La mécanotransduction est une propriété essentielle au développement des tissus, leur homéostasie et leur physiopathologie. La voie de signalisation YAP (Yes-Associated Protein) est apparue comme un régulateur particulièrement important de la mécano-réponse. Un défaut de mécanosensibilité défectueuse, associant une signalisation aberrante de la voie YAP, a récemment été rapportée dans des myoblastes humains de patients souffrant de dystrophie musculaire congénitale liée à des mutations du gène de la lamine (L-CMD) (Bertrand et al., 2014). La L-CMD est une forme grave de dystrophie musculaire à début précoce. Mon projet de doctorat visait à disséquer les défauts de la mécanosensibilité de cellules précurseurs du muscle présentant la mutation ΔK32. Mes résultats ont montré que les myoblastes mutants ΔK32 présentaient des un défaut de contact cellule-cellul, attestant d’anomalies de transmission des forces mécaniques entre cellules. Contrairement à ce que l’on observe dans les cellules contrôles à confluence, la voie YAP reste activée dans les myoblastes mutants ΔK32. Cela s‘est traduit par une activité transcriptionnelle accrue de YAP et une localisation nucléaire persistante de YAP dans les myoblastes ΔK32. La suractivité de YAP dans les myoblastes mutants ΔK32 n'était pas liée à une altération de la voie Hippo, voie de signalisation canonique qui régule YAP. La signalisation YAP défectueuse a été associée à une désorganisation de différents sous-ensembles du cytosquelette d'actine, incluant l'actine supranucléaire, l'actine basale et les fibres d'actine de la jonction cellule-cellule. La formation et la maturation de jonctions cellule-cellule était défectueuse dans les myoblates ΔK32, et les expressions protéiques des deux principales cadhérines, M et N-cadhérins, étaient significativement réduites à confluence. De plus, les myoblastes mutants ΔK32 présentaient une perte accrue de contact cellule-cellule pendant la migration, responsable d’une perte de la migration collective dans les cellules mutantes. Enfin, nous avons rapporté une augmentation de l'activité transcriptionnelle de la signalisation Smad 1/5/8 dans les myoblastes mutants ΔK32. En conclusion, ces résultats de thèse suggèrent que les défauts de mécanosensibilité dans les myoblastes mutants ΔK32 affectent la capacité des myoblastes à former des contacts cellule-cellule et à migrer collectivement. Ces défauts de mécanosensibilité peuvent contribuer à la physiopathologie de la L-CMD. / Mechanotransduction is critical for tissue development, homeostasis and diseases. YAP (Yes-Associated Protein) signaling has emerged as a particularly important regulator of the mechano-response. A defective mechanosensing response, including aberrant YAP signaling, has been recently reported in human myoblasts from patients suffering from LMNA related congenital dystrophy (L-CMD) (Bertrand et al., 2014). L-CMD is a severe early-onset form of muscular dystrophies caused by mutations in A-type lamins. My PhD project aims to further dissect mechanosensing defects of immortalized muscle precursor cells which carry the L-CMD causing ∆K32 mutation. My results showed that ∆K32 mutant myoblasts had a defective translation of mechanical forces at cell-cell contact sides. ∆K32 mutant myoblasts failed to inactivate YAP in high cell-cell contact conditions, as attested by an increased transcriptional activity of YAP and a persistent nuclear localization. YAP overactivity in ∆K32 mutant myoblasts was not related to an impaired activation of the Hippo signaling pathway. Defective YAP signaling was associated with a disorganization of different subsets of the actin cytoskeleton, including the supranuclear actin, the basal actin and the actin fibers at cell-cell junction. The formation of mature cell-cell contacts in ∆K32 myoblats was defective, and the protein expressions of both M- and N-cadherins were significantly reduced in high cell-cell contact conditions. Moreover, ∆K32 mutant myoblasts showed an increased loss of cell-cell contact during migration, which caused a shift from a sheet-like to a single cell migration pattern. Finally, we reported an increased transcriptional activity of mechanosensitive Smad 1/5/8 signaling in ∆K32 mutant myoblasts. Taken together, these results suggest that mechanosensing defects in ∆K32 mutant myoblasts affect the ability of myoblast to form cell-cell contacts and to migrate collectively. These mechanosensing defects may contribute to the pathophysiology of L-CMD.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23770号 / 医博第4816号 / 新制||医||1056(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 長船 健二, 教授 安達 泰治, 教授 遊佐 宏介 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Des centaines de mutations du gène LMNA codant les lamines A/C, protéines nucléaires de la famille des filaments intermédiaires, causent des pathologies. Pour ma thèse, j’ai étudié la mutation LMNA p.R388P, nouvellement identifiée comme responsable de dystrophie musculaire congénitale (L-CMD) associée à une lipodystrophie. Mes objectifs étaient de caractériser les propriétés des lamines mutées et leur impact dans des cellules et dans un muscle squelettique.Résultats : 1) La culture ex vivo de fibroblastes de peau de la patiente a révélé leur entrée prématurée en sénescence. 2) Dans des modèles de cellules immortalisées, la lamine A mutante surexprimée, qui s’accumule exclusivement dans le nucléoplasme et est anormalement soluble a modifié les propriétés de ses partenaires LAP2α et émerine, augmenté le nombre de gènes liés par les lamines A, diminué la compaction de la chromatine et induit des dysmorphies nucléaires. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs d’histones acétyltransférases ou désacétylases n’a pas restauré la forme des noyaux. 3) Dans le muscle tibial antérieur de souris injecté avec des virus adéno-associés codant les lamines A mutantes, le nombre de fibres oxydatives de type IIA est diminué et l’expression de quelques gènes est modifiée.Conclusion : Nous avons montré que les lamines A R388P altèrent la structure du noyau, l’intégrité de l’enveloppe nucléaire et l’organisation/expression du génome, avec des conséquences sur le typage des fibres de muscle squelettique. De par ses effets pléiotropes, la lamine A mutante apparaît particulièrement toxique, en accord avec la sévérité de la pathologie observée chez la patiente. / Hundreds of mutations in the LMNA gene coding lamins A/C, nuclear intermediate filament proteins, cause several diseases. For my thesis, I studied the p.R388P LMNA mutation, newly identified as responsible for congenital muscular dystrophy (L-CMD) associated with lipodystrophy. My goals were to determine the properties of the mutant lamin A and its impact in cells and a skeletal muscle.Results: 1) Ex vivo culture of patient skin fibroblasts revealed their premature entry into senescence. 2) In immortalised cell lines, the overexpression of the mutant lamin A, which accumulates exclusively in the nucleoplasm and is abnormally soluble, modified the properties of two partners, LAP2α and emerin, increased the amount of genes bound by lamin A, decreased the compaction of chromatin and induced nuclear dysmorphies. Treatment of cells with histone acetyltransferase or deacetylase inhibitors did not rescue nuclear shape. 3) In mouse tibialis anterior muscle injected with adeno-associated virus coding for mutant lamin A, the number of oxidative type IIA myofibres was decreased and expression of few genes modified. Conclusion: We showed that R388P lamins A alter the structure of nuclei, nuclear envelope integrity and the organisation/expression of the genome, with consequences on skeletal muscle fibre typing. Because of its pleiotropic effects, the mutant lamin A appears particularly toxic, in agreement with the severity of the patient’s disease.