Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-20T15:04:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Luiza Lima_Tese de Doutorado_2015.pdf: 5654099 bytes, checksum: da2a7cb303b6562f1bc8af5fc0c76f13 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-20T15:04:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Luiza Lima_Tese de Doutorado_2015.pdf: 5654099 bytes, checksum: da2a7cb303b6562f1bc8af5fc0c76f13 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / CAPEs / Com o objetivo de criar um modelo biológico reprodutível e eficiente que possa mimetizar a interação proteína-carboidrato, nós reportamos o uso do ensaio quimiluminescente com lectinas conjugadas a éster de acridina (EA) para investigar a complexação da lectina ao carboidrato e para avaliação quantitativa da expressão de carboidratos em tumores cutâneos. Polissacarídeos de N-acetil-D-glicosamina (quitosana), glicose (phytagel) e galactose (carragenana) foram utilizados para sintetizar membranas (0,0314 – 0,6358 cm2). Concanavalina A-EA (Con A), Wheat germ aglutinina (WGA), Peanut aglutinina (PNA), Ulex europeaus aglutinina-I (UEA-I) e Maackia amurensis aglutinina (MAA) foram conjugadas a EA. A atividade hemaglutinante das lectinas-EA foi avaliada e a quimiluminescência quantificada e expressa em Unidades Relativas de Luz (URL). Biópsias de pele normal e de tumores cutâneos, tais como ceratose actínica (AK), ceratoacantoma (KA), carcinoma espinocelular (CEC) e basocelular (CBC), e as membranas foram incubadas com o conjugado lectina-EA (100 μL 100 μg mL-1) por 2h a 4°C. A emissão de fótons foi quantificada e correlacionada com a marcação de tecidos normais, transformados e das membranas. Inibições com carboidratos específicos foram realizadas. AK, KA , CBC e CEC apresentaram menor expressão de α -D- glucose/manose e resíduos de α-L-fucose, em comparação com o tecido normal. Os tumores cutâneos apresentaram maior expressão resíduos de β Gal-(1-3)-GalNAc que o tecido normal . AK e SCC exibiram maior expressão de resíduos Neu5Ac-α(2,3)Gal que a epiderme normal. KA e BCC apresentaram valores de URL equivalentes, em comparação com o tecido normal. Os valores de URL diminuíram quando as lectinas foram incubadas com seus carboidratos específicos. Os valores das constantes e os sítios de ligação foram calculados para cada lectina utilizando a equação obtida a partir das curvas hiperbólicas, 2,4 x 10-7 M-1 ± 0,8 x 10-7 M-1and 1,3 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,3 x 10-3 mol . mg-1 (Con A); 0,9 x 10-6 M-1  0,4 x 10-6 M-1 and 0,021 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,003 x 10-3 mol . mg-1 (WGA) and 2,0 x 10-6 M-1  0,9 x 10-6 M-1 and 0,069 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,010 x 10-3 mol . mg-1 (PNA). O método quimiluminescente permitiu a avaliação quantitativa direta da expressão de carboidratos em neoplasias de pele e a investigação a complexação da lectina ao carboidrato através do modelo de Langmuir, combinando a especificidade desta interação e a sensibilidade dos ensaios quimiluminescentes. / Aiming to create a reproducible and efficient biological model that mimic the protein-carbohydrate interaction, we report the use of chemiluminescent assay with lectins labeled to acridinium ester (AE) to investigate the complexation of lectin to carbohydrate and for the quantitative evaluation of carbohydrates expression in cutaneous tumors. Polysaccharides made N-acetyl-D-glucosamine (chitosan), glucose (phytagel) and galactose (carrageenan) were used to synthetize membranes (0,0314 – 0,6358 cm2). Concanavalin A-AE (Con A), Wheat germ agglutinin (WGA), Peanut agglutinin (PNA), Ulex europeaus agglutinin-I (UEA-I) e Maackia amurensis agglutinin (MAA) were labeled to AE. The hemmagglutinating activity of lectins-AE was evaluated and the chemiluminescence was quantified and expressed in Relative Light Unit (RLU). Biopsies of normal skin and cutaneous tumors such as, actinic keratosis (AK), keratoacantoma (KA), squamous cell carcinoma (SCC) and basal cell carcinoma (BCC), and membranes were incubated with lectins-AE (100 μL 100 μg mL-1) for 2h at 4°C. Photon emission was measured and correlated to the labeling of the normal, transformed tissues and membranes. Inhibitions with specific carbohydrate were carried out. AK, KA, SCC and BCC showed lower expression of -D-glucose/mannose and -L-fucose residues compared to normal tissue. Cutaneous tumors displayed higher expression of Gal-(1-3)-GalNAc residues than normal tissue. AK and SCC exhibited higher expression ofNeu5Ac-(2,3)Gal residues than normal epidermis. KA and BCC showed equivalent RLU values compared to normal tissue. The RLU values decreased when the lectins were incubated with their specific carbohydrate. The constant values and maximum binding sites on the membranes were calculated for each lectin using the equation obtained from hyperbolic curves, 2.4 x 10-7 M-1 ± 0.8 x 10-7 M-1and 1.3 x 10-3 mol . mg-1 ± 0.3 x 10-3 mol . mg-1 (Con A); 0.9 x 10-6 M-1  0.4 x 10-6 M-1 and 0.021 x 10-3 mol . mg-1 ± 0.003 x 10-3 mol . mg-1 (WGA) and 2.0 x 10-6 M-1  0.9 x 10-6 M-1 and 0.069 x 10-3 mol . mg-1 ± 0.010 x 10-3 mol . mg-1 (PNA). The chemiluminescence method allowed quantitative assessment of the carbohydrate expression in cutaneous tissues and was an analytical technique efficient to investigate the complexation of lectin to carbohydrate through Langmuir model, combining the specifity this interaction and sensibility of chemiluminescent assays.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-04T19:50:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-SteffanyFerreira.pdf: 961397 bytes, checksum: 6fda526203d2fb7ff12a32289be35454 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T19:50:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Dissertação-SteffanyFerreira.pdf: 961397 bytes, checksum: 6fda526203d2fb7ff12a32289be35454 (MD5) Previous issue date: 2012 / O câncer de pele ou tumor cutâneo não-melanoma (TCNM), é a neoplasia maligna de maior incidência no Brasil. Os cânceres, em geral, apresentam padrão de glicosilação aberrante na estrutura de oligossacarídeos de superfície celular (fenótipo), determinada pela ação conjunta de glicosiltransferases (genótipo). O presente estudo objetiva avaliar o perfil glicofenotípico de glicoconjugados de superfície celular de TCNM e correlacionar com o padrão de expressão de sialiltransferases. Cortes (4µm) de biópsias de Carcinoma Basocelular (CBC), Carcinoma Espinocelular (CEC), Ceratose Actínica (CA) e Ceratoacantoma (KA) foram ensaiados com as lectinas SNA, Sambucus nigra agglutinin, (específica para ácidos siálicos ligados na posição α-2,6) e MAA, Maakia amurensis agglutinin (específica para ácidos siálicos na posição α-2,3). A inibição da ligação lectina-carboidrato foi realizada com o ácido siálico (300mM). As amostras também foram avaliadas com anticorpos monoclonais anti-ST3Gal I (específico para β-galactosideo α2,3 sialiltransferase) e antiST6Gal I (específico para β-galactosideo α2,6 sialiltransferase). Semelhanças no padrão de sialilação entre CEC, CA e KA foram encontradas na histoquímica com lectinas e, principalmente na imunohistoquímica. O CBC não apresentou marcação na maioria dos casos para ambas as técnicas, indicando que este tipo tumoral apresenta um padrão molecular próprio podendo estar associado ao seu comportamento biológico (baixo potencial invasivo e metastático). Os resultados indicam a importância da sialilação no desenvolvimento e manutenção de tumores cutâneos, sendo a histoquímica com lectinas e a imunohistoquímica ferramentas úteis na determinação deste tipo de glicosilação na superfície de células tumorais. / Skin cancer or Non-melanoma Cutaneous Tumors (NMCT) is the most incidente malign neoplasia in Brazil. Cancers, in general, present a aberrant glycosilation pattern in oligossacharides of cell surfasse glycoconjugates (phenotype) which it is determined by tha action of glycosiltransferases (genotype). The present study aims to evaluate the glycophenotype of glycoconjugates in the cell surface of NMCT and to correlates to the expression of sialyltransferases. Biopsies slices (4µm) of basal cell carcinoma (BCC), squamous cell carcinoma (SCC), actinic keratosis (AK) and Keratoacanthoma (KA) were assayed with SNA, Sambucus nigra agglutinin, (specific to α2,6- linked sialyc acid) and MAA, Maakia amurensis agglutinin (specific to α2,3- linked sialic acid). Samples were also evaluated with monoclonal antibodies anti-ST3Gal I (specific to Sialyltransferase β-galactoside α2,3-linked) and antiST6Gal I (specific to Sialyltransferase β-galactoside α2,6-linked). Sialylation patterns were similar to SCC, AK and KA in both lectin histochemistry and immunohistochemistry but mainly in the later one. BCC was not positive in most of the cases for both methods which indicates that this tumour has a particular molecular pattern that can be associated to its biological behavior (low invasive and metastatic potential). Results indicate the importance of silaylation in the development and maintenance of cutaneous tumors being the lectin histochemistry associated to the immunohistochemistry a useful auxiliary tool for the determination of this type of glycosilation in skin tumors.