Le TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor 2 est un inhibiteur de la plasmine qui peut limiter la génération de métalloprotéases (MMP) et réduire ainsi le potentiel invasif des cellules tumorales, essentiel à la formation de métastases. Deux clones cellulaires inactivés pour le TFPI-2 par une stratégie d’ARN interférence ont été réalisés (miRNA-1b et -2b). Ces clones ont un pourcentage de migration et d’invasion 2 à 3 fois supérieur au clone contrôle, associé à une plus grande adhérence à la laminine et au collagène IV et à une augmentation de l’expression des MMP-1 et –3. En cocultures directes avec des fibroblastes pulmonaires sains, une augmentation des MMP-3, -7 et–13 a été observée avec les clones miRNA-1b et -2b. En présence des milieux conditionnés des ces clones, une potentialisation de la surexpression des MMP-1, -3, -7 a été observée. Cette étude nous a permis de démontrer que le TFPI-2 a un impact sur les gènes impliqués dans le remodelage de la MEC, notamment lors des interactions entre les cellules tumorales et les cellules stromales. / TFPI-2 (Tissue factor pathway inhibitor-2), an inhibitor of serine proteinases, particularly plasmin, can indirectly regulate the activation of MMPs, thus regulating ECM degradation and tumour cell invasion. Our results demonstrated that TFPI-2 silencing was associated with a 2 and 3-fold increase in invasive ability through basement membrane components, for clones NCI-H460 miRNA-1b and -2 respectively, associated with an increased in the relative attachment towards laminin and collagen IV and MMP-1 and MMP–3 overexpression. In direct coculture with fibroblasts, an increase in MMP-3, -7 and -13 transcriptional expression was observed when CCD19-Lu cells were cocultured with both miRNA-1b or -2b clones. In indirect coculture, allowing contact between fibroblasts and NCI-H460 clones conditioned media, an increase in MMP-1, -3 and -7 fibroblastic expression was measured. This study has demonstrated that TFPI-2 can influence ECM remodelling-associated genes and then act as a pericellular proteolysis inhibitor, particularly at the tumour-stroma interface.

Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) is an anticoagulant protein containing three Kunitz domains, K1, K2 and K3. K1 inhibits Factor VIIa, K2 inhibits Factor Xa, and K3 enhances the Factor Xa inhibition by its interaction with Protein S. Since zebrafish is an excellent genetic model, we hypothesized that TFPI regulation could be studied using this model. As a first step, we confirmed the presence of tfpia in zebrafish. Subsequently, we performed knockdown of tfpia, and knockout of tfpia in K3 domain using CRISPR/Cas9. Both the tfpia knockdown and tfpia homozygous deletion mutants showed increased coagulation activities. Our data suggest that zebrafish tfpia is an orthologue for human TFPIα, and silencing it results in a thrombotic phenotype. We then optimized the piggyback knockdown method, where we could simultaneously piggyback 3 or 6 ASOs corresponding to 3 or 6 genes, respectively, using one VMO. These multiple gene knockdowns will increase the efficiency of genome-wide knockdowns. Since there are no studies on chromatin remodeling that control TFPI expression, we hypothesized that the genome-wide knockdowns of the Chromatin Binding and Regulatory Proteins (CBRPs) in zebrafish could help identify novel tfpia gene regulators. We chose 69 CBRPs and subjected them to simultaneous gene knockdowns. Our results have identified 5 novel regulators for tfpia. We exploited this information to discover UNC6852, a drug that enhances tfpia mRNA levels. This could be used as an antithrombotic drug. The approach developed here could be used to study the regulation of other coagulant and anticoagulant factors.

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation. / For more then a century now, haemostatic disorders, also refered as coagulopathies, are recognized to be associated to neoplasia development. At first, these coagulopathies were often seen as the first clinical symptom of an occult malignancy and as such they were foreseen as merely consequence of cancer. However recent studies allowed to determine that a molecular link between haemostasis and cancer exists. Haemostatic protein were found to interact with the tumor environment or the tumor itself. In this thesis, we look at two important haemostatic proteins involved in anti- or pro-tumoral activities. These proteins we looked at were, tissue factor (TF), which as been identified as the main trigger of blood coagulation an its natural inhibitor which is named tissue factor pathway inhibitor (TFPI). In our investigations we focus on the non-haemostatic function of these proteins. First of all, we studied the effect of TFPI on angiogenesis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical component of cancer. In this first paper we demonstrate that, in addition to its anticoagulant properties, emerging data show that TFPI may also regulate endothelial cell functions via a non-haemostatic pathway. At physiological concentration, TFPI inhibits both endothelial cell migration and their differentiation into capillary-like structures in vitro. These effects were specific to endothelial cells since no inhibitory effect was observed on the migration of tumor (glioblastoma) cells. Inhibition of endothelial cell migration was correlated with a concomitant loss in cell adhesion, suggesting an alteration of focal adhesion complex integrity. Accordingly, we observed that TFPI inhibited the phosphorylation of focal adhesion kinase and paxillin, two key proteins involved in the scaffolding of these complexes and that this effect was specific to endothelial cells. These results suggest that TFPI influences the angiogenic process via a non-haemostatic pathway, by downregulating the migratory mechanisms of endothelial cells. Met, the only known receptor for hepatocyte growth factor (HGF) is a member of the receptor tyrosine kinases (RTKs) family and recently this RTK emerged as one important contributor to human neoplasia. In physiologic and pathologic conditions, Met trigger various cellular functions related to cell proliferation and migration, inhibition of apoptosis and also regulate a genetic program leading to coagulation. Since medulloblastoma (MB) express high level of tissue factor (TF), the main initiator of blood coagulation, we therefore wanted to know if there was a link between Met and TF expression in these pediatric tumors. In this work we demonstrate that stimulation of MB cells in vitro with HGF lead to overt expression of TF. These data correlate with analysis of clinical MB tumors specimens, were tumors expressing high level of Met also express high level of TF. This HGF/Met/TF pathway seems specific to MB only since no effect was observed on glioblastoma cells. TF expression in MB leads to a pro-coagulation state which could initiate thrombosis and the formation of a provisional fibrin matrix. Furthermore, TF can also mediate non-haemostatic function such as cell migration, thus helping cancer cells to form distant metastasis. Taken together these results suggest that HGF/Met pathway is responsible for TF expression in MB and explained how TF participate to tumor aggressiveness. In the third part of this thesis we look at the effect of TF on cell survival as a huge body of evidence suggest a role for TF and its natural ligand FVIIa on cells death (apoptosis) protection. In this study, we show that HGF-induce anti-apoptotic effect on DAOY MB cells is correlated to TF expression. Using TF siRNA we completely reversed this anti-apoptosis activity. TF is responsible of p53 inactivation, thus allowing DAOY to resist to very high concentrations of the chemotherapeutic drug Etoposide. These finding highlights the importance of understanding the molecular biology of MB, to achieve a better clinical management and also find new therapeutic targets. Overall, this thesis demonstrates that normal haemostatic protein such as TF and TFPI are also involved in tumor development. The different activities of TF and TFPI on cancer reflected the fact that every physiological or pathological system is dependent of a balance between activator and inhibitor. Furthermore the molecular link described in this thesis between haemostasis and cancer constitutes an argument against the fact that the haemostatic system is simply a consequence of cancer. Instead we show that TF is part of a strategy designed to improve tumor expansion while TFPI try to restrain the tumor growth by limiting tumor angiogenesis.

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation. / For more then a century now, haemostatic disorders, also refered as coagulopathies, are recognized to be associated to neoplasia development. At first, these coagulopathies were often seen as the first clinical symptom of an occult malignancy and as such they were foreseen as merely consequence of cancer. However recent studies allowed to determine that a molecular link between haemostasis and cancer exists. Haemostatic protein were found to interact with the tumor environment or the tumor itself. In this thesis, we look at two important haemostatic proteins involved in anti- or pro-tumoral activities. These proteins we looked at were, tissue factor (TF), which as been identified as the main trigger of blood coagulation an its natural inhibitor which is named tissue factor pathway inhibitor (TFPI). In our investigations we focus on the non-haemostatic function of these proteins. First of all, we studied the effect of TFPI on angiogenesis. Angiogenesis, the formation of new blood vessels from pre-existing ones, is a critical component of cancer. In this first paper we demonstrate that, in addition to its anticoagulant properties, emerging data show that TFPI may also regulate endothelial cell functions via a non-haemostatic pathway. At physiological concentration, TFPI inhibits both endothelial cell migration and their differentiation into capillary-like structures in vitro. These effects were specific to endothelial cells since no inhibitory effect was observed on the migration of tumor (glioblastoma) cells. Inhibition of endothelial cell migration was correlated with a concomitant loss in cell adhesion, suggesting an alteration of focal adhesion complex integrity. Accordingly, we observed that TFPI inhibited the phosphorylation of focal adhesion kinase and paxillin, two key proteins involved in the scaffolding of these complexes and that this effect was specific to endothelial cells. These results suggest that TFPI influences the angiogenic process via a non-haemostatic pathway, by downregulating the migratory mechanisms of endothelial cells. Met, the only known receptor for hepatocyte growth factor (HGF) is a member of the receptor tyrosine kinases (RTKs) family and recently this RTK emerged as one important contributor to human neoplasia. In physiologic and pathologic conditions, Met trigger various cellular functions related to cell proliferation and migration, inhibition of apoptosis and also regulate a genetic program leading to coagulation. Since medulloblastoma (MB) express high level of tissue factor (TF), the main initiator of blood coagulation, we therefore wanted to know if there was a link between Met and TF expression in these pediatric tumors. In this work we demonstrate that stimulation of MB cells in vitro with HGF lead to overt expression of TF. These data correlate with analysis of clinical MB tumors specimens, were tumors expressing high level of Met also express high level of TF. This HGF/Met/TF pathway seems specific to MB only since no effect was observed on glioblastoma cells. TF expression in MB leads to a pro-coagulation state which could initiate thrombosis and the formation of a provisional fibrin matrix. Furthermore, TF can also mediate non-haemostatic function such as cell migration, thus helping cancer cells to form distant metastasis. Taken together these results suggest that HGF/Met pathway is responsible for TF expression in MB and explained how TF participate to tumor aggressiveness. In the third part of this thesis we look at the effect of TF on cell survival as a huge body of evidence suggest a role for TF and its natural ligand FVIIa on cells death (apoptosis) protection. In this study, we show that HGF-induce anti-apoptotic effect on DAOY MB cells is correlated to TF expression. Using TF siRNA we completely reversed this anti-apoptosis activity. TF is responsible of p53 inactivation, thus allowing DAOY to resist to very high concentrations of the chemotherapeutic drug Etoposide. These finding highlights the importance of understanding the molecular biology of MB, to achieve a better clinical management and also find new therapeutic targets. Overall, this thesis demonstrates that normal haemostatic protein such as TF and TFPI are also involved in tumor development. The different activities of TF and TFPI on cancer reflected the fact that every physiological or pathological system is dependent of a balance between activator and inhibitor. Furthermore the molecular link described in this thesis between haemostasis and cancer constitutes an argument against the fact that the haemostatic system is simply a consequence of cancer. Instead we show that TF is part of a strategy designed to improve tumor expansion while TFPI try to restrain the tumor growth by limiting tumor angiogenesis.

Les cancers broncho-pulmonaires à petites cellules (CBPPC), tumeurs endocrines représentant 20% des cancers pulmonaires, sont fortement associés au tabagisme. Ils sont très agressifs en raison de leur progression rapide et de la présence de métastases souvent présentes au moment du diagnostic. Moins de 10% des patients sont opérables et la plupart des échantillons de tumeurs sont recueillis par endoscopie bronchique ou par médiastinoscopie. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que l’expression du TFPI-2, un gène suppresseur de tumeur, était diminué dans 65% des cas de CBPPC. Afin d’étudier l’impact du TFPI-2 sur la progression tumorale, nous avons préalablement développé un modèle orthotopique murin de CBPPC qui mime le développement de ce type de cancer pulmonaire. Des cellules NCI-H209, n’exprimant pas le TFPI-2, ont été préalablement transfectées pour exprimer la luciférase et la croissance tumorale a été suivie par imagerie de bioluminescence. L’expression du TFPI-2 a ensuite été restaurée dans ces cellules et nous avons montré que la croissance tumorale était alors réduite. Cet effet peut s’expliquer par une diminution de la prolifération des cellules exprimant le TFPI-2, associée à un arrêt du cycle cellulaire en phase G1/S dû à l’expression de p15 et de p27 et à une induction de l’apoptose. Nous avons aussi démontré que lorsque le TFPI-2 est surexprimé, les transcrits et les protéines MMP-1 et -3 sont diminuées, tout comme la phosphorylation des protéines de la voie des MAP Kinases impliquées dans l’induction des transcrits de ces MMP. Cette corrélation entre l’expression du TFPI-2 et la diminution de celle de la MMP-1 a été retrouvée dans 35% des échantillons de CBPPC humains. Ces résultats suggèrent que l’inactivation du TFPI-2 dans les CBPPC peut favoriser le développement de ce cancer. Enfin, nous avons également démontré, pour la première fois que le TFPI-2 peut aussi inhiber la kallicréine 12, une protéase à sérine potentiellement anti-angiogénique. L’ensemble de ces données suggèrent que le TFPI-2 peut être un potentiel biomédicament capable de limiter la progression des carcinomes pulmonaires à petites cellules. / Small Cell Lung Cancer (SCLC) is the most common neuroendocrine tumour of the lung (15% of cases) and is strongly associated with smoking. It is characterised by tumours that grow rapidly with early metastases. Less than 10% of patients with SCLC have a resectable tumour, thus surgical specimens are scarce and most tumour samples come from small biopsies obtained during bronchial endoscopy or mediastinoscopy. In this study, low levels of TFPI-2 expression were found in 65% of patients with SCLC. To study the impact of TFPI-2 in tumour progression, we first developed a clinically relevant animal model that resembles various stages of human SCLC. NCI-H209 cells, not expressing TFPI-2, were genetically modified to express firefly luciferase and the growth of the tumour was sensitively followed by bioluminescence imaging. TFPI-2 was then overexpressed in these cells and we showed that TFPI-2 inhibited lung tumour growth. Such inhibition could be explained in vitro by a decrease in tumour cell proliferation, blockade of G1/S phase cell cycle transition due to p15 and p27 expression, and an increase in apoptosis shown in NCI-H209 cells expressing TFPI-2. We also demonstrated that TFPI-2 upregulation in NCI-H209 cells decreased MMP expression, particularly by downregulating MMP-1 and MMP-3. Moreover, TFPI-2 inhibited phosphorylation of the MAPK signalling pathway proteins involved in the induction of MMP transcripts, among which MMP-1 was predominant in SCLC tissues and was inversely expressed with TFPI-2 in 35% of cases. These results suggest that downregulation of TFPI-2 expression could favour the development of SCLC. Finally, we also demonstrated for the first time that TFPI-2 could inhibit the kallikrein 12, an anti-angiogenic serine proteinase. Altogether, these results suggest that TFPI-2 could be a new potent therapeutic agent to control SCLC tumour progression in SCLC.

L'inhibiteur de la Voie du Facteur Tissulaire (TFPI) est une protéine régulatrice de la coagulation plasmatique intervenant à la phase initiale de la cascade. Il inhibe en présence de la protéine S (PS) le facteur Xa et ce complexe TFPI-Xa inactive ensuite le complexe FT-VIIa. Nous avons recherché une résistance à l'activité anticoagulante du TFPI. La sensibilité du plasma à une quantité fixe de TFPI a été évaluée sur la base d'un temps de thromboplastine diluée (TTD) réalisé avec et sans TFPI : - chez des patients ayant présenté une thrombose veineuse profonde inexpliquée ; cette résistance suspectée sur une 1ère étude n'a pas été confirmée sur la 2ème. - chez des patientes enceintes ; une résistance au TFPI acquise a été montrée et rapportée au déficit acquis en PS ; cependant le degré de résistance au TFPI ne peut pas être utilisé comme marqueur de risque de pathologie vasculaire placentaire. Chez des patients obèses l'effet inhibiteur des taux élevés de Lp(a) sur l'activité TFPI décrit in vitro n'a pas été retrouvé in vivo pas plus que l'effet de l'aspirine sur la normalisation des taux de Lp(a). Le TFPI joue un rôle dans les manifestations hémorragiques des hémophiles. Nous avons montré que les hémophiles B ont comparativement aux A des taux moindres de TFPI ce qui pourrait expliquer leur différence en terme de manifestations hémorragiques. Les taux de TFPI libre sont bien corrélés aux paramètres de la génération de thrombine surtout au temps de latence. En présence d’un anti TFPI humain la génération de thrombine est corrigée chez l'hémophile. Cette correction dépend de la concentration d'anti TFPI, est saturable et doit être étudiée sur du plasma riche en plaquettes / TFPI is a multivalent Kunitz-type proteinase inhibitor that directly inhibits FXa and produces FXa-dependent feedback inhibition of the FVIIa–TF complex. It was recently demonstrated that Protein S (PS) plays the role of TFPI cofactor by enhancing the TFPI inhibition of factor Xa in vivo. Approximately 80% of plasma TFPI circulates as a complex with plasma lipoproteins, about 5–20% circulating as free TFPI. Under quiescent conditions, approximately 50–80% of intravascular TFPI is stored in association with the endothelium. Full-length TFPI α carried in platelets constitutes 8-10% of the total amount of TFPI in the blood, corresponding to a quantity comparable to that of soluble full-length TFPI α in the plasma. We searched for resistance to TFPI activity in patients who presented idiopathic venous thrombosis at a young age. Plasma sensitivity to TFPI was evaluated on the basis of diluted prothrombin time (dPT) measured in patients and in control plasma in the presence (W) and absence (Wo) of exogenous TFPI. At the same time, dPT was measured on a reference plasma to establish a normalized ratio termed TFPI NR and defined as (dPT wTFPI/ dPT Wo TFPI) patient or control / (dPT wTFPI/ dPT Wo TFPI) reference plasma. In an initial study, we found that TFPI resistance could be considered as a new coagulation abnormality that could be related to unexplained thrombosis. In a second study, we failed to demonstrate a role of TFPI resistance in patients with venous thrombosis, abnormal TFPI NR being more likely related to the non-respect of preanalytical conditions rather than to an inherited trait. However, in another study, we showed that inherited or acquired PS deficiency was responsible for a TFPI resistance, providing an ex vivo demonstration that PS is the cofactor of TFPI activity. We showed that this TFPI resistance existed throughout pregnancy and that it disappeared when PS returned to normal values after delivery. We evaluated this TFPI resistance as a possible marker of the risk of a gestational vascular complication (GVC) in 72 patients at risk of developing a GVC. TFPI NR did not differ between GVC+ patients (n =15) and GVC– patients (n = 57). High levels of Lipoprotein(a) (Lp(a) have been shown to be an independent risk factor for cardiovascular disease, lowering of these levels not being achievable by any treatment except possibly aspirin. An in vitro study showed that TFPI activity could be inhibited by Lp(a). We did not confirm this TFPI inhibition in vivo in 20 obese patients with coronary insufficiency who had either normal Lp(a) levels (≤ 0.3 g/L; n = 15) or high Lp(a) levels (≥ 0.3 g/L; n = 5) . Moreover, we found no effect of aspirin treatment on Lp(a) whatever the initial level of Lp(a). Haemophilia B patients bleed less than haemophilia A patients. We showed that this difference in bleeding profile could be explained by lower free TFPI levels in haemophilia B patients compared to haemophilia A patients. In an ongoing study, we showed that in haemophilia A patients there was a strong correlation between the different parameters of thrombin generation (TG) and free TFPI. We also showed, in a TG assay performed in platelet-rich plasma (PRP) with a low TF concentration, that LT was sensitive to free TFPI levels whatever the type of haemophilia and whatever theseverity of the disease. We demonstrated that blocking TFPI by an anti-TFPI Antibody (Ab) allows complete correction of the TG profile in PRP. We showed that it is of major importance to perform a TG assay in PRP in order to evaluate the efficacy of anti-TFPI Ab in correcting TG parameters in haemophilia patients

Introduction : L'hémophilie est une maladie génétique de la coagulation due à un déficit en facteur VIII ou en facteur IX. Ces déficits sont responsables d'un déficit du complexe ténase intrinsèque (VIIIa-IXa). De plus, le complexe ténase extrinsèque (facteur tissulaire - VIIa) est physiologiquement rapidement inhibé par le TFPI lié au facteur Xa. Nous avons évalué la capacité d'une forme tronquée du facteur Xa (GDXa), dépourvue de domaine Gla à se lier au TFPI et à soulager l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. Matériel et Méthodes : Dans une première partie, nous avons évalué la capacité du GDXa à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sévères sans et avec inhibiteurs. Nous avons également comparé les profils de génération de thrombine obtenus après addition du GDXa à ceux obtenus en présence d'anticorps neutralisants anti-TFPI ou anti-antithrombine. Enfin, nous avons comparé les cinétiques enzymatiques de neutralisation du facteur Xa et du GDXa par le TFPI et l'antithrombine. Dans une seconde partie, nous avons étudié in silico les interactions entre la chaîne lourde du facteur Xa et le TFPI pour détecter les zones d'interaction défavorables. Cette étude a identifié des acides aminés du facteur Xa qui pourraient être substitués pour optimiser l'interaction avec le TFPI. Les résultats in silico ont orienté nos choix de mutagenèse dirigée pour concevoir différents variants moléculaires du GDXa (R138F, R138G, R138I) où l'arginine 138 est substituée. Ces variants protéiques ont été produits de façon recombinante dans des cellules HEK293E. La capacité des différents variants à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles a été testée avec les surnageants de culture cellulaires correspondants. Résultats : Dans la première partie, nous avons montré que le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sans et avec inhibiteurs. Comparativement au facteur Xa, le GDXa montre une affinité moindre pour le TFPI tandis que les affinités du GDXa et du facteur Xa pour l'antithrombine sont identiques. Enfin, malgré une demi-vie courte, l'effet du GDXa sur la génération de thrombine est maintenu pendant au moins une heure. Dans la seconde partie, nous avons produit les différents variants R138F, R138G et R138I en cellules HEK293E et montré que les surnageants de culture cellulaire étaient capables de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles de façon plus efficace que le GDXa. Conclusion : Comme le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles, nos résultats suggèrent que le GDXa pourrait être une alternative efficace aux thérapeutiques hémostatiques court-circuitantes actuelles chez les hémophiles sans ou avec inhibiteurs. Les résultats obtenus renforcent l'hypothèse que l'activité pro-coagulante du GDXa serait liée à la formation d'un complexe GDXa-TFPI limitant la formation du complexe Xa-TFPI nécessaire à l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. De plus, notre approche rationnelle basée sur une étude in silico visant à augmenter l'affinité du TFPI pour le GDXa a permis de produire différents variants moléculaires du GDXa dont l'activité procoagulante in vitro est augmentée par rapport au GDXa. / Background: Hemophilia is caused by deficiencies in coagulation factor VIII or IX, resulting in direct blockade of the intrinsic tenase complex and indirect blockade of the extrinsic tenase complex which is rapidly inhibited upon binding of factor Xa to tissue factor pathway inhibitor (TFPI). We evaluated the ability of Gla-domainless factor Xa (GDXa), a truncated form of factor Xa devoid of procoagulant properties, to bind to TFPI and to alleviate the physiological inhibition of the extrinsic tenase. Design and Methods: In the first part of this work, we evaluated the ability of GDXa to restore coagulation in plasmas from hemophilia A and B patients without and with inhibitors, using a thrombin generation assay triggered by a low concentration of tissue factor. We then compared its efficacy to generate thrombin to depletion of antithrombin or TFPI by specific antibodies. Finally, we compared the kinetics of neutralization of factor Xa and GDXa by antithrombin and TFPI. In the second part of this work, we realized an in silico study of the interactions between factor Xa heavy chain and TFPI. The aim was to detect unfavorable interactions and to identify amino-acid candidates for mutagenesis in order to increase affinity for TFPI. Taking into account the results of this in silico study, we produced by genic engienering different molecular variants of GDXa (R138F, R138G, R138I) where Arg138 was substituted by site directed mutagenesis. Proteins were produced in HEK293E cells. We tested dialyzed cell culture supernatants containing each variant to restore thrombin generation in plasmas from severe hemophilia patients. Results: In the first part of this work, we showed that GDXa was able to restore thrombin generation in plasma samples from hemophiliacs. This effect was observed for plasma from hemophilia A patients without or with inhibitors and for plasma from hemophilia B patients. GDXa had a lower affinity than factor Xa for TFPI whereas the affinities of both proteins for antithrombin were similar. Finally, despite a short half-life in plasma, the effect of GDXa on thrombin generation was sustained for at least one hour. In the second part of this work, we produced the different variants R138F, R138G et R138I in HEK293E cells and showed that cell culture supernatants were able to restore thrombin generation in a more efficient way than GDXa. Conclusions: As GDXa was able to restore thrombin generation in plasma from hemophilia patients, our results suggest that it may be an effective alternative to current treatments for hemophilia with or without inhibitors. Results sustained the hypothesis that GDXa coagulant activity is through TFPI binding and competition with factor Xa to bind TFPI resulting in limiting factor Xa-TFPI formation, which is essential for inhibition of extrinsic tenase complex. Furthermore, rational design of GDXa variants based on an in silico study lead to production of proteins whose coagulant activity is increased compared to GDXa."

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Introduction : L'hémophilie est une maladie génétique de la coagulation due à un déficit en facteur VIII ou en facteur IX. Ces déficits sont responsables d'un déficit du complexe ténase intrinsèque (VIIIa-IXa). De plus, le complexe ténase extrinsèque (facteur tissulaire - VIIa) est physiologiquement rapidement inhibé par le TFPI lié au facteur Xa. Nous avons évalué la capacité d'une forme tronquée du facteur Xa (GDXa), dépourvue de domaine Gla à se lier au TFPI et à soulager l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. Matériel et Méthodes : Dans une première partie, nous avons évalué la capacité du GDXa à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sévères sans et avec inhibiteurs. Nous avons également comparé les profils de génération de thrombine obtenus après addition du GDXa à ceux obtenus en présence d'anticorps neutralisants anti-TFPI ou anti-antithrombine. Enfin, nous avons comparé les cinétiques enzymatiques de neutralisation du facteur Xa et du GDXa par le TFPI et l'antithrombine. Dans une seconde partie, nous avons étudié in silico les interactions entre la chaîne lourde du facteur Xa et le TFPI pour détecter les zones d'interaction défavorables. Cette étude a identifié des acides aminés du facteur Xa qui pourraient être substitués pour optimiser l'interaction avec le TFPI. Les résultats in silico ont orienté nos choix de mutagenèse dirigée pour concevoir différents variants moléculaires du GDXa (R138F, R138G, R138I) où l'arginine 138 est substituée. Ces variants protéiques ont été produits de façon recombinante dans des cellules HEK293E. La capacité des différents variants à restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles a été testée avec les surnageants de culture cellulaires correspondants. Résultats : Dans la première partie, nous avons montré que le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles A et B sans et avec inhibiteurs. Comparativement au facteur Xa, le GDXa montre une affinité moindre pour le TFPI tandis que les affinités du GDXa et du facteur Xa pour l'antithrombine sont identiques. Enfin, malgré une demi-vie courte, l'effet du GDXa sur la génération de thrombine est maintenu pendant au moins une heure. Dans la seconde partie, nous avons produit les différents variants R138F, R138G et R138I en cellules HEK293E et montré que les surnageants de culture cellulaire étaient capables de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles de façon plus efficace que le GDXa. Conclusion : Comme le GDXa est capable de restaurer la génération de thrombine de plasmas d'hémophiles, nos résultats suggèrent que le GDXa pourrait être une alternative efficace aux thérapeutiques hémostatiques court-circuitantes actuelles chez les hémophiles sans ou avec inhibiteurs. Les résultats obtenus renforcent l'hypothèse que l'activité pro-coagulante du GDXa serait liée à la formation d'un complexe GDXa-TFPI limitant la formation du complexe Xa-TFPI nécessaire à l'inhibition physiologique du complexe ténase extrinsèque. De plus, notre approche rationnelle basée sur une étude in silico visant à augmenter l'affinité du TFPI pour le GDXa a permis de produire différents variants moléculaires du GDXa dont l'activité procoagulante in vitro est augmentée par rapport au GDXa.