i H1X, combinant ChIP-qPCR, ChIP-chip i ChIP-seq. Totes les H1s es troben a promotors gènics i empobrides a l inici de transcripció dels gens actius, i també a les regions reguladores. El grau de disminució d H1 al promotor depèn de l estat transcripcional del gen i presenta diferències entre variants. Els anàlisis mostren que la histona H1 no es distribueix uniformement al genoma i que hi ha diferències entre variants, essent H1.2 la variant que presenta un patró més específic i una correlació més forta amb repressió gènica a cèl lules de càncer de mama. Aquests resultats suggereixen que variants d H1 diferents es troben presents als diversos tipus de cromatina, i aquest fet podria dependre de la línia cel lular, l estat de diferenciació, o de si les cèl lules s han originat durant un procés neoplàsic. En una segona part de la tesi, es mostra que una línia cel lular anteriorment descrita que inhibeix H1.4 presenta un efecte inespecífic contra lamina B2. Així, s ha desenvolupat una altra línia que inhibeix H1.4 específicament, la qual s assembla a un mutant anteriorment caracteritzat que inhibeix H1.2. Finalment, la inhibició combinada de H1.4/lamina B2 i H1.2/H1.4 provoca efectes fenotípics semblants a cèl lules de càncer de mama T47D.

At the metaphase-to-anaphase transition, spindle microtubules pull replicated chromosomes to the daughter cells, but full separation of long chromosome arms is achieved in late anaphase. We have created an allelic series of long chromosomes to elucidate the mechanisms involved in long chromosome resolution during mitosis. With this method we have shown that long chromosome cells are sensitized to the loss of genes involved in chromosome structure and segregation. We have discovered that Topoisomerase II is needed during anaphase to resolve distal regions of long chromosomes and that the activity of the microtubule polymerase Stu2 is crucial in the resolution of catenations. Moreover, we have identified the nuclear organization as a new source that contributes to the topological stress accumulated in chromosomes. Thus, topological constraints imposed by chromosome length and nuclear architecture determine the amount of sister chromatid intertwinings that must be resolved by Topoisomerase II and dynamic microtubules during anaphase. / A la transició entre metafase i anafase els microtúbuls del fus mitòtic transporten els cromosomes a les cèl·lules filles, tot i això la separació completa dels braços dels cromosomes no succeeix fins al final dʼanafase. Amb lʼobjectiu dʼentendre com es resolen els cromosomes llargs durant anafase, hem creat una sèrie al·lèlica de cromosomes artificalment llargs. Amb aquesta metodologia hem demostrat que les cèl·lules que contenen cromosomes llargs estan sensibilitzades a la pèrdua de gens involucrats en lʼestructura i la segregació de cromosomes. Hem descobert que la Topoisomerasa II es necesària durant anafase per resoldre les regions distals de cromosomes llargs i que lʼactivitat de la polimerasa de microtúbuls, Stu2, és essencial en la resolució de concatenacions entre cromàtides germanes. A més, hem pogut identificar lʼorganització nuclear com una nova font que contribueix a lʼestrés topològic acumulat als cromosomes. En conclusió, les restriccions topològiques que imposen tant la longitud dels cromosomes com lʼarquitectura nuclear determinen la quantitat de concatenacions entre cromàtides germanes que han de ser resoltes per la Topoisomerasa II i els microtúbuls dinàmics durant anafase.

Cellular senescence is an irreversible form of proliferative arrest, historically linked to tumour suppression and aging. Recent discoveries, however, have extended its known role to include complex biological processes such as tissue repair, tumour promotion and age-related disorders. These new insights are redefining our view of cellular senescence, that unlike a static endpoint, senescence represents a collective phenotype, composed of complex networks of effector programs. The biological outcome of these effector programs varies depending on the cellular context and nature of the stress. Here, we investigated the functional role of senescence in two polar contexts: first, within the epidermal stem cell population during the aging process, and second, during embryonic development. We identified that the primitive Keratin-15 positive (Krt-15) hair follicle stem cell population increases in number in an age-dependent manner, but exhibits decreased functional capacity and an inability to tolerate stress. While there was no evidence of Krt-15 stem cells entering directly into senescence, we identified an age-associated imbalance in epidermal Jak-Stat signalling surrounding the stem cells, reminiscent of extrinsic senescent cells that inhibit stem cell function. These findings suggest that epidermal stem cell decline contributes to the aging phenotype of tissue, and that this may be directed by extrinsic senescence. Conversely, we also describe cellular senescence as a normal developmental mechanism that occurs during mammalian embryonic development, specifically in the apical ectodermal ridge (AER) and the roof plate of the hindbrain neural tube. Interestingly, developmental senescence is strictly dependent on p21, wherein mice deficient in p21 present with defects in embryonic senescence, AER maintenance and abnormal limb patterning. Additionally, we found significant gene-expression overlap between developmental and oncogene-induced senescence in the adult, suggesting a commonality in function. Furthermore, we found that the underlying mesenchyme is a source for senescence instruction, while the fate of senescent cells is both apoptosis and immune-mediated clearance. These findings indicate that senescence also functions in non-pathological states and plays an instructive role during embryonic development, and suggests that senescence may have evolved initially as a developmental mechanism that was subsequently adapted for its role in adult life. / La senescencia celular es una forma irreversible de paro proliferativo ligado históricamente a la supresión tumoral y al envejecimiento. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que también juega un papel en complejos procesos biológicos como reparación tisular, promoción tumoral y desórdenes relacionados con la edad. Estos nuevos conocimientos están redefiniendo nuestra visión de la senescencia celular, no tanto como un proceso estático sino como un fenotipo colectivo compuesto por una compleja red de programas efectores. El resultado biológico de estos programas efectores varía dependiendo del contexto celular y la naturaleza del estrés. Aquí, hemos investigado el papel funcional de la senescencia en dos contextos antagónicos: primero, en la población de células madre del epidermis durante el proceso de envejecimiento, y segundo, durante el desarrollo embrionario. Hemos demostrado que la población de células madre del folículo piloso que expresan queratina 15 aumenta en número en función de la edad, pero presenta una disminución de la capacidad funcional y una incapacidad de tolerar el estrés. Si bien no hemos encontrado ninguna evidencia de que las células madre que expresan queratina 15 entren directamente a senescencia, hemos identificado un desequilibrio en la vía de señalización de Jak-Stat alrededor de las células madre, posiblemente procedente de células senescentes extrínsecas que inhiben la función de las células madre. Estos descubrimientos sugieren que el declive de las células madre epidérmicas contribuye al envejecimiento del tejido y que puede estar dirigido por la senescencia extrínseca. Por otra parte, también hemos descrito el proceso celular de la senescencia como un mecanismo normal en el desarrollo embrionario de los mamíferos, específicamente en la cresta ectodérmica apical (AER) y en la placa del techo del tubo neural. Cabe notar que la senescencia del desarrollo es estrictamente dependiente de p21. Así, los ratones deficientes de p21 presentan defectos en la senescencia embrionaria, el mantenimiento del AER y la formación de las extremidades. Además, hemos visto que hay un solapamiento importante en la expresión génica de la senescencia del desarrollo y la senescencia inducida por oncogenes en los adultos, sugiriendo una similitud en la función. Asimismo, hemos descubierto que el mesénquima subyacente actúa como instructor de la senescencia, y que el destino de las células senescentes es entrar en apoptosis y ser eliminadas por el sistema inmunitario. Estos hallazgos indican que la senescencia también tiene lugar en estados no patológicos y que juega un papel instructivo durante el desarrollo embrionario. Hacen pensar que la senescencia podría haber evolucionado inicialmente como un mecanismo del desarrollo que fue adaptándose para su papel en la vida adulta.

Mouse embryonic stem (ES) cells derived from the inner cell mass of the blastocyst can be maintained in culture, under pluripotent conditions, using Serum+LIF medium. However, it has been published that the minimal combination of two compounds (GSK3 and MEK inhibitors) can sustain mouse ES cell self- renewal in absence of serum inhibiting ERK and Wnt/ β-catenin singaling pathways. Previous work of our laboratory has reported that periodic activation of the Wnt/β-catenin signalling pathway enhances reprogramming of somatic cells. Here we have demonstrated a dynamical interplay between β-catenin and Nanog in regulating both pluripotency and reprogramming. Specifically, fluctuations of Nanog affect β-catenin dynamics in serum+LIF, whereas, activation of the Wnt pathway, using Wnt3a or GSK3 inhibitors, causes β-catenin oscillations independent from Nanog. Moreover we have also proved that Nanog-mediate reprogramming depends on the indirect activation of the Wnt/β-catenin pathway. With our work we proposed a novel interaction between two parallel signalling pathways and provided a comprehensive mathematical model describing Nanog and β-catenin dynamics in mouse ES cells. / Las células madre embrionarias de ratón (ES) derivadas de la masa celular interna del blastocisto, se pueden mantener en estado de pluripotencia, utilizando condiciones de cultivo que contiene Suero + factor LIF. Sin embargo, se ha publicado que la combinación mínima de dos compuestos (inhibidores de GSK3 y MEK) pueden sostener la autorrenovación de las ES en ausencia de un suero represor de las vías de señalización ERK y Wnt/β-catenina. Anteriores trabajos de nuestro laboratorio han demostrado que la activación periódica de la vía de señalización Wnt/β-catenina mejora la reprogramación de células somáticas. Aquí hemos demostrado que hay una interacción dinámica entre la β-catenina y Nanog en la regulación tanto de la pluripotencia como la reprogramación. Concretamente, las fluctuaciones de Nanog afectan a la dinámica de β-catenina en el medio con Suero + LIF, mientras que, la activación de la vía de señalización utilizando Wnt3a o inhibidores de GSK3, provoca oscilaciones de β-catenina independientes de Nanog. Por otra parte, también hemos demostrado que la reprogramación mediada por Nanog es dependiente de la activación indirecta de la vía señalización de Wnt/β-catenina. Nuestro trabajo ha propuesto una nueva interacción entre dos vías de señalización paralelas, además ha proporcionado un modelo matemático amplio que describe la dinámica de Nanog y de β-catenina en células ES de ratón.

During mitosis, spindle assembly involves different sources of microtubules including centrosomes and chromosomes. While the role of centrosomes has been extensively studied, we still do not fully understand how chromosomes trigger microtubule assembly thereby contributing to the formation of the mitotic spindle. The chromosomal pathway is largely determined by a RanGTP gradient centered on the chromosomes that induces the local activation of spindle assembly factors. To get a better understanding on the RanGTP-dependent microtubule assembly during mitosis we aimed at: i) Identifying new RanGTP regulated proteins involved in spindle assembly. Our results pointed to three novel proteins with a putative mitotic role in the RanGTP pathway. ii) Understanding how the RanGTP pathway regulates microtubule nucleation during mitosis. We found that TPX2 together with Aurora-A and RHAMM are part of a RanGTP-dependent complex that binds and strongly stimulates the -TuRC nucleation activity. iii) Investigating the contribution of the RanGTP pathway to spindle assembly. Our data provided novel evidences that MTs nucleated close to the chromosomes participate in the k-fibers assembly process. / Durante la mitosis, el proceso de ensamblaje del huso mitótico implica diferentes fuentes de microtúbulos incluyendo centrosomas y cromosomas. Mientras que el rol de los centrosomas ha sido extensamente estudiado, no se entiende en su totalidad como los cromosomas inducen la formación de microtúbulos contribuyendo de esta manera al ensamblaje del huso mitótico. La vía de los cromosomas está mayormente determinada por un gradiente de RanGTP, centrado en los cromosomas, que induce la activación local de factores mitóticos. Para entender el mecanismo que promueve el ensamblaje de los microtúbulos vía RanGTP durante la mitosis, este trabajo tuvo los siguientes objetivos: i) La identificación de nuevas proteínas reguladas por RanGTP que participan en el ensamblaje del huso. Nuestros resultados apuntan a tres nuevas proteínas con un posible papel mitótico en la vía RanGTP de ensamblaje de los microtúbulos. ii) El estudio de el mecanismo para el cual RanGTP regula la nucleación de microtúbulos durante la mitosis. Hemos descubierto que TPX2 junto con Aurora-A y RHAMM son parte de un complejo RanGTP dependiente que estimula la actividad de nucleación de el TuRC. iii) El estudio del papel de la vía de RanGTP en el ensamblaje del huso. En particular, nuestros datos proporcionan nuevas evidencias sobre la participación de los MTs nucleados alrededor de los cromosomas en el proceso del ensamble de fibras cinetocóricas.