Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo del presente estudio fue evaluar la distribución de los gránulos corticales (GC)en el citoplasma ovular, y su relación con el desarrollo meiótico en ovocitos caninos durante la maduración in vitro (MIV) a las 48, 72 y 96h, comparados con aquellos ovocitos no sometidos a cultivo (no madurados) y ovocitos madurados in vivo (ovulados). La distribución de los GC durante la MIV e in vivo fue evaluada a través de la tinción con la lectina lens culinaris conjugada con FITC mediante microscopia de epifluorescencia, en tanto, la configuración cromatínica se evaluó paralelamente mediante la tinción con DAPI y microscopia de epifluorescencia. A través del tiempo de incubación se pudieron establecer tres patrones de distribución de los GC que indicarían el movimiento de estas estructuras durante el proceso de maduración del ovocito. El patrón A, Homogéneo liso; en el cual la marca fluorescente se presentó fina y homogénea en todo el citoplasma ovular, Patrón B, Homogéneo granuloso; pequeñas agrupaciones o conglomerados de aspecto granular (“Clusters”) distribuidos uniformemente por todo el citoplasma, Patrón C, Granuloso cortical; de aspecto granular, en la cual los gránulos se ubicaron inmediatamente por debajo de la membrana plasmática del ovocito en todo su perímetro. El patrón A, se observó sólo en ovocitos en vesícula germinativa (VG) (19%), y fue encontrado sólo en ovocitos no madurados, no obstante la mayoría (p<0,05) de los ovocitos en VG presentó el patrón B, observándose mayoritariamente (p<0,05) en ovocitos no madurados (94%), también en ovocitos madurados en cultivo por 48h (4%), disminuyendo (P<0.05) al aumentar el tiempo de cultivo hasta las 96h. El patrón C se observó sólo en aquellos ovocitos sometidos a MIV aumentando significativamente con el tiempo de cultivo, además de observarse en todos (100%)los ovocitos ovulados. A medida que el tiempo transcurrió, la maduración meiótica progresó sólo con el tiempo de cultivo a una tasa menor que la alcanzada por los GC durante la MIV, a pesar de observar que ovocitos con una distribución cortical o periférica de los gránulos (patrón C), aumentaron en estados nucleares de metafase I (MI) y metafase II (MII) con el tiempo de cultivo. Además considerando que el desarrollo meiótico sólo alcanzó un 27 % de MII a las 96 h en comparación al 90% de ovocitos ovulados en MII, es posible establecer que sólo la distribución de los GC progresaría paralelamente al tiempo de cultivo indicando con esto que la maduración citoplasmática evaluada a través de la migración de estas vesículas no ocurre coordinadamente con la maduración nuclear

O Fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) produzido em Escherichia coli é uma proteína não glicosilada com 175 aminoácidos, de grande importância clínica para o tratamento de neutropenias. O presente trabalho propõe a construção de dois sistemas de expressão em E. coli, um sistema para obtenção do rhG-CSF no citoplasma e outro para secreção da proteína recombinante no meio de cultura utilizando a sequência sinal da L-asparaginase II. Os dois sistemas de expressão foram testados e comparados. A partir desses dados, passou-se para as etapas de obtenção do rhG-CSF com o sistema de expressão sem a sequência sinal. As etapas de renaturação e purificação foram eficientes obtendo-se uma proteína com adequado grau de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. Essa proteína também foi utilizada com sucesso para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Com os resultados obtidos, a proteína rhG-CSF mostrou-se viável para estudos posteriores em bioreatores e produção em escala-piloto. / The recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) is a non-glycosylated protein with 175 amino acids. This factor plays an important role in hematopoietic cell proliferation and has been widely used for treating neutropenia. The purpose of this work is to construct two expression systems in E. coli; a system for obtaining rhG-CSF in the cytoplasm and the other for secretion of recombinant protein in the culture medium using the signal sequence of L-asparaginase II. The two expression systems were tested and compared. From these data, the next steps for obtaining the rhG-CSF were done with the expression system without the signal sequence. The refolding and purification steps were efficient, resulting in a protein with adequate purity, structural integrity and biological activity. This protein has also been successfully used for the production of polyclonal antibodies in mice. With these results, the protein rhG-CSF was feasible for further studies in bioreactors and pilot scale production.

O Fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) produzido em Escherichia coli é uma proteína não glicosilada com 175 aminoácidos, de grande importância clínica para o tratamento de neutropenias. O presente trabalho propõe a construção de dois sistemas de expressão em E. coli, um sistema para obtenção do rhG-CSF no citoplasma e outro para secreção da proteína recombinante no meio de cultura utilizando a sequência sinal da L-asparaginase II. Os dois sistemas de expressão foram testados e comparados. A partir desses dados, passou-se para as etapas de obtenção do rhG-CSF com o sistema de expressão sem a sequência sinal. As etapas de renaturação e purificação foram eficientes obtendo-se uma proteína com adequado grau de pureza, integridade estrutural e atividade biológica. Essa proteína também foi utilizada com sucesso para a produção de anticorpos policlonais em camundongos. Com os resultados obtidos, a proteína rhG-CSF mostrou-se viável para estudos posteriores em bioreatores e produção em escala-piloto. / The recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) is a non-glycosylated protein with 175 amino acids. This factor plays an important role in hematopoietic cell proliferation and has been widely used for treating neutropenia. The purpose of this work is to construct two expression systems in E. coli; a system for obtaining rhG-CSF in the cytoplasm and the other for secretion of recombinant protein in the culture medium using the signal sequence of L-asparaginase II. The two expression systems were tested and compared. From these data, the next steps for obtaining the rhG-CSF were done with the expression system without the signal sequence. The refolding and purification steps were efficient, resulting in a protein with adequate purity, structural integrity and biological activity. This protein has also been successfully used for the production of polyclonal antibodies in mice. With these results, the protein rhG-CSF was feasible for further studies in bioreactors and pilot scale production.