BACKGROUND:Nemaline myopathy (NM) is a congenital muscle disease associated with weakness and the presence of nemaline bodies (rods) in muscle fibers. Mutations in seven genes have been associated with NM, but the most commonly mutated gene is nebulin (NEB), which is thought to account for roughly 50% of cases.RESULTS:We describe two siblings with severe NM, arthrogryposis and neonatal death caused by two novel NEB mutations: a point mutation in intron 13 and a frameshift mutation in exon 81. Levels of detectable nebulin protein were significantly lower than those in normal control muscle biopsies or those from patients with less severe NM due to deletion of NEB exon 55. Mechanical studies of skinned myofibers revealed marked impairment of force development, with an increase in tension cost.CONCLUSIONS:Our findings demonstrate that the mechanical phenotype of severe NM is the consequence of mutations that severely reduce nebulin protein levels and suggest that the level of nebulin expression may correlate with the severity of disease.

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris 6(UPMC, Paris, France). / Bien que les bases physiopathologiques de beaucoup de maladies musculaires soient dorénavant connues, les myopathies congénitales à cores (MCs), maladies génétiques qui se présentent dès la naissance avec un retard du développement moteur, une faiblesse musculaire et des complications respiratoires et/ou cardiaques parfois mortelles, demeurent mal comprises. Des mutations dans RYR1, SEPN1, TTN, ACTA1, CFL2 et MEGF10 ont été associées aux MCs, pourtant, dans plus de 50% des cas, le gène responsable reste à identifier. L’objectif de ma thèse a été de clarifier les mécanismes physiopathologiques des MCs par l’identification de nouveaux gènes ou de nouvelles mutations. Cette thèse a eu une dimension internationale concrétisée par la mise en place d’une cotutelle UPMC (France) et UdeM (Québec). J’ai développé deux axes de recherche complémentaires. D’une part j’ai étudié 21 familles informatives avec MC récessive, scoliose et atteinte respiratoire, en combinant clonage positionnel et étude de gènes candidats et en utilisant des outils variés allant du génotypage au séquençage de nouvelle génération (NGS). En parallèle, j’ai étudié 24 familles avec une MC autosomique récessive affectant les muscles cardiaque et squelettiques et dont le phénotype était semblable à celui observé chez des patients avec des délétions dans les 6 derniers exons de TTN. Ainsi pour l'analyse de cette deuxième cohorte, nous avons appliqué une stratégie de séquençage de gène candidat ciblée sur ces exons et de NGS pour le reste du gène. Pendant mon doctorat j'ai identifié les défauts génétiques de 8 des 45 familles étudiées (18 %), et caractérisé 3 nouvelles entités médicales, dont deux MCs dues à des nouvelles mutations de TTN. Ces résultats ont servi à l’identification de nouvelles interactions protéiques de la titine et contribuent à définir TTN comme une cause majeure de pathologies musculaires cardiaques et/ou squelettiques. Une troisième nouvelle forme de MC est provoquée par une mutation d'un coactivateur transcriptionnel peu connu et jamais associé à une maladie. Ces résultats ont révélé un nouvel acteur clef et une nouvelle voie de signalisation dans la physiopathologie du muscle, ont eu un bénéfice direct en termes de conseil génétique et ouvrent la voie pour le développement de thérapies. / While the pathophysiological bases of many muscular diseases are nowadays well known, congenital core myopathies (CMs) remain poorly understood. CMs are genetic diseases which generally present at birth with delayed motor development, muscle weakness, and sometimes fatal respiratory or cardiological complications. Mutations in RYR1, SEPN1, ACTA1, TTN and MEGF10 have been associated with various CMs, yet for about 50% of CM cases the responsible gene has not been identified. The objective of my thesis was to clarify the pathophysiological mechanisms of new forms of CM through the identification of new genes or new mutations in known genes. This thesis had an international dimension as manifested by a UPMC (France) and UdeM (Québec) joint direction. I developed two complementary axes of research. First, I studied 21 informative families with a recessive CM with scoliosis and respiratory failure, for which I combined positional cloning and candidate gene studies, using various tools from genotyping to next generation sequencing (NGS). The second part of this work consisted on the analysis of 24 families with recessive CM affecting both cardiac and skeletal muscles. Their phenotype was similar to that previously observed in cases with deletions in the last 6 exons of the giant gene TTN. Thus we applied a candidate gene strategy through direct Sanger sequencing coupled with NGS for the analysis of this second cohort. During my PhD work I identified the molecular defect in 8 out of the 45 families included (18%), which led to the identification and characterization of 3 novel medical entities, including two new CMs due to novel defects of TTN. These results served to identify new titin protein interactions, and participate in the definition of TTN defects as a major cause of both cardiac and skeletal muscle conditions. A third new form of CM is due to mutations of a poorly-known transcriptional coactivator whose role in striated muscle physiology was unknown and which had never been associated to a human condition. Globally, these results unveiled a novel important protein and pathway in muscle pathophysiology, have direct health benefits (molecular diagnosis) and open the way for therapeutic investigations.

Centronuclear myopathy (CNM) is a genetically heterogeneous disorder associated with general skeletal muscle weakness, type I fiber predominance and atrophy, and abnormally centralized nuclei. Autosomal dominant CNM is due to mutations in the large GTPase dynamin 2 (DNM2), a mechanochemical enzyme regulating cytoskeleton and membrane trafficking in cells. To date, 40 families with CNM-related DNM2 mutations have been described, and here we report 60 additional families encompassing a broad genotypic and phenotypic spectrum. In total, 18 different mutations are reported in 100 families and our cohort harbors nine known and four new mutations, including the first splice-site mutation. Genotype-phenotype correlation hypotheses are drawn from the published and new data, and allow an efficient screening strategy for molecular diagnosis. In addition to CNM, dissimilar DNM2 mutations are associated with Charcot-Marie-Tooth (CMT) peripheral neuropathy (CMTD1B and CMT2M), suggesting a tissue-specific impact of the mutations. In this study, we discuss the possible clinical overlap of CNM and CMT, and the biological significance of the respective mutations based on the known functions of dynamin 2 and its protein structure. Defects in membrane trafficking due to DNM2 mutations potentially represent a common pathological mechanism in CNM and CMT.

La myopathie némaline (MN) est une maladie neuromusculaire rare représentant la forme la plus répandue de myopathie congénitale. Elle est caractérisée par une faiblesse musculaire et la présence de structures en forme de bâtonnets au sein de la fibre musculaire squelettique. Au cours des dix dernières années, le développement de plusieurs modèles murins de MN a permis de mettre en évidence in vitro plusieurs mécanismes physiopatholgiques responsables, au moins en partie, de la faiblesse musculaire associée à la MN. Ce projet était donc dédié à la caractérisation phénotypique in vivo de la fonction musculaire squelettique de quatre modèles murins de MN reproduisant des formes humaines légères et sévères. A l’aide d’un dispositif expérimental précédemment développé au laboratoire, la fonction musculaire squelettique a été évaluée de manière strictement noninvasive à l’aide des techniques d’imagerie de résonance magnétique (IRM) multimodale (Dixon, T2, imagerie du tenseur de diffusion (DTI)) et de spectroscopie de résonance magnétique du phosphore 31 (SRM-P31) associées à des mesures mécaniques. Nous avons démontré que les altérations observées in vivo ne sont pas nécessairement similaires à celles rapportées in vitro. La SRM-P31 nous a permis de mettre en évidence des altérations métaboliques uniquement pour les formes sévères. Une absence d’infiltration intramusculaire de tissu adipeux a également été observée à l’aide de l’IRM Dixon. Enfin, les techniques d’IRM T2 et de DTI nous ont permis de déterminer des biomarqueurs noninvasifs et quantitatifs qui pourraient, à terme, permettre d’évaluer la sévérité et/ou la progression de la maladie chez les patients atteints de MN. / Nemaline myopathy (NM) is the most common of the non-dystrophic congenital myopathies and is characterized by muscle weakness and accumulation of an electron dense material (rods) within the sarcomeric units. Over the past decade, the generation of mouse models of NM allowed to identify in vitro several physiopathological mechanisms involved, at least in part, in muscle weakness in NM. This project has been devoted to the in vivo phenotypic characterization of the skeletal muscle function of mouse models mimicking mild and severe human forms of NM. Skeletal muscle function was assessed on four mouse models of NM with an original and strictly noninvasive experimental setup designed and built in our laboratory allowing 31P-magnetic resonance spectroscopy (31P-MRS) and multimodal magnetic resonance imaging (MRI) investigations, including Dixon, T2 mapping and Diffusion Tensor Imaging (DTI). Our results suggest that in vitro alterations did not necessarily translate into similar changes in vivo. 31P-MRS illustrated an altered energy metabolism only for the mouse models mimicking severe form of NM. Our Dixon MRI investigations showed that fatty infiltration was negligible. Finally, T2 maps and DTI experiments provided relevant noninvasive and quantitative biomarkers for monitoring the severity and/or the progression of NM in patients.