Les miopaties inflamatòries (MI) es defineixen com a malalties musculars amb presència d'infiltrats inflamatoris a la biòpsia muscular. Hem estudiat la miositis per cossos d'inclusió (MCI), la dermatomiositis (DM) i les disferlinopaties (DISF) perque hem aconseguit sèries de malalts llargues clínicament ben definides. En el primer treball es va estudiar la freqüènica i possible rellevància immunopatogènica de banda monoclonal (BM) en malalts amb MCI. Per això vàrem estudiar el sèrum de 70 malalts amb MCI i 80 controls. Es van analitzar per immunofixació, immunohistoquímica (IH), ANAs, immunoprecipitació (IP) d'ARNs i Western-Blot (WB). Un 22.8% de malalts amb MCI presentaren banda monoclonal. Els ANAs i la IP de ARNs no foren significatius. Alguns sèrums reconeixien mionuclis per IH. El WB va revelar reactivitat contra diversos antígens musculars amb més freqüència a la MCI i BM. Concluim que la MCI, sense tenir en compte l' edat, s'associa més freqüentment a BM, que sovint reconeix antígens musculars, especialment mionuclis, suggerint una desregulació immunològica. En el segon i tercer treballs es va estudiar el paper dels factors de transcripció STAT, i especialment STAT1 en la patogènia de la de DM. Es varen estudiar biòpsies de DM, polimiositis (PM), músculs isquèmics i controls, així com cultius primaris de múscul esquelètic (CPME) humà estimulats amb diferents citoquines/factors de creixement. La anàlisi es va realitzar mitjançant IH, WB i RT-PCR semiquantitativa. Es va observar un augment d'expressió de STAT1 en les fibres perifasciculars (FP) a la DM i no a la resta de biòpsies estudiades on només hi havia expressió als infiltrats inflamatoris. En els CPME només l' IFN-g i no altres citoquines/factors de creixement estudiats augmentava la expressió de STAT1. A més es va observar una expressió incrementada de catepsines B i L a les FP i no en les altres miopaties estudiades. Els nivells de Bclx-l també estaven augmentats i els de Fas es manteniren a nivells basals. La fludarabina bloquejava els efectes del IFN-g. Concluim d'aquests treballs que l'expressió augmentada de catepsines a les FP a la DM pot contribuir a la seva patogènia junt amb un fenòmen d'isquèmia, que el model de CPME pot ser d'utilitat en l'estudi del paper de les citoquines a les MI i que la fludarabina pot ésser d'utilitat en el tractament de malalts amb DM resistents a altres tractaments. En el darrer treball es va caracteritzar la inflamació en malalts amb DISF, un tipus de distròfia muscular lligada a un gen (disferlina) descrit molt recentment, i es va observar un predomini de macròfags amb un nombre reduït de limfòcits T CD8+ amb una absència d'expressió de complex d'histocompatibilitat de classe I (MHC-I). Concluim que en malalts joves amb debilitat de cintures esporàdica, CK molt aixecades, fibres necròtiques, infiltrats endomisials i/o perivasculars, sense augment de MHC-I a la biòpsia muscular, s'ha de plantejar un diagnòstic de DISF ja que en les fases inicials de la malaltia els signes de distròfia muscular poden ser molt lleus. / Las miopatías inflamatorias (MI) se definen como enfermedades musculares con presencia de infiltrados inflamatorios en la biopsia muscular. Hemos estudiado la miositis por cuerpos de inclusión (MCI), la dermatomiositis (DM) y las disferlinopatías (DISF) porque hemos conseguido series de enfermos amplias clínicamente bien definidas. En el primer trabajo se estudió la frecuencia y posible relevancia inmunopatogénica de banda monoclonal (BM) en enfermos con MCI. Para ello estudiamos el suero de 70 enfermos con MCI y 80 controles. Se analizaron mediante inmunofijación, inmunohistoquímica (IH), ANAs, inmunoprecipitación (IP) de ARNs y Western-Blot (WB). Un 22.8% de enfermos con MCI presentaron banda monoclonal. Los ANAs y la IP de ARNs no fueron significativos. Algunos sueros reconocían mionúcleos por IH. El WB reveló reactividad contra diversos antígenos musculares con más frecuencia en la MCI y BM. Concluimos que la MCI, sin tener en cuenta la edad, se asocia con más frecuencia a BM, que a menudo reconoce antígenos musculares, especialmente mionúcleos, sugiriendo una desregulación inmunológica. En el segundo i tercer trabajos se estudió el papel de los factores de transcripción STAT, y especialmente STAT1 en la patogenia de la DM. Se estudiaron biopsias de DM, polimiositis (PM), músculos isquémicos y controles, así como cultivos primarios de músculo esquelètico (CPME) humano estimulados con distintas citoquinas/factores de crecimiento. El análisis se realizó mediante IH, WB y RT-PCR semicuantitativa. Se observó un aumento de expresión de STAT1 en las fibras perifasciculares (FP) en la DM y no en el resto de biopsias estudiadas donde sólo había expresión en los infiltrados inflamatorios. En los CPME sólo IFN-g y no otras citoquinas/factores de crecimiento estudidos aumentaba la expresión de STAT1. Además se observó una expresión aumentada de catepsinas B y L en las FP y no en las otras miopatías estudiadas. Los niveles de Bclx-l también estaban aumentados y los de Fas se mantuvieron a niveles basales. La fludarabina bloqueaba los efectos del IFN-g. Concluimos de estos trabajos que la expresión aumentada de catepsinas en las FP en la DM puede contribuir a su patogenia junto con un fenómeno de isquemia, que el modelo de CPME puede ser de utildad en elestudio del papel de las citoquinas en las MI y que la fludarabina puede ser de utilidad en el tratamiento de enfermos con DM resistentes a otros tratamientos. En el último trabajo se caracteritzó la inflamación en enfermos con DISF, un tipo de distrofia muscular ligada a un gen (disferlina) descrito muy recientemente, y se observó un predominio de macrófagos con un número reducido de linfocitos T CD8+ con una ausencia de expresión de complejo de histocompatibilidad de clase I (MHC-I). Concluimos que en enfermos jóvenes con debilidad de cinturas esporádica, CK muy elevadas, fibras necróticas, infiltrados endomisiales y/o perivasculares, sin aumento de MHC-I en la biopsia muscular, se ha de plantear un diagnóstico de DISF ya que en las fases iniciales de la enfermedad los signos de distrofia muscular pueden ser muy leves. / The inflammatory myopathies (MI) can be defined as muscular diseases that show inflammatory infiltrates in the muscle biopsy. We have studied inclusion bosy myositis (IBM), dermatomyositis (DM) and disferlinopathies (DYSF) because we have gathered long series of patients clinically well-defined. In the first paper we studied the frequency and possible immunopathologic relevance of monoclonal gammopathy (MG) in patients with IBM. We studied sera of 70 patients with IBM and 80 controls. We performed immunofixation, immunohistochemistry (IH), ANAs, RNA immunoprecipitation (IP) and Western-Blot (WB). 22.8% of IBM patientspresented MG. ANAs and RNA IP were not significant Some sera recognized myonuclei in the IH. WB showed reactivity against several muscle antigens, more frequently in IBM with MG. We conclude that IBM, regardless of age, is frequently associated with MG, that often recognizes muscle antigens, specially myonuclei, suggesting and immunologic disregulation in these patients. In the second and third papers we studied the role of transcription factors STAT, specially STAT1 in the pathogenesis of DM. We studied both, muscle biopsies of DM, polymyositis (PM), ischemic muscles and controls, and human skeletal muscle primary cultures (SMPC) stimulated with diferent cytokines/growth factors. We performed IH, WB and semiquantitative RT-PCR . We observed an increased expression of STAT1in perifascicular muscle fibers (PF) in DM and not in the other biopsies studied, where only inflammatory infiltrates were positive. In the SMPC only IFN-g and not other cytokines/growth factors studied was able to upregulate the expression of STAT1. Furthermore, an increased expression of cathepsins B and L was observed at the PF in DM and not in the other biopsies studied. Bclx-l levels were also raised whereas Fas expression remained unchanged. Fludarabine blocked IFN-g effects. We conclude from this work that increased expression of cathepsins at the PF in DM may contribute to its pathology together with the ischemia, SMPC can be useful to study the role of cytokines in IM and that fludarabine may be useful in the treatment of patients with DM who are resistant to other therapies. In the last paper we characterized inflammation in patients with DYSF, a type of muscle dystrophy linked to a gene (dysferlin) recently described, and we observed an increased number of macrophages, a reduced number of T CD8+ lymphocytes together with a lack of histocompatibility complex class-I (MHC-I) expression. We conclude that in young patients with sporadic limb girdle weakness, high CK levels, necrotic fibers, endomysial and/or perivascular infiltrates, without raised expression of MHC-I, a diagnosis of DYSF should be considered, specially at the initial stages of the disease when the dystrophic features may be very benign.

El objetivo de esta tesis ha sido estudiar y analizar las modificaciones estructurales, mecánicas y funcionales que se producen en un proceso inflamatorio en general y en concreto en un episodio de isquemia cerebral.El trabajo realizado se compone de dos partes: i) estudio del efecto de un proceso de isquemia-reperfusión sobre las propiedades estructurales, mecánicas y miogénicas en la arteria cerebral media de rata. ii) estudio mediante un modelo "in vitro" de inflamación que consiste en la incubación de las arterias en medio de cultivo con una de las citoquinas (IL-1ß) que se sobrexpresan después de un período de isquemia-reperfusión, sobre las propiedades estructurales, mecánicas y funcionales de la arteria mesentérica de resistencia de rata.El proceso de isquemia (90 minutos)-reperfusión (24 horas) produjo los siguientes cambios en la arteria cerebral media: 1) disminución importante del tono miogénico acompañado por un aumento en la producción de aniones superóxido 2) incremento en el tamaño de la pared vascular debido al aumento en el número de células adventicias 3) aumento en el tamaño de las fenestras de la lámina elástica interna, hecho que podría asociarse al aumento en la elasticidad intrínseca observado en estas arterias 4) disminución del estrés de la pared como consecuencia del aumento en el tamaño de la misma 5) este proceso también modificó aunque con menor intensidad, algunos de los parámetros estructurales analizados en arterias del lado contralateral . Estos cambios, se deban probablemente a alteraciones sistémicas consecuencia de la isquemia focal.La incubación de las arterias mesentéricas de resistencia en medio de cultivo con IL-1ß durante 14 horas: 1) no modificó ni la estructura ni la mecánica de la pared arterial 2) empeoró las relajaciones dependientes de óxido nítrico sin afectar a la capacidad vasorelajadora general del vaso. El empeoramiento de la relajación parece ser debido, al menos en parte, a una disminución en la biodisponibilidad del óxido nítrico 3) aumentó la producción de anión superóxido en la pared vascular que parecería estar sintetizado principalmente por la xantina oxidasa. Los aniones superóxido producidos por acción de la xantina oxidasa serían los principales responsables de la disminución en la biodisponibilidad del óxido nítrico, que a su vez sería el responsable de la disminución de las respuestas relajantes mediadas por óxido nítrico.Estos resultados indicarían que la arteria cerebral media sufre una serie de cambios provocados por el proceso de isquemia-reperfusión que permitirían a estas arterias adaptarse a los cambios en el flujo sanguíneo necesarios para reducir el daño neuronal, mejorando la irrigación del cerebro después de un episodio de isquemia-reperfusión. El efecto de las citoquinas durante este período podría también afectar a las respuestas funcionales de las arterias debido al aumento en la producción de anión superóxido observado en esta patología. Las aportaciones de estos estudios podrían en un futuro abrir líneas de investigación que podrían contribuir al diseño de nuevos fármacos con capacidad para prevenir episodios de isquemia cerebral. / The aim of the present study has been to analyse the structural, mechanical and functional alterations that take place in an inflammatory process as cerebral ischaemia.Our results are divided in two parts: i) a study of the effect of ischaemia-reperfusion on structural, mechanical and myogenic properties of rat middle cerebral artery and ii) to analyze, using an in vitro model of inflammation, the effect of incubation with IL-1ß, one of several cytokines that is overexpressed after a period of ischemia-reperfusion, on structural mechanical and functional properties of rat mesenteric resistance arteries. The occlusion of the right middle cerebral artery (90 minuts) following 24 hours of reperfusion produced: 1) a decrease of myogenic tone together with an increase in superoxide anion production 2) an enlargement of the vascular wall due to the increase in the total number of adventitial cells 3) an enlargement of fenestrae area of the internal elastic lamina that was associated with the increase on intrinsic elasticity observed in these arteries 4) a diminished wall stress as a result of the increase in the wall thickness 5) ischaemia-reperfusion also modified although to a lesser degree, some of the structural parameters in arteries from the contralateral side of ischemia. These changes observed in the contralateral side could likely be associated to systemic alterations produced as a consequence of focal ischaemia. Fourteen hours incubation of mesenteric resistance arteries in culture medium with IL-1ß: 1) did not modify either the structure or the mechanics of the arterial wall; 2) impaired nitric oxide dependent relaxation without affecting the vasodilatation capacity of the arteries. The impairment of nitric oxide induced relaxation by IL-1ß could be due to a decrease on nitric oxide availability; 3) increased superoxide anion production in the vascular wall that seems to be mainly synthesized by xanthine oxidase. The superoxide anion produced by xanthine oxidase would play a role in decreasing nitric oxide availability, which in turn would diminish vasodilatation mediated by nitric oxide. These results suggest that the middle cerebral artery undergoes multiple changes caused by ischaemia-reperfusion that will allow these arteries to adapt to the blood flow alterations needed to reduce the neural damage, improving brain blood flow. Cytokines could affect functional responses of the arteries due to the increase in superoxide anion production observed in this pathology. In the future, this study could open new research that could contribute to the design of new drugs with potential interest to prevent cerebral ischaemia episodes.

OBJETIVO: Fructosa 1,6-bisfosfat (F1,6BP) protege los órganos contra gran número de procesos que provocan inflamación. Hipotetizamos que el efecto primario de la F1,6BP es el de prevenir la activación de los macrófagos y la secreción de citoquinas. Nuestra intención fue determinar las dianas tisulares y celulares de este azucar bifosforilado e investigar en profundidad su mecanismo de acción. INTERVENCIONES: La acción protectora de F1,6BP fue analizada en ratas Sprague-Dawley (de entre 200 y 250 gramos de peso corporal) a las cuales se les había inducido hepatitis mediante la inyección de galactosamina (GalN). Los efectos in vivo de la F1,6BP fueron evaluados mediante la determinación de la actividad transaminasa en plasma, la determinación de endotoxinas en plasma y la determinación del factor necrótico de tumoración alfa (TNF-alfa) en plasma y en hígado total en ratas tratadas con GalN. Las dianas de la F1,6BP para reducir la respuesta de los macrófagos al lipopolisacárido (LPS) fueron determinadas mediante el estudio de la correlación entre los cambios en la producción de TNF-alfa y los flujos de potasio a través de la membrana celular en cultivos primarios de células de Kupffer.DETERMINACIONES Y PRINCIPALES RESULTADOS : Los resultados obtenidos in vivo indican que el tratamiento con F1,6BP previene el daño causado por la administración de GalN en células del parénquima hepático. Esta protección se ha asociado principalmente a la reducción en la respuesta inflamatoria. F1,6BP previene la endotoxemia inducida por GalN en rata y ésta correlaciona con la inhibición de la secreción de histamina por parte de los mastocitos peritoneales, evento que precede al incremento de endotoxinas en plasma y de la producción hepática de TNF-alfa. Por otro lado, el tratamiento con F1,6BP reduce la sensibilidad de los macrófagos al LPS, cosa que provoca un descenso en la producción de TNF-alfa. Los resultados in vitro muestran que la F1,6BP inhibe la respuesta y la secreción de TNF-alfa por parte de las células de Kupffer a las que se ha administrado LPS. La F1,6BP previene estos efectos mediante la inhibición de la activación de los canales de potasio por LPS en este modelo celular.CONCLUSIONES: El efecto modulador de los canales de potasio en la adición exógena de F1,6BP explica sus efectos como antihistamínico y antiinflamatorio, cosa que incrementa enormemente el interés terapéutico de este compuesto bifosforilado.

L'osteogènesi és un procés del desenvolupament dels vertebrats controlat per molècules senyalitzadores que proporcionen a les cèl·lules mesenquimals la informació necessària per a diferenciar al llinatge osteogènic.D´entre aquestes, les citoquines de la família BMP (Bone Morphogenetic Protein) estan implicades en nombrosos aspectes del desenvolupament sent especialment importants en el desenvolupament de l'os. La unió d'aquestes BMPs als seus receptors inicia diferents vies de transducció de senyal que es classifiquen com a dependents o independents de Smads. S'ha comprovat en cultius cel·lulars com les BMP estimulen l'expressió de factors de transcripció específics d'osteoblasts com són Runx2 i Osterix, així com marcadors de la diferenciació osteoblàstica com la Fosfatasa Alcalina, el Col·lagen tipus I o l'Osteocalcina.Els objectius que ens vam platejar foren:- Identificació de les vies de transducció de senyals induïdes per BMP-2 ialtres mecanismes moleculars involucrats en l'activació d'Osterix.a) Anàlisi de la regió promotora d'osterix i identificació de les regions de resposta a BMP-2.b) Identificació dels factors de transcripció que s'uneixen a aquestes regions i estudi de la seva regulació en resposta a BMP-2.-Establiment de clons estables induïbles que ens permetin estudiar in vivo la regulació transcripcional d'Osterix.-Estudi d'altres gens modulats transcripcionalment per BMP-2 i la seva implicació en l'osteogènesi.El primer pas de la recerca fou aïllar dues seqüències del promotor d'osterix que es troben molt conservades entre humans i ratolins i clonar-les en un vector pGL2 que codifica per un gen reporter luciferasa. Mitjançant la transfecció i la deleció d'aquestes construccions vam observar una seqüència de 55 parells de bases a la regió més proximal que és la responsable de la resposta a BMP-2.Mitjançant mutagènesi vam identificar una seqüència homeobox palindròmica (TAATTA) que és la responsable de la inducció d'osterix per BMP-2. La proteïna Dlx5, un factor de transcripció involucrat en l'osteogènesi, és capaç d'unir-se i activar el promotor d'osterix en aquesta seqüència. Aquesta observació es complementà amb estudis del patró d'expressió temporal d'aquests gens en que es comprovà que l'activació de Dlx5 per BMP-2 precedeix temporalment a la d'Osterix. Mitjançant experiments de sobreexpressió i silenciació en cèl·lules C2C12 descrivim que Dlx5 és imprescindible per a l'expressió d'Osterix en resposta a BMP-2. No obstant, els experiments de sobreexpressió també indicaven que la BMP-2 té un efecte additiu a Dlx5 que ens permeté deduir que algun altre mecanisme havia d'estar implicat en l'activació d'Osterix per BMP-2.Descartada una possible interacció de Dlx5 amb les proteïnes Smad, vam investigar les vies independents de Smads i observàrem que la proteïna p38-MAPK, que també és activada en resposta a BMP-2, és important per a l'activació d'Osterix induïda per BMP-2. Usant una variant constitutivament activa de MKK6, capaç d'activar p38, i SB203580, que és un inhibidor específic d'aquesta via, vam confirmar la fosforilació de Dlx5 per acció de p38 i que aquesta és funcional. Per tal de confirmar aquestes observacions sobre el promotor del gen osterix endogen, es realitzaren experiments d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP) que confirmaren la unió de Dlx5 al promotor d'osterix in vivo que s´incrementa en presència de MKK6 constitutivament activa. També vam observar l'acetilació de la histona H3 en presència de Dlx5 i el paper sinèrgic de l'activitat histona actetil-transferasa de la proteïna p300.Així doncs, descrivim que Dlx5 integra les vies dependents i independents de Smad en la regulació d'Osterix. A més d'aquests resultats, s'ha estudiat el paper de Msx2 i p53 en la repressió de l'expressió d'Osterix i s'ha identificat un nou gen reprimit per BMP-2 que sembla estar implicat en la regulació del patró d'expressió d'aquest gen. / Commitment of mesenchymal cells to the osteoblast phenotype is controlled by a specific set of transcription factors activated by signals and regulatory pathways. Among them, Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) signalling has been shown to be involved in bone formation.Binding of BMP-2 to its type I and type II receptors induces both Smad dependent and Smad independent signal transduction pathways. BMPs are able to induce osteogenic factors like Runx2 or Osterix, as well as bone phenotype markers such are Alkaline Phosphatase, Collagen or Osteocalcin.The main objectives for this thesis are:-Identification of the signal transduction pathways induced by BMP-2 and other molecular mechanisms involved in Osterix activation.a) Analysis of the osterix promoter region and identification of the BMP-2 responsive regions.b) Identification of the transcription factors that binds to these regions and study of its regulation by BMP-2. -To obtain stable inducible clones which allow us to study the Osterix transcriptional activity in vivo.-To study other BMP-2 modulated genes and its possible role in the osteogenesis.Our results demonstrate that induction of Dlx5 by BMP-2 mediates Osterix transcriptional activation. First, BMP-2 induction of Dlx5 precedes the induction of Osterix. Second, Dlx5 binds to the BMP-responsive sequences that we indentified in the Osterix promoter. Third, Dlx5 overexpression and knock-down assays demonstrate its role in activating Osterix expression in response to BMP-2.Furthermore, we show that Dlx5 is a novel substrate for p38-MAPK in vitro and in vivo and that phosphorylated Dlx5 increases the transactivation potential of Dlx5. Thus, BMP activates expression of Osterix through the induction of Dlx5 and its further transcriptional activation by p38-mediated phosphorylation.In addition, we studied the repressive role of Msx2 and p53 in the Osterix promoter, and indentified a possible new gene involved in the regulation of the Osterix's expression pattern.