Resumo:A criptococose é uma infecção fúngica causada por levedura do gênero Cryptococcus. Dentre as principais micoses sistêmicas nas últimas décadas, a criptococose vem assumindo um relevante papel, com altos índices de morbidade e mortalidade principalmente em pacientes imunodeprimidos. O presente trabalho teve por objetivo verificar a ocorrência de Cryptococcus spp. em amostras ambientais na área urbana de Bauru-SP, Brasil, estabelecendo os focos ambientais, com a finalidade de compreender a eco-epidemiologia do microrganismo. Cinquenta amostras ambientais de dez locais representativos foram processadas e semeadas em ágar semente de Níger (NSA) e Sabouraud. As colônias com características macro e micromorfológicas compatíveis com Cryptococcus foram submetidas a provas bioquímicas, sendo que 12/50 (24%) das amostras foram positivas para o gênero Cryptococcus. A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que foram encontradas espécies causadoras de criptococose no município de Bauru, constituindo-se na existência de focos ambientais, com potencial patogênico para o homem e animais. A compreensão da eco-epidemiologia do Cryptococcus constitui em uma importante ferramenta na estratégia de medidas preventivas / Abstract:Cryptococcosis is a fungal infection caused by yeasts of the genus Cryptococcus. One of the main systemic mycoses in recent decades, has been assuming an important role, with high rates of morbidity and mortality especially in immunosuppressed patients. The present study aimed to verify the existence of Cryptococcus spp. from environmental samples in the urban area of Bauru-SP, Brazil, establishing the environmental focus, with the purpose of understand the eco-epidemiology of the micro-organism. Fifty environmental samples from ten representative sites were processed and seeded in agar Niger seed (NSA) and Sabouraud. The colonies with macro and micromorphological compatible with Cryptococcus underwent biochemical tests, and 12/50 (24%) of the samples were positive for the genus Cryptococcus. From the results obtained, it can be concluded that species that cause cryptococcosis were found in the city of Bauru-SP, Brazil, constituting the existence of outbreaks with potential environmental pathogenic for human and animals. The eco-epidemiological understanding of the Cryptococcus constitutes an important tool in the strategy of preventive measures / Orientador:Marcia Marinho / coorientador: Juliana Regina Peiró / Banca:Luzia Helena Queiroz / Banca:Simone Baldini Lucheis / Mestre

Submitted by MARIANA MALAVAZI DESTRO null (m_destro@hotmail.com) on 2016-07-07T16:27:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertação para arquivar Unesp.pdf: 751238 bytes, checksum: ef14aad090e2f5e2974329d58301aef8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-11T14:37:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 destro_mm_me_araca.pdf: 751238 bytes, checksum: ef14aad090e2f5e2974329d58301aef8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-11T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 destro_mm_me_araca.pdf: 751238 bytes, checksum: ef14aad090e2f5e2974329d58301aef8 (MD5) Previous issue date: 2016-06-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A criptococose é uma infecção fúngica causada por levedura do gênero Cryptococcus. Dentre as principais micoses sistêmicas nas últimas décadas, a criptococose vem assumindo um relevante papel, com altos índices de morbidade e mortalidade principalmente em pacientes imunodeprimidos. O presente trabalho teve por objetivo verificar a ocorrência de Cryptococcus spp. em amostras ambientais na área urbana de Bauru-SP, Brasil, estabelecendo os focos ambientais, com a finalidade de compreender a eco-epidemiologia do microrganismo. Cinquenta amostras ambientais de dez locais representativos foram processadas e semeadas em ágar semente de Níger (NSA) e Sabouraud. As colônias com características macro e micromorfológicas compatíveis com Cryptococcus foram submetidas a provas bioquímicas, sendo que 12/50 (24%) das amostras foram positivas para o gênero Cryptococcus. A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que foram encontradas espécies causadoras de criptococose no município de Bauru, constituindo-se na existência de focos ambientais, com potencial patogênico para o homem e animais. A compreensão da eco-epidemiologia do Cryptococcus constitui em uma importante ferramenta na estratégia de medidas preventivas. / Cryptococcosis is a fungal infection caused by yeasts of the genus Cryptococcus. One of the main systemic mycoses in recent decades, has been assuming an important role, with high rates of morbidity and mortality especially in immunosuppressed patients. The present study aimed to verify the existence of Cryptococcus spp. from environmental samples in the urban area of Bauru-SP, Brazil, establishing the environmental focus, with the purpose of understand the eco-epidemiology of the micro-organism. Fifty environmental samples from ten representative sites were processed and seeded in agar Niger seed (NSA) and Sabouraud. The colonies with macro and micromorphological compatible with Cryptococcus underwent biochemical tests, and 12/50 (24%) of the samples were positive for the genus Cryptococcus. From the results obtained, it can be concluded that species that cause cryptococcosis were found in the city of Bauru-SP, Brazil, constituting the existence of outbreaks with potential environmental pathogenic for human and animals. The eco-epidemiological understanding of the Cryptococcus constitutes an important tool in the strategy of preventive measures.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-02-13T13:18:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE colação de grau.pdf: 1971286 bytes, checksum: 680d0e24d2f0efbe0313ab8752f1cc93 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T13:18:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE colação de grau.pdf: 1971286 bytes, checksum: 680d0e24d2f0efbe0313ab8752f1cc93 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / CNPq / A criptococose é uma infecção fúngica predominantemente oportunista cujos principais agentes etiológicos são Cryptococcus neoformans e C. gattii. O tratamento de escolha para a micose é a anfotericina B associada ou não a 5-fluorocitosina seguido de terapia de manutenção com fluconazol. Contudo, falhas no tratamento associadas à toxicidade e ao aparecimento de resistência aos fármacos têm sido relatadas, o que torna essencial a descoberta de novas alternativas terapêuticas, como a ciclopirox olamina (CPO). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar a ação in vitro e in vivo da CPO livre e encapsulada em lipossomas frente a amostras de Cryptococcus neoformans para futura aplicação no tratamento da criptococose sistêmica. Foram obtidas 30 amostras de Cryptococcus neoformans provenientes de pacientes imunocomprometidos. A preparação dos lipossomas convencionais e furtivos de CPO foi realizada pelo método da hidratação do filme lipídico e a caracterização foi realizada avaliando os seguintes parâmetros: tamanho de partícula, Índice de Polidispersão (PDI) e taxa de encapsulação (EE%). Para otimização dos constituintes lipídicos, foi realizado um planejamento fatorial fracionado a 24-1 a partir da melhor formulação obtida nos estudos de pré-formulação. A cinética de liberação in vitro foi conduzida para avaliar e comparar estatisticamente o perfil de liberação dos sistemas convencional e furtivo. Adicionalmente, testes de susceptibilidade antifúngica foram realizados de acordo com Clinical and Laboratotry Standards Institute (CLSI). Para caracterização molecular dos isolados, PCR fingerprinting foi conduzida utilizando os primers M13 e URA5. O estudo in vivo foi conduzido com camundongos imunossuprimidos, infectados com Cryptococcus neoformans (106 cels/mL) e tratados com CPO lipossomal (Lipo-CPO) (0.5 mg/Kg). As concentrações de CPO utilizadas na forma livre e encapsuladas em lipossomas convencionais e furtivos variaram de 0,30 a 625 µg/mL. Os resultados do planejamento fatorial mostraram que o ponto central apresentou características proeminentes com redução do tamanho de partícula em 17,1%; melhora do PDI em 15,34% e da quantidade de fármaco encapsulado (25%). A cinética do lipossoma furtivo apresentou uma velocidade de liberação mais controlada quando comparada ao lipossoma convencional. Com relação ao teste de susceptibilidade, todos os inóculos foram susceptíveis a CPO livre, com atividade fungistática entre 0,30 e 0,61 g/mL e fungicida entre 1,22 e 4,88 g/mL. Não houve diferença relacionada à atividade antifúngica entre as formulações lipossomais convencionais e furtivas. A atividade fungistática dos lipossomas foi observada em concentrações variando de 1,22 e 2,44 g/mL. A faixa das concentrações fungicidas foi de 1,22 a 9,76 g/mL. O padrão de bandas do URA5 revelou que todos os isolados apresentam genótipo VNI, característico de C. neoformans. Lipo-CPO apresentou eficácia antifúngica comparada à anfotericina B após 14 dias de infecção, reduzindo a carga fúngica em aproximadamente 8% no baço, 41% no fígado, 63% no pulmão e 89% no cérebro. O exame histológico evidenciou infiltrado celular no fígado dos grupos tratados com Lipo-CPO e anfotericina B, porém com menor intensidade quando comparado ao grupo controle. O estudo sugere que a CPO encapsulada em lipossomas apresenta significativa ação antimicótica frente às amostras sistêmicas de C. neoformans, reforçando seu potencial na terapêutica da criptococose. / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection whose the main ethiological agents are Cryptococcus neoformans and C. gattii. The treatment of choice for this mycosis is amphotericin B combined or not with 5-fluorocytosine, followed by maintenance therapy with fluconazole. However treatment failures associated with toxicity and drug resistance has been reported, which makes it essential to the discovery of new therapies, such as ciclopirox olamine (CPO). The purpose of this study was to characterize and evaluate the in vitro and in vivo antifungal activity of ciclopirox olamine in its free form and encapsulated in liposomes against thirty Cryptococcus neoformans isolates obtained from immunocompromised patients for future application in systemic cryptococcosis treatment. Preparation of conventional and stealth liposomes was performed to define particle size, polydispersity index (PDI), CPO amount of encapsulated and efficiency of encapsulation (EE%). For optimization of liposomal lipid constituents, a 24-1 fractional factorial design was carried out from the prominent formulation obtained in pre-characterization studies. In vitro release kinetics was conducted to evaluate and compare statistically the release profile of conventional and stealth liposomes. Antifungal susceptibility testing was conducted in accordance with the reference method. Regarding molecular characterization, PCR fingerprinting was carried out by using MT3 and URA5 primers. Concentrations of CPO used in free form and encapsulated into stealth and conventional liposomes ranged from 625 to 0.3 g.mL-1. Despite of the central point of the factorial design have increased the total lipids amount in 35.52%, it showed prominent characteristics when compared with the L4 formulation with improvement of the mean size in 17.1%, PDI in 15.34% and CPO amount in 25%. The minimum concentrations of stearylamine to obtain the stable formulation for one month was 5.88 mM. . Kinetics of stealth liposomes showed a release profile more controlled as compared to conventional liposomes. All inoculations were susceptible to CPO in its free form, presenting fungistatic activity between 0.3 and 0.61 g.mL-1 and fungicidal activity between 1.22 and 4.88 g.mL-1. There was no difference with respect to antimycotic activity between conventional and stealth liposomal formulations. Fungistatic activity of liposomes was observed at concentrations ranging from 1.22 and 2.44 g.mL-1. Fungicidal concentration range was 1.22-9.76 g.mL-1. The URA5 profile analized demonstrated all isolates are VNI genotype (C. neoformans). The treatment with Lipo-CPO showed a reduction of 8% of the C. neoformans population in spleen, 40.8% in liver, 63% in lungs and 89% in brain after 14 days of infection. Histological examination revealed cell infiltrate either Lipo-CPO or Amphotericin B treated groups, but less intense when compared to control group. The results suggest that Ciclopirox olamine loaded-liposomes have significant antimycotic activity against Cryptoccocus spp, reinforcing its potential for in vivo studies and its application in cryptococcosis treatment.