Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst. / Härtill 6 uppsatser.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cryptococcus neoformans species Complex comprises the main agents of cryptococcosis, an important systemic mycosis of nature and opportunistic. These species are capable of expressing multiple virulence factors that contribute to the development of resistance to antifungal therapeutic use. Research seeking new effective therapy measures are necessary. Heat shock proteins (Hsp) have been shown to be a promising molecular target for medical treatment of various diseases such as various forms of cancer and atherosclerosis. Studies have demonstrated that the expression of these chaperonins is also required for the maintenance of cellular homeostasis in different fungal pathogens. From this perspective, this study aimed to investigate the effect of blocking the protein Hsp90 front of sensitivity to antifungal agents in vitro planktonic cells and sessile, production of virulence factors in vitro and in vivo virulence in Cryptococcus neoformans species Complex. Therefore, the action of yeast Hsp90 protein was blocked with radicicol drug - an antibiotic capable of inhibiting the ATPase activity of Hsp90 - and then the cultures were evaluated for in vitro susceptibility to antifungal agents for therapeutic use in planktonic cells and associated in biofilms. We also assessed the effect of inactivation of Hsp90 on the production of virulence factors capsule, melanin and proteases. In addition, the in vivo virulence was investigated in a model of experimental infection using the nematode Caenorhabditis elegans. The results revealed that radicicol inhibited the growth of planktonic cells Cryptococcus spp. (n=12) with values of minimum inhibitory concentration (MIC) ranging from 0.5 to 2 &#956;g/mL. We observed synergy between pharmacological and radicicol azoles. Furthermore, blockade of Hsp90 potentiated the effect of in vitro antifungal agents, particularly for the fluconazole and itraconazole, which MIC values were reduced by up to 64 times the face of isolated cells (n=12). Although the blockade of Hsp90 by isolated radicicol was not able to inhibit biofilm formation and biofilm formed of Cryptococcus spp. (n=12) (p>0.05), the inactivation of Hsp90 potentiated the effect of amphotericin B, azoles, especially fluconazole, when tested in combination with radicicol (p<0.05). Moreover, blockade of Hsp90 significantly reduced the volume of capsular Cryptococcus spp. (n=4) (p<0.05). However, no difference was observed in production of melanin by radicicol treated cells (n=4) (p>0.05) as well as the production of protease by strains of Cryptococcus spp. (n=4) (p>0.05). By contrast, inactivation of Hsp90 decreased virulence Cryptococcus spp. in vitro and in vivo in C. elegans (p<0.0001) as well as maximize the effect of fluconazole in vitro and in vivo. Therefore, Hsp90 is an important target for the development of antifungal strategies. However, further studies are needed to better understand the role of Hsp90 in fungal pathogens of the genus Cryptococcus spp. / O Complexo Cryptococcus neoformans/C. gattii compreende os principais agentes da criptococose, uma importante micose de natureza sistÃmica e carÃter oportunista. Essas espÃcies sÃo capazes de expressar mÃltiplos fatores de virulÃncia que contribuem para o surgimento de resistÃncia aos antifÃngicos de uso terapÃutico. Pesquisas que buscam novas medidas eficazes de terapia sÃo necessÃrias. ProteÃnas do choque tÃrmico (Hsp) tÃm se demonstrado um alvo molecular promissor em Ãrea mÃdica para o tratamento de diversas doenÃas, tais como diferentes tipos de cÃncer e aterosclerose. Estudos demonstram que a expressÃo dessas chaperoninas tambÃm à necessÃria para a manutenÃÃo da homeostase celular em diferentes patÃgenos fÃngicos. Nessa perspectiva, o presente estudo teve como objetivo investigar o efeito do bloqueio das proteÃnas Hsp90 frente à sensibilidade a antifÃngicos in vitro em cÃlulas planctÃnicas e sÃsseis, produÃÃo de fatores de virulÃncia in vitro e virulÃncia in vivo no Complexo Cryptococcus neoformans/C. gattii. Para tanto, a aÃÃo das proteÃnas Hsp90 fÃngicas foi bloqueada com o fÃrmaco radicicol â um antibiÃtico capaz de inibir a atividade ATPÃsica das Hsp90 â e, em seguida, as culturas foram avaliadas quanto à sensibilidade in vitro a antifÃngicos de uso terapÃutico em cÃlulas planctÃnicas e associadas em biofilmes. TambÃm foi avaliado o efeito da inativaÃÃo das Hsp90 sobre a produÃÃo dos fatores de virulÃncia cÃpsula, melanina e proteases. AlÃm disso, a virulÃncia in vivo foi investigada em modelo de infecÃÃo experimental utilizando o nematÃdeo Caenorhabditis elegans. Os resultados revelaram que o radicicol inibiu o crescimento das cÃlulas planctÃnicas de Cryptococcus spp. (n=12), com valores de concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) que variaram de 0,5 â 2 &#956;g/mL. Observou-se sinergismo farmacolÃgico entre o radicicol e os azÃlicos. Ademais, o bloqueio das Hsp90 potencializou o efeito dos antifÃngicos in vitro, sobretudo para o fluconazol e o itraconazol, os quais tiveram os valores de CIM reduzidos em atà 64 vezes frente Ãs cÃlulas isoladas (n=12). Embora o bloqueio das Hsp90 pelo radicicol isolado nÃo tenha sido capaz de inibir a formaÃÃo de biofilme e biofilme formado de Cryptococcus spp. (n=12) (p>0,05), a inativaÃÃo das Hsp90 potencializou o efeito da anfotericina B e derivados azÃlicos, sobretudo o fluconazol, quando testados em combinaÃÃo com o radicicol (p<0,05). AlÃm disso, o bloqueio das Hsp90 reduziu significativamente o volume capsular de Cryptococcus spp. (n=4) (p<0,05). PorÃm, nÃo observou-se diferenÃa na produÃÃo de melanina por cÃlulas tratadas com o radicicol (n=4) (p>0,05) assim como na produÃÃo de proteases pelas cepas de Cryptococcus spp. (n=4) (p>0,05). Em contrapartida, a inativaÃÃo das Hsp90 diminuiu a virulÃncia de Cryptococcus spp. in vitro e in vivo em C. elegans (p<0,0001) alÃm de potencializar o efeito do fluconazol in vitro e in vivo. Portanto, as Hsp90 sÃo um importante alvo para o desenvolvimento de estratÃgias antifÃngicas. Todavia, estudos mais aprofundados sÃo necessÃrios para melhor compreender o papel das Hsp90 nos patÃgenos fÃngicos do gÃnero Cryptococcus spp.

Abstract not available. / Hui, Mamie. / "Dec 2010." / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-04, Section: B, page: . / Thesis (M.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 209-236). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web.

Freqüentemente, não é possível o isolamento do agente infeccioso em cultivo apropriado, devido à rotina de colocar os fragmentos de tecido em formalina. Isso ocorre porque esse procedimento provoca a morte das estruturas fúngicas, restringindo o diagnóstico aos achados micromorfológicos da histopatologia. Dessa forma, a identificação dos microrganismos aos cortes torna-se um importante meio de avaliação para o estabelecimento do diagnóstico da criptococose. Objetivos: descrever as características histopatológicas da criptococose por meio dos métodos histoquímicos de Hematoxilina-Eosina (H&E), Gomori-Grocott (GMS), Mucicarmim de Mayer, Fontana-Masson (FM) e a técnica Fontana-Masson/Mucicarmim de Mayer (FM/MM), a fim de diferenciar o Cryptococcus, quando da existência de possibilidade da infecção pelo fungo deficiente de cápsula. Métodos: no estudo, foram confeccionadas e analisadas setenta e nove (79) lâminas contendo fragmentos de tecido pulmonar com diagnóstico prévio da criptococose. Foram avaliados os seguintes aspectos: presença de reação tecidual e fagocitose ao H&E; existência de espaço claro indicativo de cápsula e brotamentos no GMS; presença ou ausência de material polissacarídico capsular no MM; evidência de melanina na parede celular fúngica no FM; presença de material polissacarídico capsular e de melanina na parede celular fúngica, simultaneamente ou não no FM/MM. Resultados: na linhagem deficiente de cápsula, o H&E revelou presença de reação tecidual granulomatosa com necrose, células gigantes e fagocitose; na linhagem capsular, ausência de reação inflamatória com a presença de estruturas exibindo halo claro perinuclear. Na linhagem deficiente de cápsula, o GMS detectou a presença de elementos fúngicos corados, na cor negra, e estruturas de tamanho pequeno sem espaço claro circundante, com disposição, ora intracelular, ora extracelular; na linhagem capsular, as leveduras apresentaram espaço claro circundante, indicando a presença de cápsula e brotamentos únicos ou múltiplos com estreita base de crescimento. Na linhagem deficiente, o MM detectou estruturas fúngicas fracamente reativas para cápsula; na linhagem capsular, as leveduras exibiram grande cápsula evidenciou estruturas fúngicas contendo melanina na parede celular. Na linhagem deficiente de cápsula, o FM/MM apresentou elementos fúngicos corados somente pela técnica de Fontana-Masson, evidenciando melanina na parede celular fúngica; não houve simultaneidade com Mucicarmim de Mayer. Na linhagem capsular, pela técnica de Mucicarmim de Mayer, as leveduras apresentaram espessa cápsula polissacarídica de cor magenta, com simultânea evidência de melanina na parede celular fúngica detectada pela técnica de Fontana-Masson. Conclusões: a técnica combinada permitiu a identificação de um maior número de microrganismos do que as técnicas individuais. A criptococose exibe reatividade em vários métodos histoquímicos, incluindo as colorações especiais de Fontana-Masson e de Mucicarmim de Mayer. A utilização dessas colorações, em conjunto, possibilita a identificação laboratorial do Cryptococcus. / Frequenty, the isolation of the infectious agent in appropriate culture is not possible, by the fact routine place the histologic sections in formalin. This procedure leads to death of the fungal structures, what restricts the diagnosis to the mycromorphology findings of the histopathology. Therefore, the identification of the fungal agents in the histologic sections becomes an important way to establish the diagnosis of cryptococosis. Objectives: Describe histopathogical characteristics through histochemical methods of Hematoxilineosin (H&E), Grocott methenamine silver (GMS), Mucicarmine (MM), Fontana-Masson (FM) and the Fontana-Masson/Mucicarmine technique (FM/MM), in order to differentiate the Cryptococcus, when of the existence of possibility of the infection for the deficientcapsule of Cryptococcus. Methods: In this study, has been confectioned and analyzed seventy nine (79) blades contend histologic pulmonary sections with previous diagnosis of cryptococosis. It has been evaluated aspects as: presence or absence of tecidual reaction and phagocytosis in the H&E; presence or absence of clear space indicating capsule and buddings in the GMS; presence or absence of capsular polyssacharides material in MM; presence of melanin in fungal cellular wall in the FM; presence of capsular polyssacharides material and melanin in the fungal cellular wall simultaneously or not in the FM/MM. Results: In the lineage capsule-deficient, H&E revealed presence of granulomatous reaction with necrosis, giant cell and phagocytosis; in the lineage capsular, absence of inflammatory reaction with presence of structures showing perinuclear clear space. In the lineage capsule-deficient, the GMS has detected presence of fungal elements stained in black color; structures of small size without clearl surrounding space with disposal intracellular, and or extracellular; in the lineage capsular, the yeasts presents suronding clear space, indicating presence capsule and only or multiple buddings with narrow base of growth. In the lineage capsule-deficient, MM demonstrated fungal structures with weakly reaction for capsule; in the lineage capsular, the yeasts exhibit great polyssacharides capsule, with star aspect, stained in magenta color. In both lineage, the FM evidence fungal structures contend melanin in the cellular wall. In the lineage capsule-deficient, the FM/MM present fungal elements stains only for the technique of Fontana-Masson evidencing the melanin in the fungal cellular wall, in these histologic sections did not have concurrence with Mucicarmine. In the lineage capsular, the yeasts presents great polyssacharides capsule stains in magenta color for the technique of Mucicarmine with simultaneous evidence of melanin in the fungal cellular wall for the technique of Fontan- Masson. Conclusions: Cryptococosis shows reactivity in some histochemical methods, including the colorations special of Fontana-Masson and Mucicarmine. Combinations of colorations are used in the identification of the Cryptococcus. The agreed tecnhiques allowed the identification of a bigger number of fungal agents of that the individual tecniques.

Freqüentemente, não é possível o isolamento do agente infeccioso em cultivo apropriado, devido à rotina de colocar os fragmentos de tecido em formalina. Isso ocorre porque esse procedimento provoca a morte das estruturas fúngicas, restringindo o diagnóstico aos achados micromorfológicos da histopatologia. Dessa forma, a identificação dos microrganismos aos cortes torna-se um importante meio de avaliação para o estabelecimento do diagnóstico da criptococose. Objetivos: descrever as características histopatológicas da criptococose por meio dos métodos histoquímicos de Hematoxilina-Eosina (H&E), Gomori-Grocott (GMS), Mucicarmim de Mayer, Fontana-Masson (FM) e a técnica Fontana-Masson/Mucicarmim de Mayer (FM/MM), a fim de diferenciar o Cryptococcus, quando da existência de possibilidade da infecção pelo fungo deficiente de cápsula. Métodos: no estudo, foram confeccionadas e analisadas setenta e nove (79) lâminas contendo fragmentos de tecido pulmonar com diagnóstico prévio da criptococose. Foram avaliados os seguintes aspectos: presença de reação tecidual e fagocitose ao H&E; existência de espaço claro indicativo de cápsula e brotamentos no GMS; presença ou ausência de material polissacarídico capsular no MM; evidência de melanina na parede celular fúngica no FM; presença de material polissacarídico capsular e de melanina na parede celular fúngica, simultaneamente ou não no FM/MM. Resultados: na linhagem deficiente de cápsula, o H&E revelou presença de reação tecidual granulomatosa com necrose, células gigantes e fagocitose; na linhagem capsular, ausência de reação inflamatória com a presença de estruturas exibindo halo claro perinuclear. Na linhagem deficiente de cápsula, o GMS detectou a presença de elementos fúngicos corados, na cor negra, e estruturas de tamanho pequeno sem espaço claro circundante, com disposição, ora intracelular, ora extracelular; na linhagem capsular, as leveduras apresentaram espaço claro circundante, indicando a presença de cápsula e brotamentos únicos ou múltiplos com estreita base de crescimento. Na linhagem deficiente, o MM detectou estruturas fúngicas fracamente reativas para cápsula; na linhagem capsular, as leveduras exibiram grande cápsula evidenciou estruturas fúngicas contendo melanina na parede celular. Na linhagem deficiente de cápsula, o FM/MM apresentou elementos fúngicos corados somente pela técnica de Fontana-Masson, evidenciando melanina na parede celular fúngica; não houve simultaneidade com Mucicarmim de Mayer. Na linhagem capsular, pela técnica de Mucicarmim de Mayer, as leveduras apresentaram espessa cápsula polissacarídica de cor magenta, com simultânea evidência de melanina na parede celular fúngica detectada pela técnica de Fontana-Masson. Conclusões: a técnica combinada permitiu a identificação de um maior número de microrganismos do que as técnicas individuais. A criptococose exibe reatividade em vários métodos histoquímicos, incluindo as colorações especiais de Fontana-Masson e de Mucicarmim de Mayer. A utilização dessas colorações, em conjunto, possibilita a identificação laboratorial do Cryptococcus. / Frequenty, the isolation of the infectious agent in appropriate culture is not possible, by the fact routine place the histologic sections in formalin. This procedure leads to death of the fungal structures, what restricts the diagnosis to the mycromorphology findings of the histopathology. Therefore, the identification of the fungal agents in the histologic sections becomes an important way to establish the diagnosis of cryptococosis. Objectives: Describe histopathogical characteristics through histochemical methods of Hematoxilineosin (H&E), Grocott methenamine silver (GMS), Mucicarmine (MM), Fontana-Masson (FM) and the Fontana-Masson/Mucicarmine technique (FM/MM), in order to differentiate the Cryptococcus, when of the existence of possibility of the infection for the deficientcapsule of Cryptococcus. Methods: In this study, has been confectioned and analyzed seventy nine (79) blades contend histologic pulmonary sections with previous diagnosis of cryptococosis. It has been evaluated aspects as: presence or absence of tecidual reaction and phagocytosis in the H&E; presence or absence of clear space indicating capsule and buddings in the GMS; presence or absence of capsular polyssacharides material in MM; presence of melanin in fungal cellular wall in the FM; presence of capsular polyssacharides material and melanin in the fungal cellular wall simultaneously or not in the FM/MM. Results: In the lineage capsule-deficient, H&E revealed presence of granulomatous reaction with necrosis, giant cell and phagocytosis; in the lineage capsular, absence of inflammatory reaction with presence of structures showing perinuclear clear space. In the lineage capsule-deficient, the GMS has detected presence of fungal elements stained in black color; structures of small size without clearl surrounding space with disposal intracellular, and or extracellular; in the lineage capsular, the yeasts presents suronding clear space, indicating presence capsule and only or multiple buddings with narrow base of growth. In the lineage capsule-deficient, MM demonstrated fungal structures with weakly reaction for capsule; in the lineage capsular, the yeasts exhibit great polyssacharides capsule, with star aspect, stained in magenta color. In both lineage, the FM evidence fungal structures contend melanin in the cellular wall. In the lineage capsule-deficient, the FM/MM present fungal elements stains only for the technique of Fontana-Masson evidencing the melanin in the fungal cellular wall, in these histologic sections did not have concurrence with Mucicarmine. In the lineage capsular, the yeasts presents great polyssacharides capsule stains in magenta color for the technique of Mucicarmine with simultaneous evidence of melanin in the fungal cellular wall for the technique of Fontan- Masson. Conclusions: Cryptococosis shows reactivity in some histochemical methods, including the colorations special of Fontana-Masson and Mucicarmine. Combinations of colorations are used in the identification of the Cryptococcus. The agreed tecnhiques allowed the identification of a bigger number of fungal agents of that the individual tecniques.

Freqüentemente, não é possível o isolamento do agente infeccioso em cultivo apropriado, devido à rotina de colocar os fragmentos de tecido em formalina. Isso ocorre porque esse procedimento provoca a morte das estruturas fúngicas, restringindo o diagnóstico aos achados micromorfológicos da histopatologia. Dessa forma, a identificação dos microrganismos aos cortes torna-se um importante meio de avaliação para o estabelecimento do diagnóstico da criptococose. Objetivos: descrever as características histopatológicas da criptococose por meio dos métodos histoquímicos de Hematoxilina-Eosina (H&E), Gomori-Grocott (GMS), Mucicarmim de Mayer, Fontana-Masson (FM) e a técnica Fontana-Masson/Mucicarmim de Mayer (FM/MM), a fim de diferenciar o Cryptococcus, quando da existência de possibilidade da infecção pelo fungo deficiente de cápsula. Métodos: no estudo, foram confeccionadas e analisadas setenta e nove (79) lâminas contendo fragmentos de tecido pulmonar com diagnóstico prévio da criptococose. Foram avaliados os seguintes aspectos: presença de reação tecidual e fagocitose ao H&E; existência de espaço claro indicativo de cápsula e brotamentos no GMS; presença ou ausência de material polissacarídico capsular no MM; evidência de melanina na parede celular fúngica no FM; presença de material polissacarídico capsular e de melanina na parede celular fúngica, simultaneamente ou não no FM/MM. Resultados: na linhagem deficiente de cápsula, o H&E revelou presença de reação tecidual granulomatosa com necrose, células gigantes e fagocitose; na linhagem capsular, ausência de reação inflamatória com a presença de estruturas exibindo halo claro perinuclear. Na linhagem deficiente de cápsula, o GMS detectou a presença de elementos fúngicos corados, na cor negra, e estruturas de tamanho pequeno sem espaço claro circundante, com disposição, ora intracelular, ora extracelular; na linhagem capsular, as leveduras apresentaram espaço claro circundante, indicando a presença de cápsula e brotamentos únicos ou múltiplos com estreita base de crescimento. Na linhagem deficiente, o MM detectou estruturas fúngicas fracamente reativas para cápsula; na linhagem capsular, as leveduras exibiram grande cápsula evidenciou estruturas fúngicas contendo melanina na parede celular. Na linhagem deficiente de cápsula, o FM/MM apresentou elementos fúngicos corados somente pela técnica de Fontana-Masson, evidenciando melanina na parede celular fúngica; não houve simultaneidade com Mucicarmim de Mayer. Na linhagem capsular, pela técnica de Mucicarmim de Mayer, as leveduras apresentaram espessa cápsula polissacarídica de cor magenta, com simultânea evidência de melanina na parede celular fúngica detectada pela técnica de Fontana-Masson. Conclusões: a técnica combinada permitiu a identificação de um maior número de microrganismos do que as técnicas individuais. A criptococose exibe reatividade em vários métodos histoquímicos, incluindo as colorações especiais de Fontana-Masson e de Mucicarmim de Mayer. A utilização dessas colorações, em conjunto, possibilita a identificação laboratorial do Cryptococcus. / Frequenty, the isolation of the infectious agent in appropriate culture is not possible, by the fact routine place the histologic sections in formalin. This procedure leads to death of the fungal structures, what restricts the diagnosis to the mycromorphology findings of the histopathology. Therefore, the identification of the fungal agents in the histologic sections becomes an important way to establish the diagnosis of cryptococosis. Objectives: Describe histopathogical characteristics through histochemical methods of Hematoxilineosin (H&E), Grocott methenamine silver (GMS), Mucicarmine (MM), Fontana-Masson (FM) and the Fontana-Masson/Mucicarmine technique (FM/MM), in order to differentiate the Cryptococcus, when of the existence of possibility of the infection for the deficientcapsule of Cryptococcus. Methods: In this study, has been confectioned and analyzed seventy nine (79) blades contend histologic pulmonary sections with previous diagnosis of cryptococosis. It has been evaluated aspects as: presence or absence of tecidual reaction and phagocytosis in the H&E; presence or absence of clear space indicating capsule and buddings in the GMS; presence or absence of capsular polyssacharides material in MM; presence of melanin in fungal cellular wall in the FM; presence of capsular polyssacharides material and melanin in the fungal cellular wall simultaneously or not in the FM/MM. Results: In the lineage capsule-deficient, H&E revealed presence of granulomatous reaction with necrosis, giant cell and phagocytosis; in the lineage capsular, absence of inflammatory reaction with presence of structures showing perinuclear clear space. In the lineage capsule-deficient, the GMS has detected presence of fungal elements stained in black color; structures of small size without clearl surrounding space with disposal intracellular, and or extracellular; in the lineage capsular, the yeasts presents suronding clear space, indicating presence capsule and only or multiple buddings with narrow base of growth. In the lineage capsule-deficient, MM demonstrated fungal structures with weakly reaction for capsule; in the lineage capsular, the yeasts exhibit great polyssacharides capsule, with star aspect, stained in magenta color. In both lineage, the FM evidence fungal structures contend melanin in the cellular wall. In the lineage capsule-deficient, the FM/MM present fungal elements stains only for the technique of Fontana-Masson evidencing the melanin in the fungal cellular wall, in these histologic sections did not have concurrence with Mucicarmine. In the lineage capsular, the yeasts presents great polyssacharides capsule stains in magenta color for the technique of Mucicarmine with simultaneous evidence of melanin in the fungal cellular wall for the technique of Fontan- Masson. Conclusions: Cryptococosis shows reactivity in some histochemical methods, including the colorations special of Fontana-Masson and Mucicarmine. Combinations of colorations are used in the identification of the Cryptococcus. The agreed tecnhiques allowed the identification of a bigger number of fungal agents of that the individual tecniques.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-18Bitstream added on 2014-06-13T19:55:47Z : No. of bitstreams: 1 leite_fs_me_arafcf_prot.pdf: 3559143 bytes, checksum: 740bd3686104fc290587dc0a0352e995 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A criptococose tem emergido como importante infecção oportunista em pacientes imunossuprimidos e imunocompetentes causando principalmente a neurocriptococose. Cryptococcus neoformans, um dos agentes, é uma levedura capsulada comumente encontrada em infecções do sistema nervoso central em pacientes HIV positivos. No mercado há fármacos para o tratamento dessas infecções, porém problemas são verificados quanto ao espectro de ação, custos e efeitos adversos. As plantas são usadas na medicina por longa data constituindo-se de uma ótima alternativa para busca de substâncias que podem ser utilizadas na formulação de novos antifúngicos. Neste estudo foram avaliados vários extratos, frações e substâncias puras do projeto BIOTA frente à cepa ATCC de C. neoformans, bem como em isolados clínicos com perfil de sensível e resistente frente ao fluconazol. Também foi feita a padronização e aplicação da metodologia do “tabuleiro de xadrez” para verificação de atividade sinérgica, aditiva, indiferente e antagônica entre as frações de plantas de interesse, bem como a molécula pedalitina associada com outras substâncias de origem vegetal e com as drogas sintéticas fluconazol e anfotericina B. Os que apresentaram melhores concentrações inibitórias mínimas... / Cryptococcosis is a disease that has emerged as an important opportunistic infection in immunocompromised and immunocompetent patients mainly causing cryptococcal meningitis. Cryptococcus neoformans, one of the agents, is encapsulated yeast most commonly found in central nervous system infections in HIV patients. There are drugs on the marketplace for the treatment of these infections, but problems are related to spectrum of action, costs and adverse effects. Plants are used in medicine for a long time and they are a great alternative to look for substances that can be used to develop new antifungal agents. In this study we evaluated several extracts, fractions and pure substances from BIOTA project against the ATCC strain of C. neoformans, as well as clinical isolates with sensible and resistant profile to fluconazole. The standardization and application of the methodology of the chessboard technique was developed to verify synergistic, additive, indifferent and antagonistic activities among the fractions of the selected plants, and the molecule pedalitin associated with other natural compounds and the synthetic drugs fluconazole and amphotericin B. The substances that presented the best minimum inhibitory concentrations were selected to verify the fungi protein profile before and after contact with the plant substance and adhesion profile to cells (pneumocytes) A549. Among the plants studied, Pterogyne nitens, specie that belongs to the family Fabaceae, which has the active substance called pedalitin, presented a significant antifungal activity against the isolates of C. neoformans including resistant. Suspensions of C. neoformans with and without treatment with fluconazole and in contact with pedalitin were analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis. These treatments revealed changes in the expression... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: A criptococose tem emergido como importante infecção oportunista em pacientes imunossuprimidos e imunocompetentes causando principalmente a neurocriptococose. Cryptococcus neoformans, um dos agentes, é uma levedura capsulada comumente encontrada em infecções do sistema nervoso central em pacientes HIV positivos. No mercado há fármacos para o tratamento dessas infecções, porém problemas são verificados quanto ao espectro de ação, custos e efeitos adversos. As plantas são usadas na medicina por longa data constituindo-se de uma ótima alternativa para busca de substâncias que podem ser utilizadas na formulação de novos antifúngicos. Neste estudo foram avaliados vários extratos, frações e substâncias puras do projeto BIOTA frente à cepa ATCC de C. neoformans, bem como em isolados clínicos com perfil de sensível e resistente frente ao fluconazol. Também foi feita a padronização e aplicação da metodologia do "tabuleiro de xadrez" para verificação de atividade sinérgica, aditiva, indiferente e antagônica entre as frações de plantas de interesse, bem como a molécula pedalitina associada com outras substâncias de origem vegetal e com as drogas sintéticas fluconazol e anfotericina B. Os que apresentaram melhores concentrações inibitórias mínimas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cryptococcosis is a disease that has emerged as an important opportunistic infection in immunocompromised and immunocompetent patients mainly causing cryptococcal meningitis. Cryptococcus neoformans, one of the agents, is encapsulated yeast most commonly found in central nervous system infections in HIV patients. There are drugs on the marketplace for the treatment of these infections, but problems are related to spectrum of action, costs and adverse effects. Plants are used in medicine for a long time and they are a great alternative to look for substances that can be used to develop new antifungal agents. In this study we evaluated several extracts, fractions and pure substances from BIOTA project against the ATCC strain of C. neoformans, as well as clinical isolates with sensible and resistant profile to fluconazole. The standardization and application of the methodology of the chessboard technique was developed to verify synergistic, additive, indifferent and antagonistic activities among the fractions of the selected plants, and the molecule pedalitin associated with other natural compounds and the synthetic drugs fluconazole and amphotericin B. The substances that presented the best minimum inhibitory concentrations were selected to verify the fungi protein profile before and after contact with the plant substance and adhesion profile to cells (pneumocytes) A549. Among the plants studied, Pterogyne nitens, specie that belongs to the family Fabaceae, which has the active substance called pedalitin, presented a significant antifungal activity against the isolates of C. neoformans including resistant. Suspensions of C. neoformans with and without treatment with fluconazole and in contact with pedalitin were analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis. These treatments revealed changes in the expression... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Coorientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Maristela Pereira / Banca: Maysa Furlan / Mestre

Orientador: Angélica Zaninelli Schreiber / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T21:59:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReichertLima_Franqueline_M.pdf: 2034183 bytes, checksum: 203b846210e23f42a824280eb3cadda2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O gênero Cryptococcus engloba duas espécies consideradas patogênicas: C.neoformans e C.gattii. Apesar dos avanços na área médica, a criptococose permanece uma das infecções fúngicas sistêmicas mais importantes no Brasil. Anfotericina B (AMB) associada a flucitosina (5FC) é a terapia de indução indicada porém, no Brasil, 5FC não está disponível e o tratamento segue somente com AMB ou em associação com fluconazol (FCL). Este trabalho avaliou a ocorrência de espécies e os genótipos de isolados clínicos de pacientes atendidos no Hospital de Clínicas da UNICAMP em um período de 5 anos; isolados ambientais coletados na cidade de Campinas-SP e o perfil de suscetibilidade aos antifúngicos sozinhos contra isolados clínicos e ambientais e o efeito de combinações de antifúngicos frente a isolados clínicos de Cryptococcus spp.. A identificação de espécies e genótipos foi realizada por testes bioquímicos, Restriction Fragment Length Polymorphism do gene URA5 (URA5-RFLP) e sequenciamento da região Internal Transcribed Spacer (ITS) do DNA ribossomal. Testes de suscetibilidade para AMB, 5FC, FCL, voriconazol (VRC), itraconazol (ITC) e terbinafina (TRB) isolados foram realizados conforme CLSI M27-A3 (2008). Os testes com antifúngicos combinados (AMB+5FC; AMB+FCL; AMB+TRB; FCL+TRB), foram realizados pelo método do "tabuleiro de xadrez" para determinação do Coeficiente de Inibição Fracional (CIF) para avaliar o tipo de interação entre as substâncias (sinergismo, indiferença ou antagonismo). Dentre 75 isolados clínicos reativados, foram identificados 66 C.neoformans e 9 C.gattii. Todos C.gattii pertenceram ao genótipo VGII enquanto que 62 isolados de C.neoformans ao genótipo VNI e apenas 4 ao genótipo VNII. Foram obtidos 92 isolados ambientais de Cryptococcus, pertencentes às espécies C.neoformans (genótipo VNI), C.laurentii, C.albidus, C.flavescens e Cryptococcus spp.. Os valores dos intervalos de CIM para C.neoformans clínicos foram AMB: ? 0,125-1 µg/mL; 5FC: ? 0,125-2 µg/mL; FCL: 0,25-8 µg/mL; VRC: ? 0,015-0,125 µg/mL; ITC: 0,03-0,25 µg/mL e TRB: 0,125-2 µg/mL. Intervalos de CIM para C.gattii variaram de 0,25-1 µg/mL para AMB; 0,5-4 µg/mL para 5FC; 2-16 µg/mL para FCL; 0,06-0,25µg/mL para VRC; 0,06-0,5 µg/mL para ITC e 0,5-4 µg/mL para TRB. Foram observados elevados valores de CIM para os antifúngicos 5FC e FCL frente aos isolados ambientais de C.albidus e C.laurentii. O genótipo VNI de C.neoformans clínico mostrou 75,80% de interação sinérgica para AMB+5FC; 79,03% para AMB+FCL; 77,42% para AMB+TRB e 95,16% para FCL+TRB. O genótipo VNII apresentou 100% de sinergismo em todas as combinações. C.gattii (VGII) apresentou 88,9% de sinergismo nas combinações AMB+5FC e AMB+FCL; 100% para AMB+TRB e FCL+TRB. Não foi observado efeito antagônico nas combinações de antifúngicos. Foi observado bom desempenho nas combinações realizadas, especialmente naquelas envolvendo a TRB para ambas as espécies C.neoformans e C.gattii. O genótipo VNI foi o predominante entre os genótipos que afetam os pacientes com criptococose na região de Campinas. Em infecções de difícil tratamento ou que não respondem aos antifúngicos convencionais, a combinação de diferentes antifúngicos como AMB+TRB ou FCL+TRB podem vir a ser uma alternativa em países onde 5FC não está disponível, como no Brasil. Mais estudos são necessários para avaliar o papel dos genótipos na sensibilidade aos antifúngicos, assim como estudos de combinações de antifúngicos in vitro e in vivo para que novas estratégias possam ser empregadas no tratamento da criptococose / Abstract: Cryptococcus genus comprises two species considered pathogenic: C.neoformans and C.gattii. Despite advances in the medical field, cryptococcosis remains one of the most important systemic fungal infections in Brazil. Amphotericin B (AMB) associated with flucytosine (5FC) induction therapy is indicated but, in Brazil, 5FC is not available and treatment follows only with AMB or in combination with fluconazole (FCL). This study evaluated the prevalence of species and molecular subtypes of clinical isolates from patients treated at the Hospital of UNICAMP in a period of 5 years; environmental isolates collected in Campinas ¿ SP and in vitro antifungal susceptibility profile of antifungal agents alone against clinical and enviromental isolates of Cryptococcus spp. and the effect of combinations of antifungal agents against clinical isolates of Cryptococcus spp.. The species identification and subtyping was performed by biochemical tests, Restriction Fragment Length Polymorphism of URA5 gene (RFLP - URA5) and sequencing of the Internal Transcribed Spacer region (ITS) of ribosomal DNA. Susceptibility tests for AMB, 5FC, FCL, voriconazole (VRC), itraconazole (ITC) and terbinafine (TRB) isolated were performed according to CLSI M27-A3 (2008). Combined antifungals tests (AMB +5FC; AMB+FCL; AMB +TRB, FCL+TRB), were performed by the "Checkerboard" method to determine the Fractional Inhibitory Coefficient index (FIC) to assess the type of interaction between substances (synergism, indifference or antagonism). Among the 75 viable clinical isolates, 66 were identified as C.neoformans and 9 as C.gattii. All C.gattii belonged to subtype VGII while 62 isolates belonged C.neoformans VNI genotype and only 4 VNII. 92 environmental isolates of Cryptococcus were obtained. The species C.neoformans (subtype VNI) C.laurentii, C.albidus, C.flavescens and Cryptococcus spp.were identified. The MIC range values of clinical C.neoformans for AMB were: ? 0.125 -1 µg/mL; 5FC: ? 0.125 to 2 µg/mL; FCL: 0.25-8 µg/mL; VRC: ? 0.015 to 0.125 µg/mL; ITC: 0.03 to 0.25 µg/mL and TRB: 0.125 to 2 µg/mL. MIC for C.gattii ranged from 0.25-1 µg/mL for AMB; 0.5-4 µg/mL for 5FC; 2-16 µg/mL for FCL; 0.06 to 0.25 µg/mL for VRC; 0.06 to 0.5 µg/mL for ITC and 0.5-4 µg/mL for TRB. High MIC values were observed for FCL and 5FC against environmental isolates of C.albidus and C.laurentii. The VNI C.neoformans genotype showed 75.80 % of synergistic interaction for AMB+5FC; 79.03 % for AMB + FCL; 77.42 % for AMB + TRB and 95.16 % for FCL+TRB. The VNII genotype showed 100% synergism in all combinations. C.gattii (VGII) showed 88.9 % of synergism in combinations AMB+5 FC and AMB+FCL; 100 % for AMB+TRB and TRB+FCL. No antagonistic effect was observed in all evaluated antifungal combinations. Good performance was observed in all combinations performed, especially those involving TRB for both C.neoformans and C.gattii species. The VNI was the predominant genotype among genotypes affecting patients with cryptococcosis in Campinas region. In difficult to treat infections or unresponsive to conventional antifungal agents, the combination of different antifungals so as AMB+FCL or TRB+TRB may become an alternative in countries where 5FC is not available, as in Brazil. More studies are needed to evaluate the role of genotypes in sensitivity to antifungal agents, as well as antifungal agents combination studies in vitro and in vivo so that new strategies can be employed in the treatment of cryptococcosis / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

A maioria dos tratamentos antifúngicos são longos e não eficazes, portanto, há uma necessidade de pesquisa de novas alternativas. A fim de prospectar novos epitopos para uma vacina para Paracoccidioides lutzii e Cryptococcus spp.. Foi desenvolvido um sistema com o objetivo de purificar epitopos de macrófagos no contexto de MHCII. Além disso, houve pesquisa de epítopos na parede celular e sobrenadante de Paracoccidioides spp. A atividade antifúngica da miltefosina foi avaliada contra Paracoccicioides spp.. A miltefosina demonstrou atividade inibitória similar à anfotericina B. A atividade fungicida ocorreu em baixas concentrações, se observou alterações ultraestruturais e formação de melanina. A atividade do C7a in vitro e in vivo contra Candida spp. foi analisada. Os resultados mostraram atividade fungicida em valores baixos. Além disso, foi visto inibição da formação de hifas / pseudohifas e alterações morfológicas. Os ensaios in vivo demonstraram uma diminuição significativa na infecção em um modelo de candidíase vaginal e sistêmica. / Most of antifungal treatments are not completely effective or long, thus there is a need to search new alternatives. In order to prospect new epitopes for a vaccine to Paracoccidioides lutzii and Cryptococcus spp.. A system was developed with the purpose of purify epitopes from macrophages in the context of MHCII. Also, a search for epitopes in the cell wall and supernatant of Paracoccidioides spp. was done. The antifungal activity of miltefosina was evaluated against Paracoccicioides spp.. Miltefosine demonstrated inhibitory activity similar to amphotericin B. Fungicidal activity occurred at low concentrations, ultrastructural alterations and melanin production were observed. The activity of C7a in vitro and in vivo against Candida spp. was analyzed. The results showed fungicidal activity at low values. Also, it was revealed that inhibition of formation of hyphae/pseudohyphae and morphological alterations. In vivo assays demonstrated a significant decrease of fungal border of intravaginal and intravenous infected mice.