51 |
The role of circadian rhythms in epidermal homeostasisJanich, Peggy, 1981- 16 February 2012 (has links)
The
natural
daily
cycles
of
light
and
dark
have
played
a
fundamental
role
in
shaping
the
development
of
an
adaptive
intrinsic
clock
mechanism
which
allows
organisms
to
coordinate
the
function
of
multiple
organs
by
setting
the
correct
circadian
timing
of
cellular
processes
ensuring
proper
homeostasis.
In
mammalian
skin,
homeostasis
is
maintained
by
epidermal
stem
cells
(epSCs).
EpSCs
localize
to
specialized
niches
where
they
undergo
cycles
of
quiescence
and
proliferation.
Several
pathways
are
known
to
play
essential
roles
in
epSC
function;
however,
how
are
these
pathways
spatiotemporally
coordinated,
and
why
not
all
stem
cells
within
the
niche
behave
in
the
same
manner,
is
still
poorly
understood.
We
have
analyzed
the
role
of
the
molecular
circadian
clock
in
fine-‐tuning
the
behavior
of
epidermal
stem
cells.
Using
a
fluorescent
circadian
reporter
mouse
model,
we
demonstrate
that
the
dormant
epidermal
stem
cell
compartment
contains
two
co-‐existing
populations
of
stem
cells
in
different
clock
states.
Global
comparative
transcriptome
analysis
indicated
that
each
clock
population
corresponds
to
a
distinct
predisposition
state
of
response
towards
stem
cell
activating
and
dormancy
cues.
We
provide
evidence
that
the
core
circadian
transcription
factors
BMAL1
and
CLOCK
bind
to
regulatory
elements
in
the
promoters
of
several
of
these
stem
cell
homeostatic
genes,
thus
being
directly
responsible
for
creating
these
two
stem
cell
clock
states.
Unbalancing
this
clock
driven
equilibrium
of
epSCs
in
vivo
resulted
in
progressive
changes
in
the
response
of
stem
cells
to
activating
or
dormancy
cues,
which
led
to
a
progressive
premature
tissue
aging,
and
a
significant
reduction
in
the
development
of
cutaneous
squamous
cell
carcinomas.
Thus,
our
results
indicate
that
the
molecular
clock
machinery
fine-‐tunes
the
spatiotemporal
behavior
of
epidermal
stem cells
within
their
niche,
and
that
perturbation
of
this
mechanism
affects
tissue
homeostasis
and
the
predisposition
to
neoplastic
transformation. / Los
ciclos
naturales
de
luz
y
oscuridad
han
sido
determinantes
en
el
desarrollo
de
un
reloj
molecular
intrínseco
que
permite
coordinar
la
función
de
múltiples
órganos
para
mantener
la
homeostasis
global
del
organismo.
La
homeostasis
del
compartimento
queratinocítico
de
la
piel
depende
de
una
población
de
células
troncales
adultas
epidermales
(epSCs).
Las
epSCs
están
localizadas
en
nichos
específicos
y
especializados
desde
dónde
responden
a
las
necesidades
de
repoblación
celular
del
tejido
mediante
la
alternancia
de
fases
de
quiescencia
y
proliferación.
Varias
rutas
de
señalización
regulan
el
comportamiento
de
las
epSCs;
sin
embargo,
aún
no
entendemos
bien
porqué
no
todas
las
epSCs
se
comportan
de
la
misma
manera
dentro
de
un
mismo
nicho
troncal,
y
cómo
están
coordinadas
a
nivel
espacio-‐temporal.
Hemos
analizado
el
impacto
del
ritmo
circadiano
sobre
las
función
de
las
epSCs.
Mediante
un
ratón
reportero
fluorescente
del
ritmo
circadiano
hemos
demostrado
que
el
nicho
troncal
quiescente
contiene
dos
poblaciones
de
epSCs
en
diferentes
fases
de
su
reloj
molecular.
El
análisis
comparativo
global
del
transcriptoma
de
ambas
poblaciones
indicó
que
las
dos
poblaciones
corresponden
a
dos
estados
opuestos
de
predisposición
a
responder
a
estímulos
de
activación
y
quiescencia.
Mostramos
resultados
que
demuestran
que
los
factores
de
transcripción
circadianos
Bmal1
y
Clock
regulan
directamente
la
expresión
de
genes
que
regulan
el
comportamiento
de
las
epSCs.
La
arritmia
in
vivo
en
las
epSCs
resultó
en
una
pérdida
progresiva
de
la
homeostasis
tisular,
un
envejecimiento
prematuro
y
una
reducción
significativa
en
el
desarrollo
de
tumores
escamosos
de
piel.
Por
lo
tanto,
nuestros
resultados
indican
que
la
maquinaria
del
reloj
molecular
permite
a
las
epSCs
a
anticiparse
y
coordinar
su respuesta
a
estímulos
locales
del
nicho,
lo
que
constituye
un
mecanismo
esencial
para
su
correcta
función
en
el
tejido
|
52 |
Integrative study of gene expression and protein complexesToufighi, Kiana, 1980- 31 October 2014 (has links)
Over the last several decades, the emerging ‘integrated’ view of the cell has triumphed over
the ‘one gene/one protein/one function’ paradigm. This is illustrated by the biologically
opposite effects of key regulatory proteins in different cell types, in established versus
primary cells, and in vitro versus in vivo situations. The persistent theme throughout this
dissertation is the integration of a wide range of data sources for the purpose of
understanding distinct cellular contexts. We first use circadian expression data from human
epidermal stem cells to discover waves of transcripts expressed in tune with known clock
genes and show that time-of-day dependent responses to proliferation/differentiation cues is
important for skin homeostasis. We then combine this expression data with information on
protein structures and complexes to describe how protein-complex assembly is temporally
regulated during differentiation. Lastly, we show that human protein complexes are
composed of a stable ‘core’ and a plastic ‘periphery’ whose tissue-specific expression
allows protein complexes to function in a context-dependent manner. / En las últimas décadas, la emergente vista integrativa de la célula ha triunfado sobre el
paradigma histórico: ‘un gene/una proteína/una función’. Esto es ilustrado por los efectos
biológicos opuestos de proteínas regulatorias clave en cultivos celulares inmortalizados
frente a primarios e in vitro frente a in vivo. El tema persistente en este disertación es la
integración de un amplio set de datos para estudiar los distintos contextos celulares. En
primer lugar, utilizamos los datos de expresión génica obtenidos de células madre
epidérmicas para descubrir las ondas de transcripción expresadas en sintonía con los genes
conocidos de los ritmos circadianos. En este estudio demostramos que las respuestas de las
células madres a las señales de proliferación/diferenciación dependen de hora del día y el
tiempo circadiano es importante para la homeostasis de la piel. Posteriormente,
combinamos estos datos de expresión con la información estructural de proteínas y
complejos proteicos para describir la regulación temporal de complejos durante el proceso
de diferenciación. Por último, mostramos que los complejos de proteínas humanos están
compuestos de un ‘núcleo’ estable y una 'periferia' plástica cuya expresión específica de
tejido celular permite que los complejos de proteínas funcionen de una manera dependiente
del contexto.
|
53 |
Retinoic acid signaling mediates hair cell regeneration by repressing p27kip and sox2 in supporting cellsRubbini, Davide, 1985- 29 April 2016 (has links)
La mort de les cèl•lules ciliades, com a conseqüència de diversos factors com l’envelliment, el soroll elevat o l´ús d’ototòxics, causa sordesa. Els mamífers no tenen la capacitat de regenerar les cèl•lules ciliades. No obstant, els vertebrats inferiors han mantingut aquesta capacitat mitjançant la proliferació de les cèl•lules de suport i/o la seva transdiferenciació. S’ha descrit la via de l’àcid retinoic (AR) com a un factor important durant el procés de regeneració de diversos òrgans. Tanmateix, el paper de la via a l’orella interna és poc conegut. L’estudi del patró d’expressió gènica, anàlisis funcionals i seguiment del llinatge cel•lular, ens ha permès determinar la importància de l’AR durant el procés de regeneració de les cèl•lules ciliades en peix zebra. Després de la mort d’aquestes, el bloqueig de la via de l’AR tant a l’orella interna com a la línia lateral impedeix la seva regeneració i redueix la proliferació de les cèl•lules de suport. Altrament, s’indueix l’expressió dels components de la via de l’AR. Finalment, demostrem que l’AR és essencial per reduir l’expressió de p27kip i sox2 a les cèl•lules de suport permetent que aquestes proliferin de nou. Com a conclusió, he pogut descobrir una nova funció de l’AR durant la regeneració de les cèl•lules ciliades que podria ser rellevant en futures estratègies terapèutiques / Hair cell damage, caused by various insults, results in hearing loss in humans, one of the major health problems nowadays. In mammals damaged hair cells cannot regenerate, whereas lower vertebrates have retained the ability to replace them by inducing cell proliferation of supporting cells and/or their transdifferentiation. Retinoic Acid (RA) has been implicated in several organs regeneration but its role in hair cell regeneration is unknown. A combination of gene expression profiling, functional assays and cell-lineage tracing experiments allows us to highlight the importance of the RA pathway in hair cell regeneration in zebrafish. Regeneration is impaired upon blockade of the RA pathway in both the inner ear and lateral line systems together with a reduction of supporting cell proliferation. Moreover, the expression of RA pathway components is induced during hair cell regeneration, confirming the activation of the pathway. Finally, we demonstrate that RA is critical for downregulating p27kip and sox2 in supporting cells, allowing them to re-enter the cell cycle. This pivotal role of RA could be relevant in the development of future therapeutic strategies
|
54 |
Control of lipid droplets biogenesis by the seipin complex in budding yeastGrippa, Alexandra, 1980- 12 June 2015 (has links)
Most cells store energy in lipid droplets (LDs), specialized storage organelles composed of a neutral lipid core that, during their biogenesis, is packaged into a single phospholipid monolayer decorated with specific proteins. Regulation of LDs size and number requires the function of the conserved ER protein Seipin/Fld1, however the molecular function of this protein remains poorly understood. Yeast seipin Fld1 is in complex with Ldb16, an uncharacterized ER protein. Like fld1Δ cells, LDB16 deletion mutant displays a similar aberrant LDs morphology phenotype: lower number of supersized LDs (SLD) or tiny and clustered LD aggregates, depending on the absence or presence of the phospholipid precursor inositol in the media, respectively. The growth stage of cells also impacts on the relative distribution of these phenotypes: while LD aggregates predominate in dividing cells, SLDs are found primarily in stationary phase cells. We found that the complex formed by Ldb16 and Fld1 is required for normal LDs phenotype. In particular, this dual LD morphology is not observed for any other mutants studied so far suggesting that Fld1/Ldb16 have a unique role in LD biogenesis.
Combining mass spectrometry analysis on purified LDs with light microscopy, we found that the distribution of many ER and LDs proteins is altered in these mutants. Analysis of a subset of proteins enriched at LDs surface in mutant cells indicated that the physical properties of clustered LDs may differ from those of supersized LDs. Moreover our data obtained by following the process of LDs biogenesis in presence or absence of inositol points toward a role for Fld1/Ldb16 complex in organizing membrane domains at LDs assembly site. In the absence of the complex, the segregation between the two compartments could be lost and the assembly of LDs is impaired resulting in defects in phospholipid packing that is exacerbated in inositol presence. We propose a function in facilitating the establishment of LD identity by acting as a diffusion barrier at the ER-LD contact sites / La mayoría de las células almacenan la energía en partículas lipídicas, también conocidas como “lipid droplets” (LD), unos orgánulos especializados compuestos por un núcleo de lípidos neutros que, durante su biogénesis, se empaqueta de forma coordinada en una monocapa de fosfolípidos decorada con proteínas específicas. La regulación del tamaño y número de LDs requiere la función de la proteína conservada de retículo endoplasmático (RE) Seipina/Fld1. Sin embargo, la función molecular exacta de esta proteína no está clara. La seipina/Fld1 de levadura está en complejo con Ldb16, una proteína de RE no caracterizada. Como las células fld1Δ, la deleción del gen correspondiente a esta proteína muestra la misma doble morfología aberrante de LDs: un LD individual y de tamaño gigante (SLD, “single and supersized LD”) o LDs pequeños y agrupados, en función de la ausencia o presencia, respectivamente, del precursor fosfolipídico inositol en el medio.
La fase de crecimiento de las células también influye en la distribución relativa de estos fenotipos: mientras que los agregados de LDs predominan en las células en división, los SLDs se encuentran principalmente en células en fase estacionaria. Observamos que el complejo formado por Ldb16 y Fld1 es necesario para el fenotipo de LDs normal. En particular, esta doble morfología de LDs no se observa en ningún otro mutante estudiado hasta ahora, lo que sugiere que Fld1 / Ldb16 tiene un papel único en la biogénesis de LDs.
Combinando el análisis de espectrometría de masas en LDs purificados con microscopía, se observó que la distribución de muchas proteínas de RE y LDs estaba alterada en estos mutantes. Los cambios observados en un subconjunto de proteínas enriquecidas en la superficie de las LDs, nos indicaron que las propiedades físicas de los LDs agrupados podrían diferir de las de los LDs gigantes. Los datos obtenidos siguiendo el proceso de biogénesis de LD sugieren que el complejo Fld1/Ldb16 organiza dominios de membrana en los sitios de ensamblaje de LDs, y en su ausencia la segregación entre RE y LDs pueden perderse. Proponemos que la función del complejo Fld1/Ldb16 es facilitar el establecimiento de la identidad del LD, actuando como una barrera de difusión en los sitios de contacto RE-LD.
|
55 |
A functional study of the conserved LSM proteins in C. elegans reveals their involvement in the stress response of metazoansCornes Maragliano, Eric, 1987- 24 July 2015 (has links)
Material addicional: http://hdl.handle.net/10230/25608 / Lsm proteins regulate RNA metabolism and are conserved in the three domains of life, typically functioning as RNA-binding complexes involved in a wide range of post-transcriptional mechanisms. Generally, their functions have been explored in unicellular models using biochemical approaches; however their physiological roles in multicellular organisms remain unknown. This gap in knowledge is biomedically relevant since alterations of individual LSM proteins functions have been related to cancer development.
We performed a functional study of the eleven LSM proteins encoded in the C. elegans genome. We found that although lsm-1 and lsm-3 genes are not essential for the viability of the organism, they are required for wild type healthspan. In addition LSM-1 and LSM-3 proteins function in stress responses by promoting cytoplasmic LSM foci formation and influencing Insulin/IGF-like signaling pathway, a major regulator of development and stress response in metazoans. This study uncovers a physiological role for the LSM proteins in multicellular organisms as essential players for healthspan maintenance and stress adaptation. / Las proteínas de la familia Lsm están conservadas desde bacterias a humanos y participan en el metabolismo de ARN. Aunque el estudio de sus funciones ha sido generalmente abordado mediante aproximaciones bioquímicas en modelos unicelulares, sus funciones en organismos multicelulares son desconocidas. Su estudio en organismos modelo es de especial relevancia biomédica ya que la alteración específica de ciertas proteínas Lsm ha sido relacionada con el desarrollo del cáncer.
Mediante el estudio funcional de las once proteínas Lsm presentes en C. elegans, mostramos cómo los genes lsm-1 y lsm-3, pese a no ser esenciales para la viabilidad del organismo, son necesarios para el mantenimiento de su salud. Además, LSM-1 y LSM-3 funcionan durante la respuesta a estrés promoviendo la agregación citoplasmática de proteínas LSM y contribuyendo a la correcta señalización a través de la vía de la Insulina/IGF-like, importante en la regulación del metabolismo y la respuesta a estrés en metazoos. Este estudio destaca el importante papel fisiológico de las proteínas LSM en el desarrollo y la adaptación al estrés de un organismo multicelular.
|
56 |
Autophagy as a cell fate determinant facing drugs and trophic-nutritional deprivationMattiolo, Paolo 08 January 2016 (has links)
The 1st part of the thesis demonstrates that autophagy promotes cell death by an intrinsic apoptotic pathway at the early times of trophic-nutritional deprivation. In this paradigm, autophagy also promotes apoptosis induced by anticancer drugs. At longer times, autophagy displays its assumed protective role on starved cells. Time, being the only determinant of the dual role of autophagy on cell fate, is a novelty that impinges on tumor biology and therapy. The 2nd part of the thesis focuses on the compound 2-phenylethynesulfonamide (PES) with a promising lethal selectivity for cancer cells, already published. PES is an inhibitor of Heat Shock Protein 70 and autophagy, thus impairing cell proteostasis. The thesis reveals a positive feed-back between reactive oxygen species and p53 in the PES mode of action. Finally, PES uncovers an unexpected pro-survival function of BAX protein, precisely the promotion of mitochondrial fusion. / La primera part de la tesi demostra que l'autofàgia promou la mort cel•lular per una via apoptòtica intrínseca a temps inicials de la privació-tròfica nutricional. En aquest paradigma, l'autofàgia també promou l’apoptosi induïda per fàrmacs anticancerosos. A temps més llargs, l'autofàgia mostra el seu paper protector. El temps com a únic determinant de la funció dual de l'autofàgia en el destí cel•lular és una novetat, que incideix en la biologia i teràpia antitumoral. La segona part de la tesi estudia el compost 2-feniletísulfonamida (PES) amb una prometedora letalitat selectivitat pel càncer, ja publicada. PES és un inhibidor de “Heat Shock Protein 70” i autofàgia, fet que trenca la proteostasi cel•lular. La tesi revela una retroalimentació positiva entre espècies reactives d’oxigen i p53 en el mecanisme d’acció de PES. Finalment, PES posa de manifest una funció inesperada i pro-supervivència de la proteïna BAX, concretament promoure la fusió mitocondrial. / La primera parte de la tesis demuestra que la autofagia promueve la muerte celular por vía apoptótica intrínseca a tiempos tempranos de privación trófico-nutricional. En este paradigma, la autofagia también promueve apoptosis inducida por fármacos anticancerosos. A tiempos más largos, la autofagia muestra su papel protector. El tiempo como único determinante de la función dual de la autofagia en el destino celular es una novedad, que incide en la biología y terapia antitumoral. La segunda parte de la tesis estudia el compuesto 2-feniletinosulfonamida (PES) con una prometedora letalidad selectiva por el cáncer, ya publicada. PES es un inhibidor de "Heat Shock Protein 70" y autofagia, lo cual rompe la proteostasis celular. La tesis revela una retroalimentación positiva entre especies reactivas de oxígeno y p53 en el mecanismo de acción de PES. Finalmente, PES pone de manifiesto una función inesperada y pro-supervivencia de la proteína BAX, concretamente promover la fusión mitocondrial.
|
57 |
Sinusoid-lining cells are novel myeloid-endothelial innate cells that form splenic niches for marginal zone B cell activation and plasma cell survivalBarra Quaglia, Carolina M., 1982- 06 October 2014 (has links)
Los sinusoides del bazo humano promueven la lenta percolación de la
sangre, favoreciendo la captura de antígeno por los fagocitos y
linfocitos del sistema inmune local. Estratégicamente posicionadas
delimitando los vasos, e históricamente conocidas como células
retículo-endoteliales, las células que delinean los sinusoides (SLCs),
tienen una biología enigmática y podrían ser vistas como un
componente desconocido del sistema inmunológico. En esta tesis
hemos observado que las SLCs poseían un fenotipo simil-endotelial,
eran específicas de humano y expresaban moléculas típicamente
asociadas al linaje endotelial como el factor de von Willenbrand, y las
moléculas CD31, CD54, CD102, CD105 y CD141. Sin embargo, a
diferencia de las células endoteliales, las SLCs también expresaban
moléculas típicamente asociadas al linaje estromal como la vimentina y
la actina de músculo liso, junto con varias moléculas del linaje mieloide
como CD14, CD36, CD163, MR, DEC-205 y TLR4. A si mismo, las
SLCs evidenciaron una huella genética típicamente macrofágica que
incluía sensores microbianos, receptores de tipo “scavenger”,
mediadores de la respuesta inmunitaria y reguladores de la fagocitosis y
la presentación antigénica. Además de fagocitar antígenos a través de
un mecanismo actina-dependiente, las SLCs secretaban BAFF, APRIL,
IL-6 y CXCL10, induciendo el reclutamiento, la activación y la
supervivencia de células B de la zona marginal, un subtipo celular
especializado en la respuesta de anticuerpos frente a antígenos
provenientes de la sangre. Por lo tanto, las SLCs son células endoteliomieloides
que funcionan como centinelas dotados de funciones
fagocíticas y que ayudan en la producción de anticuerpos. / Sinusoid vessels promote the slow percolation of venous blood
through the red pulp of the spleen, thereby favoring antigen capture
by phagocytes and lymphocytes of the local immune system.
Strategically positioned around sinusoids and historically known as
reticulo-endothelial cells, sinusoid-lining cells (SLCs) have an
enigmatic biology and thus can be viewed as an orphan component of
our immune system. We found here that SLCs were a human-specific
population of endothelial-like cells that expressed typical endothelial
molecules such as von Willenbrand factor, CD31 (PECAM-1), CD54
(ICAM-1), CD102 (ICAM-2), CD105 (endoglin) and CD141
(thrombomodulin). However, unlike endothelial cells, SLCs also
expressed the stromal molecules vimentin and smooth muscle actin
along with several myeloid molecules such as CD14, CD36, CD163,
MR, DEC-205 and TLR4. Accordingly, SLCs showed a prominent
macrophage-like gene signature that included microbial sensors,
scavanger receptors, immune mediators, and regulators of
phagocytosis and antigen presentation. Besides phagocytosing
particulate antigens through an actin-dependent mechanism, SLCs
released BAFF, APRIL, IL-6 and CXCL10, which enhanced the
recruitment, activation and survival of marginal zone (MZ) B cells, a
splenic lymphocyte subset specialized in innate-like antibody
responses to blood-borne antigens. Thus, SLCs are endothelialmyeloid
cells that serve as sentinels endowed with phagocytic and
antibody-enhancing functions.
|
58 |
Sistemes de monitoratge per a cultius de cèl·lules animals adherents desenvolupament i aplicacions em models cel·lulars i tissularsSarró Casanovas, Enric 27 July 2009 (has links)
El cultiu de cèl·lules animals és una tecnologia que disposa d'un gran potencial econòmic i social, cada cop més elevat degut a la pròpia importància de les aplicacions en les que es troben relacionats aquests productes, que es troba enfocat al descobriment, desenvolupament i ús de nous productes biotecnològics. Degut a la major complexitat del cultiu de cèl·lules animals i a les limitacions que presenten envers els cultius de cèl·lules procariotes per a l'obtenció d'elevades concentracions cel·lulars, és necessari dotar el cultiu de cèl·lules animals de tecnologies que permetin optimitzar‐ne la seva expansió cel·lular i poder evitar l'actual suboptimització de la majoria dels processos de cultius de cèl·lules animals, que s'han basat en estratègies de cultiu simples (discontinu) i que limiten fortament les concentracions finals obtingudes. Un dels paràmetres clau en un cultiu de cèl·lules és la concentració cel·lular, essent la màxima concentració cel·lular un dels objectius primordials dels cultius cel·lulars a la fi de poder obtenir la màxima productivitat. No és estrany, doncs, que aquest paràmetre es consideri el més important a monitorar en línia per a aquest tipus de processos. Tot i que la majoria de productes biotecnològics son produïts mitjançant cultius de cèl·lules animals que creixen en suspensió, cada cop existeix un ventall de productes més extens produït exclusivament per cèl·lules adherents, com per exemple quan una línia cel·lular adherent no s'ha pogut adaptar amb èxit cap a un cultiu en suspensió, quan el producte són les pròpies cèl·lules adherents, quan es tracta d'un producte viral o proteic que necessita dels tipus concrets de cèl·lules animals adherents o per a les tecnologies emergents de les cèl·lules mare i l'enginyeria tissular, on la majoria dels llinatges cel·lulars resultants són adherents. La problemàtica però, recau en que moltes de les tecnologies que es troben desenvolupades actualment es varen focalitzar cap als cultius de cèl·lules animals en suspensió, mentre que els cultius de cèl·lules animals adherents es deixaven a banda. El fet que aquestes cèl·lules es trobin adherides formant una monocapa a la superfície del sistema de cultiu i no es trobin en suspensió, implica que les actuals metodologies i sensors comercials utilitzats pel seguiment de la concentració cel·lular en cultius de cèl·lules no adherents i que gaudeixen d'una bona sensibilitat, no siguin aplicables. A més a més, les mesures actuals que s'utilitzen pel monitoratge de cultius de cèl·lules adherents impliquen la utilització de mètodes destructius i fora de línia, obligant a la utilització de diversos cultius en paral·lel per a poder obtenir més d'un valor de concentració cel·lular al llarg d'un creixement cel·lular, amb la variabilitat que això significa. Així doncs, en aquest treball s'ha abordat aquesta problemàtica, amb l'objectiu de desenvolupar i implementar unes tecnologies que permetin el seguiment, en línia, de la concentració cel·lular, ja sigui de forma directa o bé de forma indirecta, mitjançant la seva estimació a partir de la mesura de l'activitat cel·lular, i que pugui abraçar l'ampli ventall de línies cel·lulars existents que creixen en adherència i que disposen de característiques cel·lulars diferents (consums de nutrients, concentracions cel·lulars, necessitats en el medi de cultiu...). / The cultivation of animal cells is a technology that has great economic and social increasingly potentials, due to the very important applications in which these products are related, which are focused on the discovery, development and use of new biotechnology products. Due to the greater complexity of the cultivation of animal cells and its limitations to obtain high cell concentrations when compared to prokaryotic cells, we must develop new technologies which permits the optimization of animal cell cultures in order to prevent the current suboptimitzation of most animal cell cultures processes, which are usually based on simple cultivation strategies (batch) that limit strongly the final obtained cell concentrations. One of the key parameters in cell culture is cell density being, the maximum cell density, one of the main objectives of cell cultures in order to obtain maximum productivity. It's for this reason that it is considered the most important parameter to monitor online. Although most biotechnology products are produced by animal cells that grow in suspension cultures, the products produced exclusively for adherent cells are in constant increase, for example when an adherent cell line can't be successfully adapted to suspension cultures, when the product are the same adherent cells, when a required viral or protein product are only produced by specific types of adherent animal cells or for the emerging stem cell and tissue engineering technologies, where most of its related cell lines are adherent. The problem however, lies in that many of the current technologies have been developed for suspension animal cells, while adherent animal cell lines were left aside. The fact that these adherent cells are attached to the surface forming a monolayer culture system and are not suspended in the medium, means that the current methodologies and commercial sensors with good sensibilities used to monitor cell concentration in suspension cell cultures, can't be used for adherent cells. In addition, the current measurements used to monitor adherent cell cultures involve the use of destructive offline methods, forcing the use of various cultures in parallel in order to obtain different measurements over a whole cell growth, with the variability that it means. Thus, this work has been addressed to solve this problem with the objective to develop and implement some technologies that permits to online monitor of cell using direct methods and indirect methods through their estimation from the measurement of cellular activity, technologies which must permit to monitor cell concentration to the wide range of existing adherent cell lines with different cellular characteristics (nutrient uptake, final cell concentrations, needs in culture medium, etc.).
|
59 |
Anàlisi quantitatiu de l’efecte de l’expressió d’una lipasa recombinant sobre el metabolisme central de Pichia pastorisJordà Murria, Joel 07 June 2013 (has links)
La determinació de fluxos metabòlics constitueix una eina fonamental per a l'anàlisi quantitativa de la fisiologia cel·lular, ja que ens proporciona una mesura del grau d’implicació de les diverses vies en els processos metabòlics així com una visió general del comportament cel·lular. La quantificació exacta de la magnitud dels fluxos de cadascuna de les diferents vies “in vivo” és, per tant, un objectiu important de la fisiologia cel·lular i l'enginyeria metabòlica, especialment en el context de la biotecnologia industrial, l'objectiu principal de la qual és maximitzar la producció del compost d’interès, com ara la producció de compostos químics, biopolímers o d’altres compostos bioactius com ara les proteïnes.
Aquest projecte de recerca s’ha dirigit a contribuir a una millor comprensió de la fisiologia del llevat metilotròfic Pichia pastoris sota l’estrès ocasionat per la producció de proteïnes recombinants. Concretament, aquesta tesi s'ha centrat en l'anàlisi sistemàtica del metabolisme cel·lular a nivell fluxomic i metabolòmic, i com aquests conjunts de dades de diferents nivells poden integrar-se i contribuir a la comprensió dels efectes de la càrrega metabòlica potencialment imposada per la secreció d'una proteïna recombinant i l’efecte del tipus de font de carboni utilitzat.
En el Capítol 2, s’obtingué una descripció consistent de la composició principal de la biomassa de P. pastoris per a cada condició de cultiu realitzada en aquest estudi. Els resultats obtinguts han estat utilitzats en els capítols següents per realitzar l'anàlisi de fluxos metabòlics.
En el Capítol 3, es realitzaren experiments amb marcatge 13C fraccional biosintèticament dirigit (BDF). Els experiments es realitzaren en cultius operats en continu de P. pastoris creixent amb barreges de glucosa/metanol com a font de carboni, per tal d’obtenir informació sobre les relacions entre fluxos de les principals vies metabòliques del metabolisme central d'aquest llevat. Es desenvoluparen noves equacions pel cas de la mescla de font de carboni mixta glucosa/metanol utilitzada. Seguidament, aquestes relacions foren utilitzades per dur a terme l'anàlisi de fluxos metabòlics de les diferents soques de P. pastoris secretores d'una lipasa recombinant (les quals tenien 1 i 2 còpies del gen que codifica la lipasa). La principal característica obtinguda, reflectida en els diferents quocients de fluxos metabòlics i les dades macroscòpiques dels cultius, fou la similitud en les estimacions finals de fluxos entre les dues soques productores de lipasa. No obstant, s’observaren diferències estadísticament significatives al comparar ambdues soques amb la soca control de referència (no productora).
Durant el Capítol 4, seguint la mateixa metodologia comentada en el capítol anterior, s’estudià l’efecte de la taxa de dilució i diferents relacions de barreges glicerina/metanol com a font de carboni en cultius en continu de P. pastoris amb una única còpia del gen de la lipasa . Concretament, es realitzaren cultius a dues velocitats de dilució per tal d’avaluar l'impacte combinat de la composició de les diferents mescles de fonts de carboni i velocitat de creixement sobre la distribució de fluxos intracel·lulars. Les dades experimentals obtingudes en aquest estudi es combinaren amb dades de marcatge 13C obtingudes en experiments previs sota les mateixes condicions. No obstant, com a conseqüència de la utilització de glicerina en lloc de glucosa, no fou possible la utilització de les equacions de flux formulades en el capítol anterior. Per tant, com a solució alternativa, s’implementà una metodologia basada en l'avaluació global de la xarxa metabòlica per tal de calcular la distribució de fluxos. Curiosament, no s’observaren diferències estadísticament significatives en la distribució de fluxos quan es compararen els diferents cultius amb diferent relació de glicerina/metanol realitzats sota la mateixa taxa de dilució. D’altra banda, si que s’observaren clares diferències en el moment de comparar els patrons de flux corresponents a diferents taxes de dilució.
Les diferents anàlisis metabolòmiques es descriuen en els Capítols 4 i 5. En el Capítol 5, s’aplicà una anàlisi metabolòmica juntament amb una distribució de fluxos en condicions isotopomèriques no estables (condicions de marcatge 13C en dinàmic) per a caracteritzar el metabolisme central de carboni de la soca de referència (control) de P. pastoris creixement amb glucosa/metanol com a font de carboni mixta. Una nova metodologia basada en les dades de marcatge obtingudes mitjançant GC-MS i LC-MS ens va permetre una quantificació més precisa dels diferents fluxos metabòlics per a les vies de les pentoses fosfat, la glucòlisi i la via d'assimilació del metanol. Posant com a referència els resultats obtinguts en el capítol 3, aquesta nova metodologia permeté determinar una distribució de fluxos més amplia i acurada. Així mateix, es realitzà una anàlisi termodinàmica de les dades de metabolòmica , la qual ens va permetre validar les concentracions de metabòlits mesurades i les direccions dels fluxos calculades. Finalment, en el Capítol 6, es realitzà una comparació fluxòmica i metabolòmica entre les diferents soques utilitzades en aquesta tesi, a més a més d'una altra soca amb més de 2 còpies del gen de la lipasa disponible en el Grup de recerca. Els resultats obtinguts no mostraren diferències estadísticament significatives entre les diferents soques productores en termes de distribució global dels fluxos. Ara bé, s'observaren diferències locals estadísticament significatives en alguns punts de la xarxa metabòlica. A més, l'anàlisi metabolòmica, revelà diferències clares entre la soca control i la productora, com ara la concentració de trehalosa, metabòlit estretament lligat a respostes d’estrès.
En general, durant aquesta tesi s’ha portat a terme amb èxit la implementació de noves metodologies per a l'anàlisi dels fluxos metabòlics de P. pastoris. Aquestes metodologies han estat comparades i posteriorment validades. A més a més, utilitzant les diferents dades metabolòmiques obtingudes, ens ha permès expandir la xarxa metabòlica proposada durant els primer capítols d’aquesta tesi, ampliant així el coneixement sobre l’impacte de producció d’una proteïna recombinant sobre el metabolisme central del carboni de P. pastoris creixent sobre fonts de carboni mixtes. / Determination of metabolic fluxes constitutes a fundamental tool for quantitative analysis of cell physiology, as they provide a measure of the degree of engagement of various pathways in metabolic processes and overall cellular function. Accurate quantification of the magnitude of pathway fluxes in vivo is, therefore, an important goal of cell physiology and metabolic engineering, especially in the context of industrial biotechnology, where the aim is to convert as much substrate as possible into useful products such as chemicals, chemical building blocks, biopolymers or bioactive compounds such as proteins.
This research project was aimed to contribute to the better understanding of the Pichia pastoris physiology under recombinant protein production stress. Specifically, this thesis was focused on the systematic analysis of cell metabolism at the fluxome and metabolome omics levels, and how datasets from these different levels can be integrated and contribute to the understanding of the impact of the potential burden imposed by the secretion of a recombinant protein and the type of mixed carbon source used.
In Chapter 2, a consistent description of the biomass principal component of P. pastoris was obtained for each condition tested in this study, obtaining the best estimation of the biomass composition. The obtained results were afterwards used in the following chapters to perform the metabolic flux analysis.
In Chapter 3, biosynthetically directed fractional 13C-labelling (BDF) experiments were performed in chemostat cultures of P. pastoris growing on a glucose/methanol mix, obtaining information about the principals metabolic flux ratios of the central carbon metabolism of this yeast. New equations were developed for the case of “glucose/methanol” as a mixed carbon source. Afterwards, these values were used to perform the metabolic flux analysis of two P. pastoris strains secreting different amounts of a recombinant lipase (corresponding to strains harbouring 1 and 2 copies of the lipase encoding gene). The most prominent feature obtained, already indicated by the metabolic flux ratios and the macroscopic data, was the similarity in flux estimations between the two lipase producing strains. Nevertheless, statistical differences were observed when comparing the control (non-producing) strain to the production strains.
In Chapter 4, using the same experimental approach as in chapter 3, chemostat cultures of the P. pastoris strain harbouring one copy of the lipase gene growing on 3 different “glycerol/methanol” and 2 dilution rates were performed to evaluate the impact of carbon mix compositions and growth rate on the flux distribution. Experimental data was combined with existing 13C-labelling datasets obtained from previous BDF experiments performed on replica experiments. However, due to the use of glycerol instead of glucose, it was not possible to use the equations formulated in the previous chapter. Hence, an alternative approach based on the global evaluation of the metabolic network was done in order to calculate the final flux distribution. Interestingly, no statistical differences were observed when the experiments were done under a given dilution rate varying the glycerol-methanol concentrations. Nevertheless, clear differences were observed when comparing flux patterns corresponding to different dilutions rates.
The metabolome analyses were performed in Chapters 4 and 5. In Chapter 5, metabolomic and instationary 13C flux analysis was applied to characterize the central carbon metabolism under “glucose/methanol” co-assimilating conditions, using the same reference control strain from Chapter 3. A new methodology based on GC-MS and LC-MS derived data allowed for an accurate mapping of metabolic fluxes for the glycolytic, pentose phosphate and methanol assimilation pathways. Compared with the results obtained in Chapter 3, more fluxes could be determined. Furthermore, using thermodynamic metabolic network analysis of metabolome data allowed validating metabolite measurements and metabolic flux directions.
Finally in Chapter 6, a fluxome and metabolome comparison between the strains used in this thesis plus another strain harbouring five copies of the lipase gene was performed. The results showed no statistical differences between the tested strains in terms of global flux distribution, however we observe statistical differences in some fluxes of the metabolic network. Nevertheless, metabolome analysis, revealed some clear differences for example in the trehalose pool, as a result of the impact of protein secretion in the metabolite concentration pools.
Overall, during this thesis we have succeeded in establishing new methodologies for the analysis of Pichia pastoris flows. These methodologies have been compared and validated. Moreover using the metabolomics data obtained has allowed us to expand the metabolic network proposed in the early chapters increasing the knowledge about the impact of a recombinant protein production using different carbon sources as a mixed substrates.
|
60 |
Caracterização do genoma de uma ameba de vida livre (Acanthamoeba castellanii) / Characterization of the genome of a free-living amoeba (Acanthamoeba castellanii)Marzzoco, Anita 18 November 1974 (has links)
O trabalho descreve um método para isolamento de núcleos morfologicamente intacto e fisiologicamente ativos, além da caracterização parcial do DNA de Acanthamoeba castellanii (linhagem Neff). O DNA celular total de trofozoitos contém quatro famílias com diferentes velocidades de renaturação. A fração com renaturação mais lenta (DNA \"único\"), corresponde ao DNA nuclear (86% do genoma) e apresenta características cinéticas compatíveis com uma complexidade de sequência igual a 1,46x1011 daltons. O DNA reiterado (14% do genoma), compreende três famílias de sequências de nucleotídeos, denominadas \"rápidas\", \"intermediária\" e \"lenta\", com complexidade cinética respectivamente igual a 1,5x106; 2,1x10<SUP.7 e 2,6x108 daltons, presentes em aproximadamente 3x103, 3x102 e 50 cópias. As famílias de DNA reiterado têm localização predominantemente citoplasmática, sendo que as famílias \"intermediárias\" e \"lentas\" fazem parte do genoma mitocondrial. O comportamento cinético heterogêneo do DNA mitocondrial e sua complexidade assemelham-se aos dados existentes para outros microrganismos eucariotos. A constatação de uma espécie de DNA extramitocondrial pode ser relacionada com a descrição anterior de corpúsculos citoplasmáticos contendo DNA ou com a extrusão de cromatina para o citoplasma, verificada no início do encistamento. O DNA de trofozoitos também foi caracterizado quanto ao padrão de sedimentação em gradientes de densidade, desnaturação térmica e composição de bases. O DNA celular total apresenta dois componentes em gradientes de CsCl, caracterizados por densidade de flutuação iguais a 1,717 g/cm3 (Componente maior) e 1,692 g/cm3 (componente menor). O perfil de fusão do DNA mitocondrial sugere heterogeneidade de composição de bases. / Abstract not available.
|
Page generated in 0.0652 seconds