Orientador : Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-01T04:10:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ponce-Soto_LuisAlberto_M.pdf: 12886909 bytes, checksum: d45d6b46b5f324d21504b1ca07ebdfde (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Crotalus durissus collilineatus é uma serpente de grande importância médica na região Centro Oeste do Brasil. Desta forma justifica-se o interesse em isolar e caracterizar compostos como a crotoxina que representa a principal fração do veneno bruto, com importantes atividades farmacológicas. Aproximadamente 20 mg de veneno total foram aplicados em uma coluna Protein Pack SW 300 (0,78X30cm Waters) acoplada a um sistema HPLC (Waters) resultando no isolamento da crotoxina. Nessa fase o perfil cromatográfico não mostrou a fração correspondente á crotamina o que reforça a importância do estudo da crotoxina desse veneno. O isolamento das frações crotapotina e fosfolipase A2 a partir da crotoxina purificada foi realizado em uma coluna de fase reversa, C-18 J.l-Boundapak em HPLC. Quatro isoformas de crotapotina, sendo as isoformas F3 e F4 majoritariamente recuperadas e apenas uma de fosfolipase A2, (F6) foram purificadas com um alto grau de pureza segundo a caracterização bioquímica e estudos eletroforéticos como SDS-PAGE revelando a massa mo/ecular a crotoxina de 24 kDa e da PLA2 de 15 kDa e das crotapotinas F3 e F4 com 9 kDa. O estudo em forma cruzada do efeito inibitório das crotapotinas sobre as PLA2 provenientes de Cdcoll, Cdt e Cdcas, sugere que as diferenças estruturais são responsveis pelas diferenças no mecanismo de inibição. A caracterização cinética da fosfolipase A2 de Cdcoll evidencia um comportamento de enzima alostérica em nossas condições experimentais, dado não relatado ainda na literatura especializada. Este fato reforçou nosso interesse em estabelecer comparações entre outras fosfolipases dependentes de calcio provenientes de veneno de serpentes que possuam um comportamento michaeliano. O efeito neurotóxico do veneno total, crotoxina, isoformas de crotapotina (F3 e F4); assim como a fração, PLA2 (F6) isolados, suas reassociações com a PLA2 (F6) de Cdcoll, foi estudada em registros miográficos, em preparações nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Evidenciou-se ainda que a reassociação das isoformas da crotapotina de Cdcoll (F3 e F4) e a PLA2 (F6) restabelece o efeito bloqueador neuromuscular característico da crotoxina nativa. Foram realizadas abordagens bioquímica e farmacológica comparando as duas isoformas de crotapotina (F3 e F4) e reassociação de ambas com a fosofolipase isolada da mesma crotoxina de Cdcoll, são resultados ainda não registrados na bibliografía. Portanto este trabalho é importante para comprender a integridade ou pureza dos componentes isolados, assim como para identificar o efeito neurotóxico. É importante ressaltar que a reassociação entre as isoformas de crotapotina e fosfolipase (PLA2) não implicou em perda do efeito biológico, o que mostra que a metodologia utilizada foi satisfatória para a purificação das proteínas, preservando a integridade estrutural e funcional das isoformas estudadas / Abstract: Crotalus durissus collilineatus is a serpent of great medical importance in the region Center West of Brazil. af this form the interest in isolating is justified and characterizing composites as the crotoxina like that they present the main fraction of the raw poison, with important pharmacology activities. Approximately 20 mg of total poison had been applied in a column Protein Pack SW 300 (0,78X30cm Waters) coupled to a system HPLC (Waters) resulting in the isolation of the crotoxina. In this phase the chromatographic profile did not show crotamina to the corresponding fraction a what it strengthens the importance of the study of the crotoxina of this poison. The isolation of the fractions crotapotina and fosfolipase A2 from the crotoxina purificaty was carried through in a phase column reversa, C-18 I-l-Boundapak in HPLC. Four. isoformas of crotapotina (F3 and F4) to greater recover, and only one of phospholipase A2, (F6) they had been purificatory with one high degree of pureness according to characterization electrophoretics biochemist and studies as SDS-PAGE disclosing relative the molecular mass of the 24 kDa crotoxina of 15 kDa PLA2 kDa and the crotapotinas F3 and F4 with 9 kDa respectively. The inibitory effect of the crotapotins on the PLA2 in crossed form proceeding from CdcolI, Cdt and Cdcas discloses to differences structured in the inhibition mechanism. The kinetic characterization of phospholipase A2 de Cdcoll evidences a alosteritic enzyme behavior in our experimental conditions, still dates not told in specialized literature. This fact strengthened our interest in establishing matchings among others fosfolipases dependents of calcio proceeding from poison of serpents that possess a michaeliano behavior. The neurotoxicity effect of the total poison, as well as of the crotoxina, beyond the components of the crotoxina; isoforms of crotapotina (F3 and F4); as well as the fraction, PLA2 (F6) isolated, as of of these reasociations with PLA2 (F6) of Cdcoll, was studied in miographics registers, red tapes isolated nerve frenic-diaphragm of mouse and to biventer cervicis of chick. It was still proven that the to reconstruct of isoformas of the crotapotina of Cdcoll (F3 and F4) and PLA2 (F6) commit the effect choke to neuromuscular characteristic of the native crotoxina. Boardíngs the two biochemist and pharmacology comparing isoformas of crotapotina (F3 and F4) and to reconstruct of both with phospholipase isolated of the same crotoxina of Cdcoll, still not registered in the bibliography, for in such a way this whork were important to comprender the integrity or purity of the isolatedcomponents, as well as identifying the neurotoxocity effect. It is important to resaltar that the to reconstruct enters isoformas of crotapotina and phospholipase (PLA2) did not imply in loss of the biological effect, what sample that the used methodology was satisfactory for the purification of proteins, preserving studied the structural and functional integrity of isoformas / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular