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Étude du polymorphisme du gène majeur d’histocompatibilité de classe IIb (MHIIb) chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis)Croisetière, Sébastien 10 1900 (has links)
Les molécules classiques du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII) sont des glycoprotéines de surface spécialisées dans la présentation de peptides, principalement dérivés de pathogènes extracellulaires, aux récepteurs des lymphocytes T CD4+ afin d’initier la réponse immunitaire adaptative. Elles sont encodées, avec celles du CMH de classe I, par les gènes les plus polymorphiques identifiés jusqu’à maintenant, avec plusieurs loci et une grande diversité allélique à chacun d’eux. De plus, le polymorphisme des gènes du CMHII n’est pas limité qu’aux séquences codantes. Il est également observé dans les promoteurs où on a démontré ses effets sur le niveau d’expression des gènes. La variation de la régulation d’un gène est considérée comme un facteur important et pour laquelle des modifications morphologiques, physiologiques et comportementales sont observées chez tous les organismes. Des séquences d’ADN répétées impliquées dans cette régulation ont été identifiées dans les régions non-codantes des génomes. D’un autre côté, la sélection par les pathogènes permettrait l’évolution et le maintien du polymorphisme des gènes du CMH chez les vertébrés. À ce sujet, plusieurs études ont montré l’implication de différents allèles du CMH dans la résistance ou la susceptibilité aux maladies. Cette étude avait pour objectifs de caractériser le polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine (Salvelinus fontinalis) et de documenter ses effets au niveau de la survie conférée par des allèles et/ou génotypes particuliers lors d’une infection, ainsi que sur la variation du niveau d’expression du gène dans différentes conditions.
Dans une première partie, nous avons identifié un total de 6 allèles du gène MHIIb, désignés Safo-DAB*0101 à Safo-DAB*0601, qui montrent une grande similarité avec les séquences codantes provenant de poissons téléostéens et de l’humain. L’analyse des séquences du domaine b1 a permis de détecter l’effet d’une pression sélective positive pour maintenir le polymorphisme dans cette région de la molécule. Quatre de ces allèles ont été testés lors d’une expérience d’infection avec le pathogène Aeromonas salmonicida afin d’évaluer l’effet qu’ils pouvaient avoir sur la survie des poissons. Nous avons trouvé que l’allèle DAB*0101 était significativement associé à la résistance à la furonculose. En plus d’avoir été identifié chez les individus homozygotes pour cet allèle, l’effet a également été remarqué au niveau de la survie les poissons de génotype DAB*0101/*0201. À l’opposé, les facteurs de risque élevé obtenus pour les génotypes DAB*0201/*0301 et DAB*0301/*0401 suggèrent plutôt une association à la susceptibilité. Étant donné la faible fréquence à laquelle l’allèle DAB*0101 a été retrouvé dans la population, le modèle de la sélection dépendante de la fréquence pourrait expliquer l’avantage conféré par ce dernier et souligne l’importance de ce mécanisme pour le maintien du polymorphisme du gène MHIIb chez l’omble de fontaine.
Dans une seconde partie, nous avons rapporté la présence d’un minisatellite polymorphique formé d’un motif de 32 nucléotides dans le second intron du gène MHIIb, et pour lequel un nombre exclusif de répétitions du motif a été associé à chaque allèle (69, 27, 20, 40, 19 et 25 répétitions pour les allèles DAB*0101 à DAB*0601 respectivement). L’expression relative de quatre allèles a été évaluée dans des poissons hétérozygotes aux températures de 6 ºC et 18 ºC. Les résultats indiquent que les allèles possédant un long minisatellite montrent une réduction de l’expression du gène d’un facteur 1,67 à 2,56 par rapport aux allèles qui en contiennent un court. De même, des allèles qui incluent des minisatellites de tailles similaires n’affichent pas de différence significative au niveau de l’abondance du transcrit aux deux températures. De plus, l’effet répressif associé aux longs minisatellites est amplifié à la température de 18 ºC dans des poissons de trois génotypes différents. Nous avons finalement observé une augmentation significative par un facteur 2,08 de l’expression totale du gène MHIIb à la température de 6 ºC. Ces résultats appuient l’implication des séquences d’ADN répétées dans la régulation de l’activité transcriptionnelle d’un gène et suggèrent qu’un minisatellite sensible aux différences de températures pourrait être soumis aux forces sélectives et jouer un rôle important dans l’expression de gènes et l’évolution des organismes poïkilothermes. / Classical major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules are cell-surface glycoproteins specialized in the presentation of peptides, mainly derived from extracellular pathogens, to the antigen receptors of CD4+ T cells in the adaptive immune system. They are encoded, with those of the MHC class I, by the most polymorphic genes known to date, with multiple loci and high allelic diversity at each one. Moreover, the polymorphism within MHCII genes is not restricted to coding sequences. It has also been observed in promoters where it was shown to affect the expression level of the genes. Variation in gene regulation is believed to be an important factor from which modification in morphology, physiology or behaviour can be observed in all organisms. Repeated DNA sequences with functional roles in this regulation have been identified within the non-coding parts of the genomes. On the other hand, pathogen-driven selection is also believed to be important in the evolution and maintenance of the polymorphism of the MHC genes in vertebrates. Studies have shown the implication of different MHC alleles in disease resistance or susceptibility. In this study, our aims were to characterize the polymorphism of the MHIIb gene in brook charr (Salvelinus fontinalis), to document its effects on the survival conferred by specific alleles and/or genotypes following an infection and on the variation of the expression level of the gene in different environmental conditions.
In a first part, we identified a total of 6 MHIIb alleles, designated Safo-DAB*0101 to Safo-DAB*0601, showing a high similarity to coding sequences from teleost fish and human. Analysis of the b1 domain sequences indicates the effect of a positive selection pressure to select polymorphic mutations in that region of the molecule. Four of these alleles were tested in a challenge experiment against the pathogen Aeromonas salmonicida to evaluate their effect on fish survival. We found that one allele, DAB*0101, was significantly associated with resistance to furonculosis. In addition to homozygotes for this allele, its resistance effect was also detected in the heterozygote individuals of the DAB*0101/*0201 genotype. In contrast, other allelic combinations, namely heterozygous genotypes DAB*0201/*0301 and DAB*0301/*0401 were significantly associated with increased susceptibility. Given that its frequency was relatively low in the population, the negative frequency dependant selection hypothesis could explain the advantage associated with the allele DAB*0101 over the other alleles and highlight the importance of this mechanism to sustain variation at the MHC in brook charr.
In a second part, we reported the identification of a polymorphic minisatellite formed of a 32 nucleotides motif in the second intron of MHIIb gene, and for which distinctive repeat numbers of the motif were associated to each alleles (69, 27, 20, 40, 19 and 25 repeats for the DAB*0101 to DAB*0601 alleles respectively). Relative expression levels of four alleles were determined in heterozygous fish at temperature of 18 ºC and 6 ºC. Results indicate that alleles carrying the longest minisatellite showed a 1.67 to 2.56-fold reduction in the transcript expression relatively to the shortest one. In contrast, no significant differences were seen in the expression levels between alleles with comparable minisatellite length at both temperatures. Furthermore, the repressive activity associated to the longest minisatellite was more effective at temperature of 18 ºC in fish from three different genotypes. We finally observed a significant 2.08-fold up-regulation of the total MHII transcript amount at 6 ºC. The results support the implication of repeated DNA sequences in the regulation of the gene transcriptional activity and suggest that a temperature-sensitive minisatellite could potentially be submitted to selective forces and therefore play an important role in gene expression and evolution in ectothermic organisms.
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Réponse cellulaire pan-spécifique : analyse de la présentation d’antigènes conservés du virus de l’influenzaDoucet, Jean-Daniel 08 1900 (has links)
Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à
anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un
vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une
réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la
protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de
ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène
par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP.
Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices
d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être
présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de
lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des
lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec
des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du
CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène
ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des
lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la
présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous
avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques
sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des
proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette
qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des
lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme.
En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des
lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une
méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based
epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation
antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales
pan-spécifiques contre l’influenza. / New vaccines targeting hyper-variable influenza determinants must be prepared
against every new strain. The challenge is now to develop influenza vaccines also eliciting
a strong and sustained cytotoxic response against highly-conserved determinants such as
the matrix (M1) and nuclear (NP) proteins. However, their antigenic presentation properties
in humans are less defined. We, therefore, analyzed major histocompatibility complex class
(MHC)-I and -II presentation of endogenously processed M1 and NP in human antigen
presenting cells (APCs).
To do so, we used APCs endogenously-expressing the M1 and NP proteins. M1 and
NP epitopes can be presented by MHC-I and -II, which results in the activation of
previously-isolated antigen-specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes. Considering the
importance of CD4+ T lymphocytes in the cellular immune response, we cloned M1 and NP
proteins in fusion with gp100 MHC-II enhancing sequences, which do not disrupt MHC-I
presentation. APCs expressing MHC-II-enhanced or wild type constructs were used to
stimulate human T lymphocytes in vitro and quality of antigen presentation was evaluated
on the basis of cytokine production and cell surface molecule expression (ELISA or
intracellular cytokine staining). We expanded antigen-specific effector CD8+ and CD4+ T
lymphocytes which secreted pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF and MIP-1β) to
similar extents both with and without MHC-II enhancement. The quality of CD4+ and
CD8+ T lymphocytes generated independent of the level of M1 and NP endogenous MHCII
presentation suggests that this presentation is sufficient for short-term T lymphocyte
stimulation.
Thus, endogenous expression of M1 and NP have stimulated T lymphocytes
specific to conserved influenza epitopes, as determined by an original identification
technique based on mRNA segments called mRNA PCR-based epitope chase (mPEC).
Overall, these new insights about T lymphocytes expanded following MHC-I and -II
presentation of endogenous M1 and NP could prove useful for new complementary
heterosubtypic vaccination strategies.
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Systems biology of the human MHC class I immunopeptidomeGranados, Diana Paola 10 1900 (has links)
Le système de différenciation entre le « soi » et le « non-soi » des vertébrés permet la détection et le rejet de pathogènes et de cellules allogéniques. Il requiert la surveillance de petits peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I). Les molécules du CMH I sont des hétérodimères composés par une chaîne lourde encodée par des gènes du CMH et une chaîne légère encodée par le gène β2-microglobuline. L’ensemble des peptides est appelé l’immunopeptidome du CMH I. Nous avons utilisé des approches en biologie de systèmes pour définir la composition et l’origine cellulaire de l’immunopeptidome du CMH I présenté par des cellules B lymphoblastoïdes dérivés de deux pairs de fratries
avec un CMH I identique. Nous avons découvert que l’immunopeptidome du CMH I est spécifique à l’individu et au type cellulaire, qu’il dérive préférentiellement de transcrits abondants, est enrichi en transcrits possédant d’éléments de reconnaissance par les petits ARNs, mais qu’il ne montre aucun biais ni vers les régions génétiques invariables ni vers les régions polymorphiques. Nous avons également développé une nouvelle méthode qui combine la spectrométrie de masse, le séquençage de nouvelle génération et la bioinformatique pour l’identification à grand échelle de peptides du CMH I, dont ceux résultants de polymorphismes nucléotidiques simples non-synonymes (PNS-ns), appelés
antigènes mineurs d’histocompatibilité (AMHs), qui sont les cibles de réponses allo-immunitaires. La comparaison de l’origine génomique de l’immunopeptidome de soeurs avec un CMH I identique a révélé que 0,5% des PNS-ns étaient représentés dans l’immunopeptidome et que 0,3% des peptides du CMH I seraient immunogéniques envers une des deux soeurs. En résumé, nous avons découvert des nouveaux facteurs qui modèlent l’immunopeptidome du CMH I et nous présentons une nouvelle stratégie pour l’indentification de ces peptides, laquelle pourrait accélérer énormément le développement d’immunothérapies ciblant les AMHs. / The self/nonself discrimination system of vertebrates allows detection and rejection of pathogens and allogeneic cells. It requires the surveillance of short peptides presented by major histocompatibility class I (MHC I) molecules on the cell surface. MHC I molecules are heterodimers that consist of a heavy chain produced by MHC genes and a light chain encoded by the β2-microglobulin gene. The peptides presented by MHC I molecules are collectively referred to as the MHC I immunopeptidome. We employed systems biology approaches to define the composition and cellular origin of the self MHC I immunopeptidome presented by B lymphoblastoid cells derived from two pairs of MHC-identical siblings. We found that the MHC I immunopeptidome is subject- and cell-specific, derives preferentially from abundant transcripts, is enriched in transcripts bearing microRNA response elements and shows no bias toward invariant vs. polymorphic genomic sequences. We also developed a novel personalized approach combining mass-spectrometry, next-generation sequencing and bioinformatics for high-throughput identification of MHC I peptides including those caused by nonsynonymous single nucleotide polymorphisms (ns-SNPs), termed minor histocompatibility antigens (MiHAs), which are the targets of allo-immune responses. Comparison of the genomic landscape of the immunopeptidome of MHC-identical siblings revealed that 0.5% of ns-SNPs
were represented in the immunopeptidome and that 0.3% of the MHC I-peptide
repertoire would be immunogenic for one of the siblings. We discovered new factors that shape the self MHC I immunopeptidome and present a novel strategy for the identification of MHC I-associated peptides that could greatly accelerate the development of MiHA-targeted immunotherapy.
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Réponse cellulaire pan-spécifique : analyse de la présentation d’antigènes conservés du virus de l’influenzaDoucet, Jean-Daniel 08 1900 (has links)
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