Orientadora : Drª. Lucélia Donatti / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 21/02/2014 / Inclui bibliografia / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: Peixes antárticos são espécies adaptadas ao frio, consideradas estenotérmicas, sendo seu metabolismo eficiente em baixas temperaturas. Estudos recentes sobre alterações climáticas relatam que a Península Antártica apresenta aquecimento acelerado, é extremamente importante entender a plasticidade metabólica e os mecanismos bioquímicos envolvidos na aclimatação a altas temperaturas de peixes antárticos para a conservação destas espécies e do ecossistema Antártico. O presente trabalho teve o objetivo de analisar o efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema de defesa antioxidante em eritrócitos de Notothenia rossii e Notothenia coriiceps, expostos durante 1, 3 e 6 dias a 8+0.5°C e a 0+0.5°C. Variações morfológicas nos eritrócitos e nos níveis de atividade de alguns constituintes enzimáticos como a glutationa peroxidase (GPx); superóxido dismutase (SOD); glutationa S-transferase (GST); catalase (CAT); glutationa redutase (GR) e quantificação do constituinte não enzimático, glutationa reduzida (GSH) e lipoperoxidação lipídica (LPO), por dosagem de malonaldeído (MDA) foram analisados. Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C não modulou os níveis de SOD e GPx. Mas modulou negativamente os níveis de CAT em 1 (87% menor em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (90% menor em 8°C quando comparado a 0°C). A GST foi modulada positivamente em 3 dias (57,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). A GR foi modulada positivamente em 1 dia ( 69,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (81% maior em 8°C quando comparado a 0°C). Em Notothenia rossii o aumento da temperatura não modulou os níveis de GPx e GR. Mas, a SOD foi modulada positivamente em 6 dias (68% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e a CAT foi modulada positivamente em 3 dias (97% maiores em 8°C quando comparados a 0°C) e negativamente em 6 dias (86% menores em 8°C quando comparados a 0°C). A GST também foi modulada negativamente em 6 dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). Os níveis de GSH não foram modulados pela temperatura em ambas as espécies. O níveis de MDA foram modulado negativamente em 3 dias a 8°C em ambas as espécies e houve modulação positiva em 1 dia para N. coriiceps pelo aumento da temperatura. Análises morfológicas dos eritrócitos indicaram que em N. coriiceps o aquecimento a 8°C determinou o aumento da frequência de alterações no formato celular, presença de vesículas na membrana plasmática, núcleo em Blebbed e fissura nuclear. Em N. rossii o estresse térmico influenciou o aumento da frequência de alterações no formato celular e a presença de núcleos em Blebbed. A proporção de eritrócitos maduros e imaturos, a frequência de micronúcleo, o deslocamento celular, volume celular e nuclear não foram influenciados pelo estresse térmico em ambas as espécies. Foi possível concluir que, nos nototenideos antárticos, N. rossii e N. coriiceps, espécies filogeneticamente muito próximas, os padrões de resposta frente ao aumento da temperatura ambiental foram diferentes. Palavras-chaves: eritrócitos, temperatura, estresse oxidativo, anormalidades celulares. / Abstract: Antarctic fish are cold-adapted species, considered stenothermal; the metabolism of this fishes is very efficient at low temperatures. Recent studies about climatic changes report accelerated warming in the Antartic Peninsula. For the conservation of Antartic ecosystem and species is extremely important to understand the metabolic plasticity and biochemical mechanisms involved in high temperatures acclimation of Antartic fishes. This study aimed to verify the effect of heat stress on the morphology and the antioxidant defense system in erythrocytes of Notothenia coriiceps and Notothenia rossii, exposed for 1, 3 and 6 days to 8 +0.5 +0.5 ° C and 0 ° C. Morphological changes in erythrocytes and activity levels of some enzymatic constituents like glutathione peroxidase ( GPx ), superoxide dismutase ( SOD ), glutathione S - transferase ( GST ), catalase ( CAT ), glutathione reductase ( GR ) and quantification of non-enzymatic constituent, reduced glutathione ( GSH ) and lipid peroxidation ( LPO ), by measurement of malondialdehyde (MDA) were analyzed. The temperature increase to 8ºC in N.coriiceps do not modulated levels of SOD and GPx, although, negatively modulates the levels of CAT 1 (87 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C) and 3 days (90 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was positively modulated in 3 days (57.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively within 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). The GR was positively modulated at 1 day ( 69.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and 3 days (81 % increase at 8 ° C as compared to 0 ° C). The temperature increase in N. rossii do not modulate GPx levels of GR . However, SOD was positively modulated in 6 days (68 % higher when compared to 8C 0 ° C) and CAT was positively modulated in 3 days (97% at 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively 6 days (86 % lower at 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was also negatively modulated in 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). Morphological analysis of erythrocytes indicated that in N. coriiceps heating at 8 °C determined the increase frequency of changes in cell format, presence of vesicles in plasma membrane and Blebbed nucleus. Heat stress at 6 days in N. rossii influenced an increase frequency of changes in cell shape and presence of Blebbed nucleus. The proportion of mature and immature erythrocytes, frequency of micronucleus and cell displacement, cell and nuclear volume were not affected by heat stress in both species. In conclusion, N. rossii and N. coriiceps, phylogenetically close Antarctic nototenideos, have different patterns of response due to increased environmental temperature. Keywords: erythrocytes, temperature, oxidative stress, cellular abnormalities.

Orientador : Prof. Dr. Francisco Filipak Neto / Co-orientador : Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 27/02/2015 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia celular e molecular / Resumo: O aumento das atividades antropogênicas vem sendo causa de uma crescente eutrofização dos ambientes aquáticos, levando a floração de cianobactérias, dentre as quais algumas produtoras de cianotoxinas potencialmente tóxicas à vida animal e à saúde humana. Desta forma, fazem-se necessárias a avaliação dos principais danos causados pelas toxinas assim como a investigação os mecanismos de toxicidade da cilindrospermopsina (CYN) em células. Particularmente, modelos in vitro empregando a linhagem de hepatocarcinoma humano (HepG2) são importantes para a investigação dos mecanismos de toxicidade das cianotoxinas nas células. O objetivo do presente estudo foi investigar as respostas de células HepG2 frente à exposição a diferentes concentrações da cilindrospermopsina (CYN) através de ensaios de viabilidade celular; atividade das enzimas de biotransformação de fase II (Glutationa S-transferase - GST); sistema de resistência a multidrogas (MDR); ambiente redox celular, quantificação da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio; danos oxidativos a biomoléculas; e alterações na morfologia das células. Além disso, determinou-se se a indução de isoformas do citocromo P450 aumenta a sensibilidade das células à CYN e avaliou-se a expressão diferencial de proteínas (proteoma). A CYN não se apresentou tóxica na concentração de 10 ?g l-1, levando a um aumento da viabilidade e toxicidade celular em células cultivadas com 10% de soro bovino fetal (SBF). A redução da concentração de SBF para 2% e a indução das isoformas do citocromo P450 (CYP) tornaram o metabolismo das células HepG2 mais próximas das células "normais". Após a indução, poucos parâmetros foram alterados, como a peroxidação lipídica. No entanto, baixas concentrações de CYN (inferior ou igual a 10 ?g l-1) induziram um aumento da proliferação e toxicidade celular. Analisando o proteoma das células expostas a CYN, identificaram-se 26 proteínas, as quais estão envolvidas em diferentes processos biológicos como enovelamento de proteínas, efluxo de xenobióticos, defesa antioxidante, metabolismo energético, anabolismo, sinalização, potencial tumorigênico e estrutura do citoesqueleto. Este perfil de proteínas indica que a exposição à CYN leva a um aumento da absorção e oxidação da glicose para proporcionar energia às células responder ao estresse químico. Aumento da proteína G (GPCRs), heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) e dos níveis das espécies reativas de oxigênio (EROs) podem estar provocando o aumento da proliferação celular, e aumento do potencial tumorigênico das células HepG2. O excesso de espécies reativas de oxigênio ativou mecanismos de proteção celular como a multidrug resistance protein (MRP3) e a glutationa peroxidase. As alterações provocadas pela CYN nas proteínas do citoesqueleto também podem estar associadas com a proliferação celular bem como a reposição das proteínas danificadas pelas EROs. Palavras-chave: cianotoxina, cilindrospermopsina, HepG2, CYPs, proteômica, imunofluorescência / Abstract: The increase of anthropogenic activities has been causing eutrophication of aquatic environments, leading to bloom of cyanotoxin-producer cyanobacteria that can thread wildlife and human health. The evaluation of the toxic effects and the mechanisms of toxicity of cyanotoxins such as cylindrospermopsin (CYN) are important issues in toxicology. For these purposes, cell lines such as human hepatocellular carcinoma (HepG2) are very useful in vitro models. The aim of the current study was to investigate the responses of HepG2 cells after exposure to different concentrations of CYN through assays of cell viability; activities of glutathione S-transferase (GST, a phase II biotransformation enzyme) and the efflux transporters involved in multidrug resistance phenotype (MDR); oxygen and nitrogen reactive species levels; oxidative damage to biomolecules; and alterations of cell morphology. In addition, the possibility of increased toxicity to CYN due to cytochrome P450 (CYP) induction and the differential expression of proteins (proteome) have been investigated. CYN at 10 ?g l-1 was not toxic to HepG2 cells, leading to increased cell viability and metabolism in cells cultured with 10% fetal bovine serum (FBS). Decrease of FBS concentration to 2% and induction of CYP isoforms have made HepG2 cells more sensitive to exposure to CYN. After induction, few parameters have changed, e.g., lipid peroxidation. However, CYN at low concentrations (bellow or equal 10 ?g l-1) has induced increases of cell proliferation and metabolism. A total of 26 proteins have been differentially expressed in CYN-exposed cells versus control. These proteins are involved in different biological processes like protein folding, xenobiotic efflux, antioxidant defense, energy metabolism, anabolism, cell signaling, tumorigenic potential and cytoskeleton structure. This protein profile indicates that the exposure to CYN leads to an increased absorption and breakdown of glucose as to provide energy for the cells to respond to chemical stress. Increased G protein (GPCRs), nuclear ribonucleoprotein heterogeneous (hnRNP) and the levels of reactive oxygen species (ROS) may be associated with increased cell proliferation, and increased tumorigenic potential of HepG2 cells. The excess ROS has activated cellular protection mechanisms such as MRP3 and glutathione peroxidase. The changes caused by CYN in cytoskeletal proteins may also be associated with cell proliferation as well as replacement of proteins damaged by ROS. Keywords: cyanotoxin, Cylindrospermopsin, HepG2, CYP, proteomics, immunofluorescence

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 2017 / Inclui referências : f. 55-60 / Resumo: A proteína STI1 foi descrita como uma molécula relacionada ao estresse térmico de leveduras, e por isso é denominada Stress-Inducible Protein 1. Sua homóloga humana é a Hop (Heat-shock organizing protein). Ela tem expressão praticamente ubíqua e é encontrada em vesículas intracelulares, complexo de Golgi ou dispersa no citoplasma. Estudos indicam que esta proteína participa de vários eventos celulares como desenvolvimento de astrócitos, diferenciação de neurônios, neuroproteção, neuritogênese, formação da memória em ratos e proliferação celular em tumor de ovário. Além disso, a STI1 foi também recentemente caracterizada como ligante da GTPase Rnd1. As GTPases de baixa massa molecular são um grupo de moléculas que ciclam entre as formas ativa e inativa. Aquelas pertencentes à subfamília Rnd possuem pouca atividade GTPásica intrínseca, encontrando-se constitutivamente ativas, sendo desse modo diferentes das outras Rho GTPases. A proteína Rnd1 é encontrada principalmente no cérebro, e está envolvida em vários mecanismos celulares, como a inibição de fibras de estresse e a indução da desorganização do citoesqueleto de actina e adesão focal. Além disso, Rnd1 está presente na extensão inicial de neuritos em células PC-12, e no desenvolvimento de dendritos em neurônios hipocampais de ratos. Foi demonstrada que a interação da STI1 com a Rnd1 pode interferir na fenomenologia (colapso do cone de crescimento) desencadeada pelo eixo Sema3A/Plexina-A1. Por outro lado ainda não foi determinado quais são as vias de sinalização que estão a jusante da interação STI1- Rnd1, responsáveis por esta interferência. Desse modo, as proteínas recombinantes GST, GST-RhoA G14V e GST-RBD foram expressas para a realização de ensaios de pulldown visando elucidar o papel de STI1 na atividade de p190RhoGAP e seu substrato RhoA. Primeiramente foi possível detectar que a presença de STI1 ao inativar Rnd1, leva também a inativação de sua ligante p190RhoGAP. Porém, não foi possível esclarecer o papel desta proteína na atividade de RhoA bem como sua atuação na atividade de cofilina. A produção de anticorpo monoclonal anti-Rnd1 também foi um objetivo do presente trabalho, porém apesar da indicação da presença de anticorpos anti-Rnd1 em soro policlonal, não foi possível detectar a clone positivo para este anticorpo na produção de hibridomas. Palavras-chave: GTPases, Rnd1, STI1, atividade. / Abstract: STI1 protein has been described as a yeast thermal stress-related molecule, and is therefore called Stress-Inducible Protein 1. Its human counterpart is Hop (Heat-shock organizing protein). It has virtually ubiquitous expression and is found in intracellular vesicles, Golgi complex or dispersed in the cytoplasm. Studies indicate that this protein participates in several cellular events such as astrocyte development, differentiation of neurons, neuroprotection, neuritogenesis, memory formation in rats and cell proliferation in ovarian tumor. In addition, STI1 has also recently been characterized as GTPase Rnd1 linker. Low molecular weight GTPases are a group of molecules that cycle between active and inactive forms. Those belonging to the subfamily Rnd have little intrinsic GTPase activity, being constitutively active, thus being different from the other Rho GTPases. Rnd1 protein is found primarily in the brain, and it is involved in several cellular mechanisms, such as inhibition of stress fibers and induction of actin cytoskeleton disorganization and focal adhesion. In addition, Rnd1 is present in the initial extension of neurites in PC-12 cells, and in the development of dendrites in hippocampal neurons of rats. It has been shown that the interaction of STI1 with Rnd1 can interfere in the phenomenology (growth cone collapse) triggered by the Sema3A / Plexin-A1 axis. On the other hand, it has not yet been determined which are the signaling pathways that are downstream of the STI1-Rnd1 interaction, responsible for this interference. Thus, the recombinant GST, GST-RhoA G14V and GST-RBD proteins were expressed for pulldown assays to elucidate the role of STI1 in p190RhoGAP activity and its RhoA substrate. First, it was possible to detect that the presence of STI1 when inactivating Rnd1 also leads to the inactivation of its p190RhoGAP ligand. However, it was not possible to clarify the role of this protein in RhoA activity as well in cofilin activity. The production of anti-Rnd1 monoclonal antibody was also an objective of the present work, but despite the presence of anti-Rnd1 antibodies in polyclonal serum, it was not possible to detect the positive clone for this antibody in the production of hybridomas. Key words: GTPases, Rnd1, STI1, activity.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-10-29T09:47:08Z No. of bitstreams: 1 2006_Ana Paula Ferreira Leite.pdf: 1615018 bytes, checksum: a155875e60053bb996f379b5a54f45e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-30T12:15:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Ana Paula Ferreira Leite.pdf: 1615018 bytes, checksum: a155875e60053bb996f379b5a54f45e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-30T12:15:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Ana Paula Ferreira Leite.pdf: 1615018 bytes, checksum: a155875e60053bb996f379b5a54f45e0 (MD5) Previous issue date: 2006-03-31 / A possibilidade de expressão de proteínas constituintes das sedas de aranhas em larga escala com a cinética desejada usando sistemas heterólogos, pode permitir sua aplicação em vários produtos médicos como curativos e microfilamentos de suturas para neurocirurgias. Neste contexto, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula da seda da aranha Nephilengys cruentata, onde foram encontrados, além dos genes estruturais da seda, outros ainda não descritos. Dentre estes, a predição da estrutura primária da seqüência codificante do clone H09, denominada proteína H09, apresentou identidade com uma esfingomielinase-D, principal responsável pelo loxoscelismo, condição clinica produzida por venenos provenientes de aranhas do gênero Loxosceles sp. O objetivo deste trabalho foi o estudo comparativo, filogenético e da expressão da seqüência codificante referente ao clone H09. A transcrição do mRNA correspondente ao clone H09 foi confirmada por meio de Northern Blot e RT-PCR havendo hibridização e amplificação somente para transcritos da glândula da seda de Nephilengys cruentata. De acordo com a análise filogenética, a proteína H09 apresentou um nível de similaridade de 29 a 35% com dez esfingomielinases descritas em Loxosceles sp. Utilizando análise tridimencional comparativa com o mesmo grupo de esfingomielinases e algumas defensinas do banco de dados Swiss-Prot, foi feita a predição da função da proteína H09, que se posicionou entre ambos os grupos indicando uma possível função de defesa. Para obtenção de grande quantidade de proteína H09, a seqüência codificante foi clonada no vetor de expressão pET21a e utilizadas três cepas de E. coli, Origami, PLYSs, que é própria para expressão de gene tóxicos e PRIL que possui copias adicionais de codons raros em E. coli. Estas linhagens foram transformadas na tentativa de expressar a proteína recombinante. Diversos parâmetros como tempo de indução, concentração de IPTG, temperatura de incubação, rotação e meio de cultura foram também testados na otimização do protocolo de expressão. Em nenhuma das condições avaliadas foi detectada a produção de H09 por meio de Western Blot. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The possibility to produce spider silk proteins in large scale and desirable function utilizing heterologous expression systems, will allow its application in different areas of medicine such as microfilaments for neurosurgeries. On these perspectives, a cDNA library from silk glands of Nephylengys cruentata was generated and have allowed the identification of silk-protein-encoding the structural sequences and novel genes still not described. The prediction of the primary structure codifying the clone H09, denominated protein H09, have presented identity with a sphingomyelinase-D, responsible for the disease called Loxocelism, a clinical condition produced by the venom derived from spider of the genus Loxoceles sp. The aim of this work was the comparative phylogenetic study and expression of the codifying sequence of the clone H09. To confirm the transcription of the mRNA related to the H09 clone, a northern blot and a RT-PCR were conducted comparing the silk glands transcripts from the N. cruentata venom. The results have shown that there was hybridization and amplification only in the first one. The phylogenetic analysis of the protein H09 have shown high similarity related with ten sphingomyelinase previously described. The function prediction of the clone H09 was conducted through a tri-dimensional comparative analysis with the same sphingomyelinase group and a few defensins. The results have shown an intermediate position of the clone H09 related to the other proteins. To obtain a large quantity of the protein H09, the codifying sequence was cloned in the vector pET21 and the three strains of E. coli were transformed in order to express the recombinant protein. Several parameters were evaluated such as induction, concentration of IPTG, temperature, shaker speed and culture medium in order to optimize the expression protocol. Among the utilized strains, PLISs is appropriated to express toxic proteins and PRIL carries additional copies of rare codon in E. coli. Among all the evaluated conditions there was no detection of the H09 protein utilizing “Western blot”.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-04-27T20:17:10Z No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-04-27T22:07:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-27T22:07:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_MaryaniAndressaGBezerra.pdf: 7729100 bytes, checksum: 7d54aa00068c38faeeb56a4769c97ce8 (MD5) Previous issue date: 2009 / O desenvolvimento de novos anticorpos recombinantes teve impacto significativo no tratamento de diversas doenças. Contudo, devido a complexidade estrutural da molécula de imunoglobulina, a produção desta em células de mamífero ainda é um desafio. Uma das dificuldades é obter uma produção equimolar das cadeias pesada e leve para a prevenção do acúmulo de cadeias não-montadas, seguido de apoptose por estresse. Em nosso grupo, vimos trabalhando com um anticorpo com potencial imunoregulatório específico para o antígeno CD3 humano. Anticorpos anti-CD3 têm sido utilizados como imunoterápicos na prevenção da rejeição aguda de órgãos transplantados e é considerado um fármaco promissor para o tratamento de doenças auto-imunes. A produção desse anticorpo em cultura de células animais tem se mostrado limitante devido ao baixo rendimento de anticorpo recombinante. Na tentativa de desenvolver estratégias alternativas para aprodução de anticorpo recombinante, foram construídos vetores de expressão, onde o anticorpo inteiro é produzido a partir de construções monocistrônicas, bicistrônicas e tricistrônica em células de mamíferos. As versões monocistrônicas possuem uma seqüência codificadora de um sítio clivável por furina entre as duas cadeias do anticorpo. A versão bicistrônica possui um elemento IRES sintético entre as duas cadeias. Além disso, foi introduzida uma marca seletiva para o antibiótico Geneticina associada ao mesmo cassete de expressão como um cístron extra guiado por outro elemento IRES. Para produção do anticorpo anti-CD3 foram utilizadas as linhagens celulares HEK293 e BHK-21, de forma transiente e estável. Os anticorpos produzidos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados para a produção de imunoglobulina intacta. Os resultados indicam que a construção bicistrônica pMACIA HIL e monocistrônica pMACIA HL são capazes de garantir a expressão de ambas as cadeias de anticorpo. Já as construções monocistrônica pMACIA LH e bicistrônica pMACIA HL IRES neo não foram capazes de produzir o anticorpo recombinante. A construção tricistrônica pMACIA HIL IRES neo foi a construção que se mostrou mais promissora, apresentando estabilidade de produção do anticorpo em transfectomas estáveis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The development of new pharmaceuticals derived from recombinant antibodies had a significant impact in the treatment of various illnesses. However, due to the structural complexity of the immunoglobulin molecule, the production of these molecules in mammal cells is still challenging. One of the difficulties is the equimolar production of heavy and light chains and the prevention of the stress induced by the accumulation of unassembled protein. We are working with a potentially immunoregulatory recombinant humanized antibody specific for the human CD3 antigen. Anti-CD3 antibodioes have been used in the prevention of the acute graft rejection and are considered as a promising pharmaceutical for the treatment of autoimmune diseases. The production of this antibody in culture of animal cells has shown to be problematic due to the low yield of recombinant antibody recovery. In the attempt to create alternative strategies for recombinant production of antibody, monocistronic, bicistronic and tricistronic expression vectors were constructed to coordinate the expression of a complete antibody in mammal cells. The monocistronic versions possess a furin cleavage coding sequence between the both antibody chains. The bicistronic version possesses a synthetic IRES element between the two chains. A selective mark for the Geneticin antibiotic was introduced in the expression cassette as an extra cistron driven by another IRES element. The cell lines HEK293 and BHK-21 were used for transient or stable production of the anti- CD3 antibody. Recombinant antibodies were purified by affinity chromatography and analyzed for the production of intact immuglobulin. The results indicate that the bicistronic construction pMACIA HIL and the monocistronic construction pMACIA HL are capable to express both antibody chains. On the other hand, the monocistronic construction pMACIA LH or the bicistronic construction pMACIA HL IRES neo were not able to produce the recombinant antibody. The tricistronic vector pMACIA HIL IRES neo was shown to be the most promising construction to obtain the whole antibody production in stable transfectomes.

Orientadores: Konradin Metze, Miriam Aparecida da Silva Trevisan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-01T21:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sa_AngelaCurydeMello_M.pdf: 10579190 bytes, checksum: 3e04615de323eedfeef98ac978015de8 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A saponina é um grupo de hemolisinas enzimáticas derivado de uma variedade de plantas, pode ser útil na preparação de amostras hemorrágicas, limpando as hemácias do material de fundo da lâmina. O objetivo de nosso estudo foi investigar se a saponina pode ser usada na remoção de hemácias do material de fundo na rotina, esfregaços citológicos secos ao ar em comparação com fixados imediatamente. A preparação de amostra citológica de figado e linfonodo de cães foi realizada em quadruplicata (imediatamente após a morte do animal) e processada da seguinte maneira: 1. Grupo SFX - Esfregaços foram imediatamente colocados na solução fixadora SFX, composta por 1:1 de álcool a 95% e de formalina tamponada ,e 0,1% de saponina. 2. Coloração convencional (SE) - Esfregaços foram deixados secar ao ar por 30 minutos depois corados por Leishmann. 3. Pós-fixação com álcool 95% (AL) - Esfregaços secos ao ar foram reidratados e incubados em solução de saponina a 0,1%. Depois fixados em álcool 95% e corados pela técnica de coloração modificada GiemsalHematoxilina-Eosina. 4. Pós-fixação com álcool-formol (ALFO) - Esfregaços secos ao ar foram reidratados e incubados em solução de saponina a 0,1%. Depois fixados em álcool-formol e corados pela técnica de coloração modificada Giemsa/Hematoxilina-Eosina...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Saponins, a group of enzyrnatic hemolysins derived from a variety of plants, may be helpful in the preparation of hemorrhagic cell samples by clearing the background. The aim of our study was to investigate, whether saponin may be helpful in removing the red cell background in routine, air-dried cytologic preparations in comparison with immediately fixed slides. Cytologic touch preparations from liver and lymph nodes from mongrel dogs were processed as following: 1. SFX group - Smears were immediately put into the fixative SFX, composed of an aqueous, phosphate buffered solution containing 50% ethanol and 2% formldehyde and 0,1% saponin. 2. Conventional staining (SE) - Smears were air-dried for at least 30 minutes and than stained according to Leishmann. 3. Alcohol- postfixation (AL) - Air dried smears were rehydrated and incubated in a 0,1% saponin solution and then fixed in 95% alcohol and stained with the modified Giemsa-haematoxilin staining. 4. Formol-Alcohol postfixation(FoAL)- Air dried smears were rehydrated and ineubated in a 0,1% saponin solution and then fixed in formalin-alcohol solution and stained with the modified Giemsa-haematoxilin staining...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Anatomia Patologica / Mestre em Ciências Médicas

Orientador : Eliana Regina Forni-Martins / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T01:28:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_AndreaMacedo_M.pdf: 3447178 bytes, checksum: 1bb9e36dfa4dfc35dcdd22e543213ff5 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A família Rubiaceae é composta por plantas de hábito variado e representa a quarta maior família de Angiospermas, com cerca de 10.700 espécies; é cosmopolita e apresenta grande riqueza de espécies no Cerrado brasileiro. Objetivando ampliar o conhecimento cromossômico da família, foi realizado um estudo com 14 espécies pertencentes a duas das subfamílias do grupo, coletadas em áreas de Cerrado no estado de São Paulo (Assis, Campinas, Itirapina,M()gi-GuélÇu e M()gi-Mirim) e Mélto Gro_so_() . Sul (Três Lagoas). Na subfamília Ixoroideae, cinco espécies apresentaram número cromossômico 2n = 22 (Alíbertia concolor, A.edulis, A. sessilis, Genipa americana e Tocoyena formosa), e uma apresentou poliploidia, com 2n = 66 (Amaioua intennedia). No entanto, todos são números múltiplos do número básico mais comum da família, x = 11. Por outro lado, as espécies pertencentes a subfamília Rubioideae exibiram variações entre as tribos e gêneros. observando-se os .números 2n = 20 (Coccocypselum lanceo/atum), 2n = 22 (Psychotria hoffmannseggiana) ou n = 11 (Coussarea hydrangeífolía e Palicourea rigida), 2n = 28 (Borreria latifolia, Borreria verticillata eRichardia brasiliensis) e 2n = 32 (Psychotria deflexa). Foram elaborados os cariótipos de 12 espécies, sendo todos inéditos (à exceção de Genipa americana). assim como a maioria dos números cromossômicos. O tamanho dos cromossomos variou entre 7 ,33 _m e 1 ,26 _m. Os cromossomos são em sua maioria metacêntricos e os cariótipos são simétricos (TF% variando de 47,45 a 38,01). Sugere-se que a maior constância de números cromossômicos em relação ao número básico x = 11 seja um apoio à proposta de que a tribo Ixoroideae seja mais basal na família, ao contrário do que ocorre em Rubioideae, apontada como sendo mais derivada com base em caracteres morfológicos / Abstract: The Rubiaceae family is composed by plants of varied habit and represents the fourth largest family of Angiospermas, with around 10.700 species. The family is cosmopolitan and presents great diversity of species in the Brazilian Cerrado. Aiming to increase the knowledge on the karyotypic characteristics of the family, a cytological study was carried out with 14 species belonging to two of the four subfamilies of the group, (;()11E:!_E:!d in_reas()fCer_a_oin the stateof§ã<? p_ulo (Assis,Cart"1pil1_s, Itirapin_,f / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador : Avelino Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadualde Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yano_DirceMithicoYamaoka_D.pdf: 10184831 bytes, checksum: 698c93baaf6a494eda62da5a1b388f67 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Variações morfológicas do núcleo da alga marinha Acetabularia calyculus (Quoy e Gaimard) foram analisadas com emprego do marcador fluoresoente DAPI em células de diferentes estágios de crescimento dentro de uma cultura sincronizada. Os resultados indicaram que o aumento do volume nuclear correspondia à um grande desenvolvimento dos nucléolos durante o crescimento celular. No estádio que antecede a formação de chapéu (12 mm de comprimento) os nucléolos chegavam a ocupar quase que 80% do núcleo, apresentando estruturas típicas conhecidas como "sausage-like shapes" ; indicando que neste estádio está ocorrendo a síntese de precursores de rRNA em grande escala. Paralelamente, os cromossomos apresentavam-se mais soltos, descondensados, assemelhando-se a cromossomos plumosos, sendo que neste estádio observou-se aIta taxa de síntese de mRNA. Esses resultados foram confirmados com as observações ultraestruturais de células com ápices em crescimento e ápices com início de diferenciação do chapéu. Foram observadas formações de ribossomos ligados às membranas do retículo endoplasmático, ribossomos livres, aparelho de Golgi, vesículas secretoras, cloroplastos e mitocôndrias, indicando grande metabolismo celular resultando na intensa síntese de proteínas. A diferenciação do chapéu está relacionada com a formação de novas paredes celulares. Para tanto há uma necessidade de produção maciça de substâncias precursoras da parede celular. As observações ultraestruturais de ápices de células com início de formação de chapéu evidenciaram a presença de vesiculas secretoras voltadas em direção aos locais de síntese de novas paredes celulares. Essas substâncias precursoras necessárias para síntese de novas paredes celulares, sintetizadas no retículo endoplasmático e no Golgi, são provavelmente transportadas via vesiculas secretoras. A análise dos RNAs sintetizados no núcleo e posterior transporte ao longo de célula, com emprego do isótopo radioativo [3H-uridina, apresentou resultados que corroboram com os demais resultados obtidos nas observações ultraestruturais / Abstract: Morphological variations in the nucleus of the marine algae Acetabularla calyculus (Quoy e Gaimard) were analysed by the use of the fluorescent dye DAPI in cella from different atages of growth in a synchronized culture. The results indicated that the increase in the nuclear volume correaponded to a great development of nucleoli during the cell growth. In the stage before to cap formation (12 mm length) the nucleoli occupied almost 80% of the nucleus, presenting characteriatic structures known as "sausage-like shapes" ; indicating that there is abundant synthesis of rRNA precursors in this stage. At the same time, the chromosomes were unpacked, uncondensed, similar to lampbrush chromosomes, as we observed a high mRNA synthesis in this fase. These results were confirmed by the ultrastructural observations of growing cell tips and cell tipe in the beginning of cap differentiation. Endoplasmatic reticulum membrane-attached ribosomes structures, free ribosomea, Golgi apparatus, secretion vesicles, chloroplasts and mitochondria were visualized at this stage indiçating a high cellular methabolism, resulting in the intense protein synthesis. The cap differentiation is related to the formation of new cellular walls. For that to happen there is a need for an intense production of precursor substances of the cell wall. The ultrastructural observations of cell tips at the beginning of cap differentiation showed the presence of secretion vesicles at the sites of formation of new cell wall. These precursor substances for new cell wall synthesis, produced in the endoplasmatic reticulum and Golgi apparatus, were probably being transported by means of secretion vesicles. The analysis of the radioactive [3H]-uridine RNA¿s synthetised in the nucleus and transported along the cell body presented further support for the ultrastructural observations / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador : Quivo S. Tahin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:01:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guimaraes_Fernando_M.pdf: 6409808 bytes, checksum: b00bbe4789b48d0d1db9bccfd6503ad3 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: O modelo experimental que utiliza a 7.12-dimetilbenzantraceno CDMBA) para induzir dose única do a tumorgênese mamária tem permitido confirmar a importância da ingestão de lipídios no desenvolvimento tumoral. Tem-se atribuido aos ácidos graxos constituintes dos lipídios dietários. Segundo a familia a qual pertencem. alterações observadas no tempo de aparecimento e o número de tumores mamários. após a indução química da tumor gênese. Dessa forma dietas ricas em ácidos graxos poliissaturados CAGPl) da familia n-6 são mais efetivos no crescimento tumoral do que ácidos graxos saturados CAGS) e há evidências de que os ácidos graxos poliinsaturados da familia n-3 teriam um efeito inibitório no crescimento tumoral. Foi objetivo deste pelos trabalho observar as possíveis alterações promovidas lipidios dietários e/ou agente cancerígeno. Afetando o desenvolvimento de ductos e estruturas terminais da glândula mamária, alterações nas populações de células epiteliais dos tipos escuras coe) e intermediárias ClC) é ainda nas populações de mastócitos e eosinófilos relacionados ao tecido mamário. Para Tanto ratas Sprague-Dawley foram alimentadas logo após o desmame com dietas semi-sintéticas. isocalóricas contendo 10% de lip1dios provenierites de diferentes fontes: 1) óleo de girassol COG). rico em ácidos graxos da fam11ia _-6; 2) óleo de sardinha (OS) rico em ácidos graxos n-3 e 3) óleo de coco COC) rico em ácidos graxos saturados. Foram administrados 20 mg de DMBA por intubação gástrica aos 45 dias de idade. Após o término do experimento Caos 60 dias de idade) a segunda glândula mamária toráxica direita foi retirada e processada de forma a se obter montagens totais das mesmas o que permitiu o exame anatómico da estrutura glandular. Em seguida as montagens totais foram desfeitas para inclusão em parafina e corne seriado das glândulas mamárias. Foi observado ao n1vel das montagens totais alterações morfológicas entre as glâdulas mamárias dos diferentes grupos. dietários. Nas glândulas mamárias das ratas alimentadas com a dieta OG ou OC foram obervados um maior número de alvéolos do que nódulos terminais. enquanto naquelas alimentadas com a dieta OS havia maior número de nódulos terminais que alvéolos. Estes resultados indicam graus de amadurecimento glandular diferentes entre os grupos dietários. As populações de De mostraram-se significativamente alteradas entre ratas tratadas com DMBA e seuS respectivos controles. nos ductos do grupo dietário OG (controles 14.69 :t2.34 e tratados com DMBA 13.61 :t2.34) e alvéolos dos rupos dietários OS (controles 15.15 :t2.13 e tratados com DMBA 13.42 :t1 . 94) eoc (controles 15.73 tl.62 e tratados com DMBA 14.05 :t1.93). os quais apresentaram uma redução no número destas células A população de IC mostrou-se significativamente aumentada nas ratas tratadas com DMBA em-relação as controles nogrupo dietário OG. afetando ductos(controles 1.33 :t0.35 e tratados com DMBA 2.31 :t1.44) e alvéolos (controles 1.06 :t0.42 e tratados com DMBA 2.43 :tl.09). Foram observados um menor número de e o sinófilos nas glándulas mamárias de ratas tratadas com DMBA em relação às controles nos grupos dietários ricos em AGPI (OG p< 0.0005 e OS p< 0.005). enquanto na dieta OC (rica em AGS) ocorreu o inverso (p< 0.05). De um modo geral as glândulas de ratas tratadas com DMBA apresentaram um maior número de mastócitos do que o das ratas controles. alteração significativa nas dietas OG Cp< 0.01). OS (p< 0.01) e OC (p< 0.0006). As alterações observadas ao nível das montagens totais :foram discutidas em :função do baixo conteúdo de ácido linoléico na dieta OS e possivel ação dos AGPI n-3. presentes nesta dieta sobre o metabolismo dos AGPI n-6. As alterações nas populações de células epiteliais. Principalmente IC. . sugerem tratar ¿se dos primeiros eventos observados durante acarcinogênese mamária experimental. As variações observadas nas populações de mastócitos e eosinófilos foram discut.idas tanto em termos de uma ação dos liídeos dietários como pela ação experimental associada ao DMBA / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

El objetivo de este estudio es la generación ex-vivo de eritrocitos a partir de la maduración y diferenciación de células CD34+ purificadas de sangre de cordón umbilical. El desarrollo de la terapia celular y la generación de diferentes tipos celulares a partir de células madre ha abierto el campo a la producción de diferentes componentes sanguíneos, entre ellos los eritrocitos, a partir de células madre hematopoyéticas (células CD34+). Existen diferentes fuentes de células CD34+, siendo el cordón umbilical una fuente de fácil acceso y donde éstas presentan una mayor capacidad de expansión. La necesidad de incrementar la tasa de expansión y el paso de enucleación celular son los puntos clave para hacer realidad la posibilidad de generar sangre en el laboratorio que sea equiparable a una unidad de sangre donada. Se han diseñado diferentes estrategias para generar eritrocitos a partir de células CD34+ de sangre de cordón umbilical. Estas estrategias se han basado en la utilización de diferentes medios de cultivo, citocinas, concentraciones celulares y estrategias de cultivo. Para el paso final de enucleación se ha pasado de un co-cultivo sobre capa estromal de células mesenquimales a un cultivo en suspensión celular. Se ha puesto a punto una metodología de cultivo consistente en la combinación de un medio específico con estrategias de alimentación que permiten la expansión y diferenciación de células CD34+ de cordón umbilical a eritrocitos maduros. Todavía son necesarios más ajustes para incrementar la tasa de expansión y optimizar la fase de maduración final. / The aim of this study was the in vitro generation of red blood cells (RBC) from CD34+ cells purified from human umbilical cord blood, offering an alternative to classical transfusion products. Within the hematopoietic stem cell sources, umbilical cord is readily available and it has a greater expansion capacity. Such increase of the expansion capacity and the terminal differentiation efficiency are the key points in the generation of blood in the laboratory. We have tested different methodologies to generate erythrocytes from CD34+ cells from human umbilical cord blood. The parameters investigated related with the increase of the expansion capacity involved the use of different culture media, cytokines, cell seeding density and dilution steps. For the terminal differentiation and enucleation steps, the stromal layer co-culture was switched into a suspension culture with erythropoietin. The erythroid progenitors were characterized by the expression of the surface markers CD45, CD36, CD235 (glycophorin A) and CD71 (transferrin receptor). Enucleated cells were discriminated from nucleated cells by labeling the genetic content. May-Grünwald-Giemsa staining was used for morphological analyses. A culture methodology that combines a specific medium formulation and feeding strategy has been successfully developed in bioreactors allowing the expansion and differentiation of CD34+ cord blood to mature red blood cells. Further improvements are still needed in order to increase the expansion rate and to optimize terminal differentiation step.