Orientador: Ângelo Berchieri Junior / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Gerson Nakazato / Resumo: Salmonella enterica sorotipo Typhimurium sintetiza cobalamina (Vitamina B12) apenas sobre condições anaeróbicas. Dois porcento do genoma da S. Typhimurium é dedicado a reações dependentes de vitamina B12 como cofator, sua síntese e absorção. Neste estudo nós preparamos mutantes de Salmonella sorotipos Enteritidis, Gallinarum e Pullorum duplo defectivos na biossintese de cobalamina, cepas ΔcobSΔcbiA. A virulência destes mutantes foi comparada com as respectivas cepas selvagens e, nenhuma deficiência na capacidade de causar doença foi observada para as cepas de S. Enteritidis ΔcobSΔcbiA e S. Pullorum ΔcobSΔcbiA. S. Gallinarum ΔcobSΔcbiA por sua vez, mostrou atenuação total. Posteriormente nós testamos a produção de B12 pelas cepas mutantes e selvagens já descritas, e incluímos neste estudo a cepa de S. Typhimurium ΔcobSΔcbiA, e sua respectiva cepa selvagem. Todas as cepas mutantes não tiveram produção de B12 detectada. As cepas selvagens mostraram produção de vitamina B12 em ambos os ensaios utilizados, com exceção da S. Gallinarum que não apresentou produção de cobalamina in vitro. Como conclusão, a produção de vitamina B12 in vitro diferiu entre os sorotipos de Salmonella testados, a deleção dos genes cbiA e cobS produziu alteração na relação parasita hospedeiro em diferentes níveis entre os sorotipos de Salmonella estudados, sendo que esta foi muito maior entre o sorotipo Gallinarum e as aves. / Abstract: Salmonella enterica serovar Typhimurium only synthesizes cobalamin (Vitamin B12) during anaerobiosis. Two-percent of the S. Typhimurium genome is devoted to the synthesis and uptake of Vitamin B12 and to B12-dependent reactions. In order to understand the requirement from cobalamin synthesis better, we constructed Salmonella serovar Gallinarum, Salmonella serovar Enteritidis and Salmonella serovar Pullorum mutants that are double-defective in cobalamin biosynthesis (ΔcobSΔcbiA). We compared the virulence of these mutants to that of their respective wild type strains and found no impairment in S. Enteritidis ΔcobSΔcbiA and S. Pullorum ΔcobSΔcbiA ability to cause disease in chickens. S. Gallinarum ΔcobSΔcbiA mutant showed attenuated for chickens. We then assessed B12 production by these mutants and their respective wild type strains, as well as S. Typhimurium ΔcobSΔcbiA, and their respective wild type strain. All mutants were unable to produce detectable B12. B12 was detectable in wild type strains, but, S. Gallinarum demonstrated no in vitro cobalamin production. In conclusion, the production of vitamin B12 in vitro differed across the Salmonella serotypes that were tested. Furthermore, the deletion of the cbiA and cobS genes resulted in an alteration in the relationship between the serotype Gallinarum and the birds more stronger than did to the others serotypes. / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Maristela de Freitas Sanches Peres / Resumo: Invertase ou β -D frutofuranosidase (EC 3.2.1.26) é uma enzima que catalisa a hidrólise do terminal não redutor do resíduo β- frutofuranosidase em frutofuranosídeos. A imobilização em suportes lignocelulósicos como resíduos bagaço de cana (BC) e resíduos de sabugo de milho (SM) são favoráveis, pois são suportes de baixo custo. A invertase comercial e extraída de Saccharomyces cerevisiae e os derivados foram caracterizadas enzimaticamente. O pH ótimo encontrado para os derivados foram bem próximas da encontrada para as invertases livres, em torno de pH 4,5 a 5,5. Os derivados apresentaram estabilidade térmica superior a das invertases livres e alguns derivados tiveram acréscimos na temperatura, como os derivados da invertase extraída obtido com pó BC e SM glutaraldeído e derivados da invertase comercial obtido com pó SM e BC amino e BC glioxil. A energia de ativação encontrada para a maioria dos derivados apresentou- se na faixa de 12 a 29 kJ/ mol, valores inferiores ao encontrados para as formas livres de invertase, sendo 32.02 kJ/ mol para invertase comercial e 34.94 kJ/ mol para invertase extraída.O derivado da invertase comercial obtido com pó sabugo de milho amino e o derivado invertase extraída obtido com pó de sabugo de milho glutaraldeído foram os derivados mais estáveis, apresentando capacidade de serem reutilizados em cinco ciclos subseqüentes. Estes derivados foram ensaiados em concentrações variadas de sacarose e os resultados mostraram que a invertase imobilizada apresenta inibição pelo produto glicose/frutose após 6 horas de ensaio. A utilização de resíduos da agroindústria como suportes para imobilização da invertase apresentou-se promissora para a aplicação em escala industrial. / Abstract: Invertase or β - D fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) it is an enzyme that catalyzes hydrolysis of the non reducing terminal of the residue β- fructofuranosidase in frutcofuranosideos. Immobilization on lignocellulosic supports as residue sugarcane bagasse and residues of corn cobs are favorable, therefore they are matrices of low cost commercial invertase and extracted of Saccharomyces cerevisiae and the derivatives had been enzymatically characterized. The optimum pH found for the derivatives had been well next to the found one for free invertases, around pH 4.5 the 5.5. The derivatives had presented superior thermal stability of free invertases and some derivatives had additions in the temperature, as the derivatives of extracted invertase gotten with dust sugarcane bagasse and corn cobs glutaraldehyde and derivatives of commercial invertase gotten with dust corn cobs and sugarcane bagasse amine and sugarcane bagasse glyoxyl. The energy of activation found for the majority of the derivatives were between 12 the 29 kJ/mol, less values to the found ones for the free forms of invertase, being 32.02 kJ/mol for commercial invertase and 34.94 kJ/mol obtained with extracted invertase. The derivative of commercial invertase gotten with dust corn cobs amine and the derivative extracted invertase gotten with dust of corn cobs glutaraldehyde had been the derivatives most stable, presenting capacity to be reused in five subsequent cycles. These derivatives had been assayed in concentrations of varied sucrose. The results with derivates shown that invertase presented inhibition for the product glucose/ fructose after 6 hours of test. The use of residues of the agribusiness as supports for immobilization of invertase presented promising for the application in industrial scale. / Mestre