Le mélanome est un cancer en recrudescence depuis 10 ans. Il est devenu de ce fait une préoccupation majeure de santé publique. Au cours de la progression tumorale, l’expression des molécules d’adhérence (intégrines et cadhérines) ainsi que le récepteur à l’IGF de type I (IGF-IR) sont modulées. Notamment, il est observé un « switch des cadhérines » de la E vers la N, une surexpression des intégrines α2 et αv, et de l’IGF-IR. C’est dans cette optique que nous nous sommes intéressés aux dialogues croisés entre les molécules d’adhérence et l’IGF-IR. Dans un premier temps, nous avons mis en évidence un dialogue entre la N-cadhérine et l’intégrine αv lors de la migration des mélanomes. Dans un second temps, nous avons démontré que les dialogues entre l’IGF-IR, l’intégrine α2 et les cadhérines différent selon la nature de la cadhérine incriminée. Ces modifications de dialogues ont un impact important sur la propension migratoire des mélanomes. / Cutaneous malignant melanoma is an aggressive melanocyte malignancy that is characterized by early metastasis, bad prognosis, and poor survival. Altered cell-cell adhesion (cadherins), cell-extracellular matrix (integrins) interaction, and IGF type I receptor (IGF-IR) are playing an important role in melanoma progression. In particular, we observed a "cadherins switch" from E to N, and α2- αv-integrins and IGF-IR over-expression. In this optics, we were interested in the crosstalk between adhesion molecules and IGF-IR. First, we brought to light a crosstalk between N-cadherin and αv-integrin during melanoma migration. Secondly, we demonstrated that the dialogues between the IGF-IR, α2-integrin and cadherins are different according to the nature of the cadherin involved. Such modulation in the crosstalk may have an important impact on the migratory inclination of melanomas.

La mécanotransduction est une propriété essentielle au développement des tissus, leur homéostasie et leur physiopathologie. La voie de signalisation YAP (Yes-Associated Protein) est apparue comme un régulateur particulièrement important de la mécano-réponse. Un défaut de mécanosensibilité défectueuse, associant une signalisation aberrante de la voie YAP, a récemment été rapportée dans des myoblastes humains de patients souffrant de dystrophie musculaire congénitale liée à des mutations du gène de la lamine (L-CMD) (Bertrand et al., 2014). La L-CMD est une forme grave de dystrophie musculaire à début précoce. Mon projet de doctorat visait à disséquer les défauts de la mécanosensibilité de cellules précurseurs du muscle présentant la mutation ΔK32. Mes résultats ont montré que les myoblastes mutants ΔK32 présentaient des un défaut de contact cellule-cellul, attestant d’anomalies de transmission des forces mécaniques entre cellules. Contrairement à ce que l’on observe dans les cellules contrôles à confluence, la voie YAP reste activée dans les myoblastes mutants ΔK32. Cela s‘est traduit par une activité transcriptionnelle accrue de YAP et une localisation nucléaire persistante de YAP dans les myoblastes ΔK32. La suractivité de YAP dans les myoblastes mutants ΔK32 n'était pas liée à une altération de la voie Hippo, voie de signalisation canonique qui régule YAP. La signalisation YAP défectueuse a été associée à une désorganisation de différents sous-ensembles du cytosquelette d'actine, incluant l'actine supranucléaire, l'actine basale et les fibres d'actine de la jonction cellule-cellule. La formation et la maturation de jonctions cellule-cellule était défectueuse dans les myoblates ΔK32, et les expressions protéiques des deux principales cadhérines, M et N-cadhérins, étaient significativement réduites à confluence. De plus, les myoblastes mutants ΔK32 présentaient une perte accrue de contact cellule-cellule pendant la migration, responsable d’une perte de la migration collective dans les cellules mutantes. Enfin, nous avons rapporté une augmentation de l'activité transcriptionnelle de la signalisation Smad 1/5/8 dans les myoblastes mutants ΔK32. En conclusion, ces résultats de thèse suggèrent que les défauts de mécanosensibilité dans les myoblastes mutants ΔK32 affectent la capacité des myoblastes à former des contacts cellule-cellule et à migrer collectivement. Ces défauts de mécanosensibilité peuvent contribuer à la physiopathologie de la L-CMD. / Mechanotransduction is critical for tissue development, homeostasis and diseases. YAP (Yes-Associated Protein) signaling has emerged as a particularly important regulator of the mechano-response. A defective mechanosensing response, including aberrant YAP signaling, has been recently reported in human myoblasts from patients suffering from LMNA related congenital dystrophy (L-CMD) (Bertrand et al., 2014). L-CMD is a severe early-onset form of muscular dystrophies caused by mutations in A-type lamins. My PhD project aims to further dissect mechanosensing defects of immortalized muscle precursor cells which carry the L-CMD causing ∆K32 mutation. My results showed that ∆K32 mutant myoblasts had a defective translation of mechanical forces at cell-cell contact sides. ∆K32 mutant myoblasts failed to inactivate YAP in high cell-cell contact conditions, as attested by an increased transcriptional activity of YAP and a persistent nuclear localization. YAP overactivity in ∆K32 mutant myoblasts was not related to an impaired activation of the Hippo signaling pathway. Defective YAP signaling was associated with a disorganization of different subsets of the actin cytoskeleton, including the supranuclear actin, the basal actin and the actin fibers at cell-cell junction. The formation of mature cell-cell contacts in ∆K32 myoblats was defective, and the protein expressions of both M- and N-cadherins were significantly reduced in high cell-cell contact conditions. Moreover, ∆K32 mutant myoblasts showed an increased loss of cell-cell contact during migration, which caused a shift from a sheet-like to a single cell migration pattern. Finally, we reported an increased transcriptional activity of mechanosensitive Smad 1/5/8 signaling in ∆K32 mutant myoblasts. Taken together, these results suggest that mechanosensing defects in ∆K32 mutant myoblasts affect the ability of myoblast to form cell-cell contacts and to migrate collectively. These mechanosensing defects may contribute to the pathophysiology of L-CMD.

Les jonctions adhérentes sont des jonctions intercellulaires essentielles à la morphogenèse et à la maintenance des tissus. Elles reposent sur l'assemblage de grands complexes multiprotéiques aux contacts intercellulaires, centrés sur des protéines transmembranaires appelées cadhérines. Nous avons découvert deux nouveaux partenaires des cadhérines N, E, M, P, R et 11, les flotillines. Nous avons caractérisé leur interaction avec la N-cadhérine et découvert qu'elle était constitutive à la membrane plasmique et vraisemblablement indirecte. Nous avons démontré que les flotillines sont essentielles à la stabilisation des jonctions adhérentes dans des cellules musculaires et épithéliales, ainsi qu'à des processus cellulaires dépendants des jonctions. Nous montrons qu'en effet, les flotillines sont nécessaires à l'interaction des cadhérines avec la p120-caténine, qui inhibe leur internalisation et leur dégradation. Nos expériences suggèrent que les flotillines seraient impliquées dans la formation d'un microdomaine membranaire particulier au niveau de la jonction en cours de maturation, permettant le recrutement de la p120-caténine. / Cadherins are essential in many fundamental processes such as tissue patterning during development and in the maintenance of adult tissue architecture. At regions of cell-cell contact, cadherins assemble into large macromolecular complexes named adherens junctions. Here we identify flotillin 1 and 2 as new partners of several classical cadherins. The interaction between flotillines and N-cadherin is constitutive at the plasma membrane and seems to require an intermediate partner. Knockdown of flotillins had a dramatic effect on N- and E-cadherin recruitment at the adherens junctions in both mesenchymal and epithelial cell types. At the molecular level, we show that flotillins stabilize cadherins at the PM hence allowing the coupling of 120 catenin, one of their main stabilizing partners. Our results suggest that flotillins might scaffold a membrane microdomaine at maturing junctions, allowing the recruitment of p120-catenin.

L’altération des mécanismes impliqués dans l’homéostasie intestinale peut conduire au développement de cancers colorectaux (CCR). Les CCR se situent au 2nd rang des décès par cancer en France et il est donc nécessaire d’améliorer nos connaissances pour mieux les soigner. L’objectif de ces travaux était de comprendre les mécanismes impliqués dans l’homéostasie intestinale par le biais de la Cadhérine atypique MUCDHL dont l’expression semble diminuée dans les CCR. Les conséquences de cette perte et le mode d’action de MUCDHL restent mal connus. Ainsi, l’étude d’une large cohorte de patients et d’un modèle murin a permis de confirmer que la perte de MUCDHL aggrave la tumorigenèse intestinale. De plus, la caractérisation de l’interaction entre MUCDHL et la β-caténine a montré que le mode d’action de MUCDHL est plus complexe qu’une simple séquestration membranaire de la β-caténine impliquant différentes voies de signalisation. Enfin ces travaux ont permis d’identifier des interactants de MUCDHL. Les résultats montrent pour la première fois le rôle de suppresseur de tumeurs de MUCDHL dans le côlon et apportent des informations sur sa régulation et son mode d’action. / The alteration of mechanisms involved in intestinal homeostasis leads to the development of colorectal cancer (CRC). In France, CRC is the second leading cause of cancer mortality, and it is therefore necessary to improve our knowledge to treat it better. The objective of this project was to understand more precisely mechanisms involved in intestinal homeostasis through the atypical Cadherin MUCDHL whose expression seems decreased in CRC. However, the consequences of this loss, as well as the mode of action and the molecular relays of MUCDHL were largely unknown. Thus, the study of a large cohort of patients and of a murine model confirmed that the loss of MUCDHL enhances intestinal tumorigenesis. In addition, the functional characterization of the interaction between MUCDHL and β-catenin showed that the mode of action of MUCDHL is more complex than a simple membrane sequestration of β-catenin involving different signaling pathways. Finally, new interactants of MUCDHL were identified. The results obtained through this work show, for the first time, the tumor suppressor role of MUCDHL in the colon, and provide informations about its regulation and mode of action.

Le muscle et l’os coopèrent mécaniquement mais aussi biochimiquement, via les facteurs de croissance et les cytokines. Suite à une lésion de l’os, les cellules souches sont recrutées et induites en différenciation osseuse grâce à la sécrétion de molécules bioactives telles que les facteurs de croissance. L’une des stratégies de l’ingénierie tissulaire de l’os est de combiner des matériaux avec des facteurs de croissance osseux. Les protéines morphogéniques osseuses (ou BMPs), pouvant être présentées aux cellules en solution ou enchâssées dans la matrice, appartiennent à la famille des facteurs de croissance basiques et jouent un rôle très important dans la formation de l’os. Les BMPs induisent non seulement une différenciation osseuse de progéniteurs osseux, mais induisent aussi la transdifférenciation de progéniteurs musculaires vers un phénotype ostéoblastique. L’obtention de la complexité de l’architecture tissulaire osseuse nécessite des interactions continues entre la cellule et son microenvironnement. Ces interactions sont médiées par les récepteurs cellule/matrice (intégrine) et cellule/cellule (cadhérines). Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés au rôle du système adhésif dans la réponse à la BMP-2 lors de la transdifférenciation des myoblastes C2C12. Nous avons utilisé un film multicouche à base de hyaluronane et de poly(L-lysine) comme biomatériau pour présenter la BMP-2 par la matrice. A court terme, nous avons mis en évidence une coopération entre l’intégrine 3 et les récepteurs BMP dans l’induction d’un étalement cellulaire et d’une réponse précoce à la BMP-2, via la protéine GSK3. A plus long terme, nous avons montré un switch du répertoire adhésif en réponse à la BMP-2. Enfin, nos résultats suggèrent une coopération entre les intégrines β3 et β5 et les cadhérines N et 11 dans la transdifférenciation induite par la BMP-2. / Muscle and bone cooperate both mechanically and biochemically, through growth factors and cytokines. Following a bone lesion, stem cells are recruited and their differentiation is induced via the secretion of bioactive molecules such as growth factors. One strategy in bone tissue engineering is to combine materials with bone growth factors. Bone Morphogenetic Proteins (BMPs), which can be presented to the cell either in solution or bound to the matrix, belong to the basic growth factor family and play a very important role in bone formation. BMPs induce not only the differentiation of bone progenitors, but also the transdifferentiation of muscle progenitors towards an osteoblastic phenotype. Obtaining the complexity of the bone tissue architecture requires continuous interactions between the cell and its microenvironment. These interactions are mediated by cell/matrix and cell/cell receptors (integrins and cadherins, respectively). In this thesis, we investigated the role of the adhesion system in the context of its response to BMP-2 during the transdifferentiation of C2C12 murine myoblasts. To do so, we used polelectrolyte multilayer films composed of hyaluronan and poly(L-lysine) as a biomaterial to present BMP-2 in a matrix-bound manner. Short term, we revealed a cooperation between the integrin 3 and BMP receptors in the induction of cell spreading and of an early response to BMP-2 via the protein GSK3. In a longer term, we showed a switch in the repertoire of adhesion receptors in response to BMP-2. Finally, our results suggest a cooperation between 3 and 5 integrins and cadherins N and 11 for the BMP-2-induced transdifferentiation.

Les mécanismes adhésifs jouent un rôle crucial en biologie. Les cadhérines classiques constituent une des principales familles de molécules d‟adhésion cellulaire dépendante du calcium. Ces glycoprotéines transmembranaires sont impliquées dans des interactions principalement homophiles. Ces interactions régulent des voies de signalisation impliquées dans de nombreux phénomènes biologiques. Cette thèse porte sur l‟étude comparative des dynamiques d‟interactions des cadhérines E- et -11, prototypes respectivement des cadhérines classiques de type I et II. Le ciblage d‟acides aminés particuliers de l‟interface adhésive nous a permis de montrer que pour les cadhérines de type I, l‟échange de brin beta avec le Trp2 ont un rôle clé ; pour les types II un mécanisme différent intervient. Nous avons aussi développé une chimie innovante pour contrôler l‟immobilisation orientée et covalente de protéines. Enfin une revue décrit une étude de l‟activation de voies de signalisation par engagement des cadhérines.

Au cours de la différenciation des cellules épithéliales de l'intestin, les cellules reçoivent et intègrent des signaux de la part de leur environnement, aboutissant à des modifications de leur morphologie et de l'expression des gènes. Les cellules intestinales modulent notamment leur capacités d'adhérence à la matrice extracellulaire et aux cellules voisines par le biais de complexes protéiques associées respectivement aux intégrines et aux cadhérines. En utilisant la lignée cellulaire d'adénocarcinome colique humain HT-29, nous étudions la mise en place des jonctions adhérentes accompagnant la différenciation entérocytaire et nous soulignons l'importance de différents facteurs dans les étapes successives de maturation de ces jonctions. Ainsi, nous montrons que la laminine 5 est capable d'induire une augmentation d'expression de la E-cadhérine et permet d'initier la mise en place des jonctions adhérentes par un mécanisme dépendant de l'adhérence cellule-matrice extracellulaire: en activant les intégrines α3β1 et α6β4, la laminine 5 induit une augmentation transitoire de l'activité de la PI3 Kinase qui active à son tour la GTPase monomérique Rac1 et son variant Rac1b. Nous montrons que la maturation des jonctions adhérentes est ensuite favorisée par l'émergence de radeaux lipidiques au sein desquels la E-cadhérine et la p120ctn interagissent de façon préférentielle. Le recrutement des protéines des jonctions adhérentes dans ces microdomaines est dépendant de l'activité de Rac1 et conduit à l'apparition de marqueurs de différenciation entérocytaire. Dans une seconde partie, nous étudions le rôle spécifique de la p120ctn dans la régulation de l'homéostasie des cellules intestinale. Nous montrons que l'augmentation du pool cytoplasmique de p120ctn induit une baisse de prolifération des cellules HT-29 suite à l'interaction de p120ctn avec le complexe cycline E /cdk2. Cette association se traduit par une augmentation de la stabilité de la cycline E et conduit à des défauts de duplication des centrosomes. Des effets similaires sont observés dans les cellules cancéreuses et pourraient être à l'origine du développement tumoral.

Le potentiel invasif et métastatique d'une tumeur est contrôlé par l'angiogenèse via le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) et les altérations des systèmes impliqués dans l'adhérence cellulaire via les cadhérines. Dans ce travail, nous montrons que le L-165041, agoniste du récepteur nucléaire PPARβ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) régule l'expression du VEGF dans des cellules dérivées de cancer du col de l'utérus dont le facteur étiologique est un papillomavirus (HPV). Cependant, cet effet est observé uniquement dans des cellules HPV18 indépendamment de l'oncoprotéïne virale E6 et de sa cible p53. De façon intéressante, à la diflérence de ce que nous observons dans des cellules de cancer vésical, le L- 165041 ne contrôle pas la transcription mais stabilise les messagers des isoformes du VEGF (VEGF121, VEGF165, VEGF189) indépendamment du récepteur PPARβ. La stabilisation des ARNm VEGF nécessite la phosphorylation de la p38 MAPK qui conduit, seule ou suite à une cascade de phosphorylations, au déplacement de la protéine HuR du noyau vers le cytoplasme et in fine à la stabilisation des ARNm VEGF. D'autre part, l'agoniste du PPARβ interviendrait dans la« transition épithélio-mésenchymateuse » de cellules urothéliales malignes, puisqu'une augmentation de l'expression de la cadhérine E (marqueur épithélial) et une diminution de l'expression de la cadhérine N (marqueur mésenchymateux) sont observées selon le phénotype cellulaire. Elucider le mécanisme moléculaire d'action des agonistes de PPARβ est d'un intérêt crucial puisque certains ligands sont en cours d'évaluation clinique pour le traitement de maladies métaboliques (dyslipidémies diabète de tvpe II). / Tumor invasive and metastatic potential is controlled by angiogenesis through VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) up-regulation and altered cadherin-mediated cellular adhesion as well. In this work, we show that the L-165041 nuclear receptor PPARβ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) agonist regulates VEGF expression in cervical cancer derived cells harboring a Human Papilloma Virus (HPV). However, this effect is only observed in HPVl8 positive cells through E6 viral oncoprotein and p53 independent mechanisms. Interestingly, unlike our data obtained in bladder cancer cells, L-165041 does not control VEGF transcription but stabilizes VEGF isoforms mRNA (VEGF121, VEGFl65, VEGFl89) and acts through PPARβ-independent mechanisms. This mRNA stabilization requires p38 MAPK phosphorylation leading to the nuclear/cytoplasmic shuttling ofHuR protein and consequently to the VEGF mRNA stabilization. Furthennore, the PPARβ agonist would be involved in epithelial to mesenchymal transition since it increases E-cadherin expression and decreases N-cadherin one according to the cellular phenotype. To elucidate the molecular mechanism of PPARβ agonists action is crucial because some of ligands are currently in clinical trials for the treatment of metabolic diseases (dyslipidemia, type II diabetes).

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.