Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation. / For more then a century now, haemostatic disorders, also refered as coagulopathies, are recognized to be associated to neoplasia development. At first, these coagulopathies were often seen as the first clinical symptom of an occult malignancy and as such they were foreseen as merely consequence of cancer. However recent studies allowed to determine that a molecular link between haemostasis and cancer exists. Haemostatic protein were found to interact with the tumor environment or the tumor itself. In this thesis, we look at two important haemostatic proteins involved in anti- or pro-tumoral activities. These proteins we looked at were, tissue factor (TF), which as been identified as the main trigger of blood coagulation an its natural inhibitor which is named tissue factor pathway inhibitor (TFPI). In our investigations we focus on the non-haemostatic function of these proteins. First of all, we studied the effect of TFPI on angiogenesis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical component of cancer. In this first paper we demonstrate that, in addition to its anticoagulant properties, emerging data show that TFPI may also regulate endothelial cell functions via a non-haemostatic pathway. At physiological concentration, TFPI inhibits both endothelial cell migration and their differentiation into capillary-like structures in vitro. These effects were specific to endothelial cells since no inhibitory effect was observed on the migration of tumor (glioblastoma) cells. Inhibition of endothelial cell migration was correlated with a concomitant loss in cell adhesion, suggesting an alteration of focal adhesion complex integrity. Accordingly, we observed that TFPI inhibited the phosphorylation of focal adhesion kinase and paxillin, two key proteins involved in the scaffolding of these complexes and that this effect was specific to endothelial cells. These results suggest that TFPI influences the angiogenic process via a non-haemostatic pathway, by downregulating the migratory mechanisms of endothelial cells. Met, the only known receptor for hepatocyte growth factor (HGF) is a member of the receptor tyrosine kinases (RTKs) family and recently this RTK emerged as one important contributor to human neoplasia. In physiologic and pathologic conditions, Met trigger various cellular functions related to cell proliferation and migration, inhibition of apoptosis and also regulate a genetic program leading to coagulation. Since medulloblastoma (MB) express high level of tissue factor (TF), the main initiator of blood coagulation, we therefore wanted to know if there was a link between Met and TF expression in these pediatric tumors. In this work we demonstrate that stimulation of MB cells in vitro with HGF lead to overt expression of TF. These data correlate with analysis of clinical MB tumors specimens, were tumors expressing high level of Met also express high level of TF. This HGF/Met/TF pathway seems specific to MB only since no effect was observed on glioblastoma cells. TF expression in MB leads to a pro-coagulation state which could initiate thrombosis and the formation of a provisional fibrin matrix. Furthermore, TF can also mediate non-haemostatic function such as cell migration, thus helping cancer cells to form distant metastasis. Taken together these results suggest that HGF/Met pathway is responsible for TF expression in MB and explained how TF participate to tumor aggressiveness. In the third part of this thesis we look at the effect of TF on cell survival as a huge body of evidence suggest a role for TF and its natural ligand FVIIa on cells death (apoptosis) protection. In this study, we show that HGF-induce anti-apoptotic effect on DAOY MB cells is correlated to TF expression. Using TF siRNA we completely reversed this anti-apoptosis activity. TF is responsible of p53 inactivation, thus allowing DAOY to resist to very high concentrations of the chemotherapeutic drug Etoposide. These finding highlights the importance of understanding the molecular biology of MB, to achieve a better clinical management and also find new therapeutic targets. Overall, this thesis demonstrates that normal haemostatic protein such as TF and TFPI are also involved in tumor development. The different activities of TF and TFPI on cancer reflected the fact that every physiological or pathological system is dependent of a balance between activator and inhibitor. Furthermore the molecular link described in this thesis between haemostasis and cancer constitutes an argument against the fact that the haemostatic system is simply a consequence of cancer. Instead we show that TF is part of a strategy designed to improve tumor expansion while TFPI try to restrain the tumor growth by limiting tumor angiogenesis.

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation. / For more then a century now, haemostatic disorders, also refered as coagulopathies, are recognized to be associated to neoplasia development. At first, these coagulopathies were often seen as the first clinical symptom of an occult malignancy and as such they were foreseen as merely consequence of cancer. However recent studies allowed to determine that a molecular link between haemostasis and cancer exists. Haemostatic protein were found to interact with the tumor environment or the tumor itself. In this thesis, we look at two important haemostatic proteins involved in anti- or pro-tumoral activities. These proteins we looked at were, tissue factor (TF), which as been identified as the main trigger of blood coagulation an its natural inhibitor which is named tissue factor pathway inhibitor (TFPI). In our investigations we focus on the non-haemostatic function of these proteins. First of all, we studied the effect of TFPI on angiogenesis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical component of cancer. In this first paper we demonstrate that, in addition to its anticoagulant properties, emerging data show that TFPI may also regulate endothelial cell functions via a non-haemostatic pathway. At physiological concentration, TFPI inhibits both endothelial cell migration and their differentiation into capillary-like structures in vitro. These effects were specific to endothelial cells since no inhibitory effect was observed on the migration of tumor (glioblastoma) cells. Inhibition of endothelial cell migration was correlated with a concomitant loss in cell adhesion, suggesting an alteration of focal adhesion complex integrity. Accordingly, we observed that TFPI inhibited the phosphorylation of focal adhesion kinase and paxillin, two key proteins involved in the scaffolding of these complexes and that this effect was specific to endothelial cells. These results suggest that TFPI influences the angiogenic process via a non-haemostatic pathway, by downregulating the migratory mechanisms of endothelial cells. Met, the only known receptor for hepatocyte growth factor (HGF) is a member of the receptor tyrosine kinases (RTKs) family and recently this RTK emerged as one important contributor to human neoplasia. In physiologic and pathologic conditions, Met trigger various cellular functions related to cell proliferation and migration, inhibition of apoptosis and also regulate a genetic program leading to coagulation. Since medulloblastoma (MB) express high level of tissue factor (TF), the main initiator of blood coagulation, we therefore wanted to know if there was a link between Met and TF expression in these pediatric tumors. In this work we demonstrate that stimulation of MB cells in vitro with HGF lead to overt expression of TF. These data correlate with analysis of clinical MB tumors specimens, were tumors expressing high level of Met also express high level of TF. This HGF/Met/TF pathway seems specific to MB only since no effect was observed on glioblastoma cells. TF expression in MB leads to a pro-coagulation state which could initiate thrombosis and the formation of a provisional fibrin matrix. Furthermore, TF can also mediate non-haemostatic function such as cell migration, thus helping cancer cells to form distant metastasis. Taken together these results suggest that HGF/Met pathway is responsible for TF expression in MB and explained how TF participate to tumor aggressiveness. In the third part of this thesis we look at the effect of TF on cell survival as a huge body of evidence suggest a role for TF and its natural ligand FVIIa on cells death (apoptosis) protection. In this study, we show that HGF-induce anti-apoptotic effect on DAOY MB cells is correlated to TF expression. Using TF siRNA we completely reversed this anti-apoptosis activity. TF is responsible of p53 inactivation, thus allowing DAOY to resist to very high concentrations of the chemotherapeutic drug Etoposide. These finding highlights the importance of understanding the molecular biology of MB, to achieve a better clinical management and also find new therapeutic targets. Overall, this thesis demonstrates that normal haemostatic protein such as TF and TFPI are also involved in tumor development. The different activities of TF and TFPI on cancer reflected the fact that every physiological or pathological system is dependent of a balance between activator and inhibitor. Furthermore the molecular link described in this thesis between haemostasis and cancer constitutes an argument against the fact that the haemostatic system is simply a consequence of cancer. Instead we show that TF is part of a strategy designed to improve tumor expansion while TFPI try to restrain the tumor growth by limiting tumor angiogenesis.

Class of 2015 Abstract / Objectives: To determine the incidence of late coagulopathy and characterize those requiring antivenom retreatment among rattlesnake envenomation patients managed by the Arizona Poison and Drug Information Center (APDIC). Methods: This descriptive, retrospective chart review used data extracted from APDIC charts. Data included coagulopathy lab values recorded during treatment, vials of antivenom required to achieve initial control, total vials during therapy, incidence of initial coagulopathy, use of extended infusion, time until treatment, and permanent sequelae due to snakebite. Demographic information was also recorded. Late coagulopathy is defined as coagulopathy occurring after completion of maintenance dosing, and can be considered recurrent or delayed. Delayed coagulopathy occurs in the absence of an initial coagulopathy, while recurrent coagulopathy requires an initial event previously controlled by antivenom therapy. Results: Of 321 identified reports, 120 patients were treated with antivenom, had outpatient follow-up, and were included in analysis. Sixty-one (50.8%) patients did not have an initial coagulopathy, while 59 (49.2%) had an initial coagulopathy. Late coagulopathy occurred in 63 (52.5%) of patients. Delayed coagulopathies occurred in 19 (31.1%) of patients with no initial coagulopathy; Of those with an initial coagulopathy, recurrent coagulopathies occurred in 44 (74.5%) of patients. Patients with initial coagulopathy were statistically more likely to develop a late coagulopathy than those with no initial coagulopathy (p<0.001). Seventeen patients required retreatment post-discharge. Conclusions: Patients envenomated by rattlesnakes are at high risk for developing late coagulopathies. Close outpatient follow-up is imperative for monitoring of coagulopathies. Need for retreatment with FabAV post-discharge is not uncommon.